Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB6 từ cây đậu tương phục vụ thiết kế vector chuyển gen thực vật

Ở một số vùng ở nước ta như các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên, hạn đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm suy giảm rõ rệt khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng,

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––

NGUYỄN VIỆT NGA

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB6

TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ THIẾT KẾ

VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––

NGUYỄN VIỆT NGA

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB6

TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT

Ngành: DI TRUYỀN HỌC

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán

bộ hướng dẫn cùng nhóm nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu trong luận văn này

Tác giả luận văn

Nguyễn Việt Nga

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của PGS.TS Lê Văn Sơn và nhóm nghiên cứu, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành thí nghiệm phân lập gen Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Luận văn được sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo “Nghiên cứu bước đầu tạo dòng cây đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả năng chịu hạn cao”, mã số B2017-TNA-38

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này

Tác giả luận văn

Nguyễn Việt Nga

MỤC LỤC

Trang

TRANG BÌA PHỤ

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN……… ii

MỤC LỤC……… iii

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT……… iv

DANH MỤC BẢNG……… v

DANH MỤC HÌNH……… vi

MỞ ĐẦU ……… 1

1.Đặt vấn đề ……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu ……… 2

3 Nội dung nghiên cứu……… 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ……… 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… ……… 4

1.1.Cây đậu tương ………… ……… 4

1.1.1 Cây đậu tương……… ……… 4

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam……… 8

1.2 Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương……… 9

1.2.1 Cơ chế chịu hạn của cây đậu tương………… ……… 9

1.2.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương……… 11

1.3 Phân họ gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB……… ………… 12

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu và địa điểm nghiên cứu……… 16

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu……… 16

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu……… 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 18

2.2.1 Nghiên cứu thông tin về gen và thiết kế cặp mồi nhân gen……… 19

2.2.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số……… 20

2.2.3 Phương pháp tạo cDNA……… 21

2.2.4 Phương pháp PCR……… 21

2.2.5 Tách dòng gen GmDREB6……… 22

2.2.6 Phương pháp xác định trình tự nucleotide và xử lý kết quả……… 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 25

3.1 Thiết kế cặp mồi PCR và nhân bản gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008……….……….……….……… 25

3.1.1 Thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R……….……… 25

3.1.2 Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA………… 26

3.1.3 Kết quả nhân bản gen GmDREB6……… 27

3.2 Tách dòng và giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008……… 28

3.2.1 Kết quả tách dòng gen DREB6……… 28

3.2.2 Kết quả giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008……… 29

3.3 Đặc điểm của trình tự gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu

tương DT2008……… 31

3.3.1 So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 với trình tự EF551166 và NM_001248412 trên GenBank……… 31

3.3.2 So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 của giống DT2008 với trinh tự amino acid suy diễn của EF551166 và NM_001248412 trên GenBank………. 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 40

1 Kết luận……… 40

2 Đề nghị……… 40

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN……… 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 42

E.coli Escherichia coli

GmDREB6 Glycine max Dehydration responsive element

binding protein 6

HSP Heat Shock Protein

LEA Late Embryogenesis Abundant

LTP Lipid Transfer Protein

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleotide acid

TAE Tris – Acetate - EDTA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của cặp mồi……… 19

Bảng 2.2 Các bước tiến hành tách RNA tổng số……… 20

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tạo cDNA……… 21

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR……… 22

Bảng 2.5 Bảng chu kỳ nhiệt phản ứng nhân gen DREB6………… 22

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB6 vào vector tách dòng……… 23

Bảng 2.7 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.coli……….……… 24

Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống cây đậu tương DT2008 và trình tự mang mã số EF551166 và NM_001248412…….……… 33

Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 và suy diễn từ trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412….…… 38

Hình 2.1 Hạt của giống đậu tương DT2008……… 16

Hình 2.2 Vector pBT sử dụng trong tách dòng phân tử gen

GmDREB6 từ cây đậu tương……… ……… 17

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt quá trình thực hiện phân lập gen

GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008……… 18

Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R………… 25

Hình 3.2 Kết quả tách chiết RNA tổng số từ lá non của giống đậu tương DT2008……… 26 Hình 3.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen

GmDREB6 (cDNA) từ mRNA của giống đậu tương

DT2008……… 27 Hình 3.4 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân

bản gen GmDREB6 từ 5 dòng khuẩn lạc màu trắng……… 28 Hình 3.5 Kết quả phân tích BLAST gen GmDREB6 phân lập từ

giống đậu tương DT2008……… 29

Hình 3.6 Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của

gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008……… 30

Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân

lập từ giống đậu tương DT2008 và trình tự gen GmDREB6 mang

mã số EF551166, NM_001248412.2 trên Genbank……… 32

Hình 3.8 Trình tự acid amin suy diễn của gen GmDREB6 phân

lập từ giống đậu tương DT2008 và trình tự gen GmDREB6 mang

mã số EF551166, NM_001248412.2 trên GenBank……… 36

Hình 3.9 So sánh trình tự acid amin suy diễn của gen GmDREB6

phân lập từ giống đậu tương DT2008 và trình tự gen GmDREB6

mang mã số EF551166, NM_001248412.2 trên GenBank……… 37

Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid của vùng AP2 trong

protein suy diễn từ gen GmDREB6 của giống đậu tương DT2008

và EF551166, NM_001248412.2 trên GenBank……… 39

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây

thực phẩm dễ trồng và có hiệu quả kinh tế cao Hạt đậu tương giàu dinh dưỡng, hàm lượng protein trong hạt đạt từ 30%-52%, hàm lượng lipid từ 12%-25%, có nhiều loại vitamin, khoáng và đặc biệt trong hạt chứa nhiều amino acid thiết yếu cho người và động vật Hạt đậu tương vừa là một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị, vừa là nguồn thức ăn cho người và vật nuôi Cây đậu tương không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng mà còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác do rễ đậu tương có khả năng cố định đạm Chính vì vậy đậu tương được nhiều quốc gia trên thế giới và Việt Nam ưu tiến phát triển

Trong những năm gần đây do biến đổi khí hậu mà hạn hán đã xảy ra ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam Ở một số vùng ở nước ta như các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên, hạn đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm suy giảm rõ rệt khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng, trong đó có đậu tương Đậu tương được xem là loại cây trồng rất mẫn cảm với tác động của hạn và hạn là yếu tố phi sinh học nghiêm trọng nhất

có thể làm giảm năng suất đậu tương tới 40% Câu hỏi đặt ra là, có thể cải thiện được khả năng chịu hạn của cây đậu tương hay không? Và nếu có thì ứng dụng công nghệ nào để tăng cường khả năng kháng hạn của loài cây họ đậu này? Cho đến nay các nghiên cứu đã khẳng định rằng, có thể nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng kỹ thuật chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học hiện đại Một số phương pháp tiếp cận giải quyết vấn đề này được quan tâm là ứng dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể hoặc lai hữu tính tạo tổ hợp lai đậu tương có khả năng chịu hạn cao và ứng dụng công nghệ gen trong tạo

cây đậu tương chuyển gen có khả năng chịu đựng và chống lại các tác nhân phi sinh học ở ngoại cảnh, trong đó có hạn hán

Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen và đến nay, người ta vẫn chưa xác định được một gen cụ thể quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ biết được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương Các gen liên quan đến tính chịu hạn bao gồm hai nhóm, nhóm gen mà sản phẩm của chúng liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn và nhóm gen

mã hóa sản phẩm có chức năng điều hòa các gen có sản phẩm trực tiếp tác động đến khả năng chịu hạn của đậu tương

Để chống lại tác động bất lợi của hạn hán, cây đậu tương đã tổng hợp nhiều loại protein, trong đó có các loại protein là nhân tố phiên mã kích hoạt

hoạt động phiên mã của các gen chức năng Protein DREB (Dehydration

Responsive Element Binding) là một phân họ thuộc họ nhân tố phiên mã

AP2/ERF, có chức năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với

hạn, tạo ra tính chống chịu các stress hạn từ ngoại cảnh Tăng cường hoạt động

biểu hiện gen DREB sẽ kích hoạt mạnh sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn, do vậy việc lựa chọn kỹ thuật biểu hiện mạnh gen DREB sẽ là giải pháp công nghệ

nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương mà khâu đầu tiên là tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen và những thông tin của gen chuyển được lựa chọn Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã chọn và thực hiện đề tài:

“Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB6 từ cây đậu tương phục vụ thiết kế vector chuyển gen thực vật”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích được đặc điểm trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy

diễn của gen GmDREB6 (cDNA) phân lập từ cây đậu tương

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu thông tin về trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB6 từ cây đậu tương, thiết kế cặp mồi PCR và khuếch đại gen GmDREB6

3.2 Tách dòng phân tử và xác định trình tự gen GmDREB6

3.3 Phân tích đặc điểm của trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn

của gen GmDREB6 phân lập từ cây đậu tương

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Về mặt khoa học, kết quả nghiên cứu góp phân làm rõ đặc điểm về trình

tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ cây đậu tương Bổ sung dẫn liệu về gen GmDREB6 của giống đậu tương DT2008 trong phân họ gen DREB của câu đậu tương

Về mặt thực tiễn, trình tự cDNA của gen GmDREB6 làm nguyên liệu

cho thiết kế vector chuyển gen phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây đậu tương

1.1.1 Cây đậu tương

Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, thuộc chi Glycine, họ Đậu (Fabaceae), có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 40 Đậu tương là loại

cây trồng thu hạt, loại cây bụi nhỏ có lông toàn thân, cây đậu tương gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt Cây đậu tương có bộ rễ phát triển là loại rễ cọc gồm rễ chính và các rễ phụ Rễ chính có thể ăn sâu 30 – 50cm và có thể trên 1m Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, tập trung nhiều ở tầng đất 7 – 8cm rộng 30 – 40cm2 Trên rễ của đậu tương có nhiều nốt sần chứa

vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm, một nốt sần có

khoảng 3 – 4 tỷ vi sinh vật mà ta chỉ có thể nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại 600 – 1000 lần [1]

Đậu tương là cây hai lá mầm thân thảo, ít phân cành, dạng bụi Cây cao khoảng 0,3 – 1,0m, thân cây mảnh, tròn, thường dài từ 14 – 15 lóng, có nhiều lông tơ có tác dụng giảm thoát hơi nước và chống bệnh Người ta thường phân biệt các giống đậu tương với nhau dựa vào thân cây đậu tương có mật độ lông ở thân nhiều hay ít, dài hay ngắn Thân non có thể có màu xanh hoặc màu tím, màu sắc thân non có tương quan chặt chẽ tới màu sắc của hoa, thân xanh hoa trắng, thân tím hoa tím Thân có nhiều dạng như đứng, bò, nửa bò và leo Đường kính thân thay đổi tùy theo giống và có liên quan tới tính chống đổ của cây Số cành trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác Có giống chỉ có 1 – 2 cành hoặc thậm chí không có cành Cành hướng lên phía trên, lá mọc cách từ các đốt trên thân Có 3 loại lá chính ở cây đậu tương chính là: lá mầm, lá nguyên và lá kép Lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh Lá thường mọc so le,

lá kép thường có 3 lá chét với hình dạng khác nhau tùy loài Những lá nhỏ và dài chịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao nhưng khả năng chịu hạn thường kém [1], [2]

Hoa đậu tương nhỏ, không mùi, thuộc loại cánh bướm Màu sắc của hoa thay đổi tùy theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có

từ 1 – 10 hoa và thường có 3 – 5 hoa Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30% có khi lên 80% Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy Hoa đậu tương thường thụ phấn trước khi hoa nở và là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp, chiếm trung bình 0,5 – 1% [1], [2]

Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có màu trắng hay tím xếp thành chùm ở nách cành, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và thời vụ gieo trồng bởi vì nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ, quả thõng, quả đậu tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay xám đen Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: tròn bầu dục, tròn dài, vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen nhưng chủ yếu là màu vàng rơm nhạt [2]

Đậu tương có nguồn gốc ở phía Bắc và Đông Châu Á, là một trong những cây thực phẩm quan trọng [1] Cây đậu tương là cây trồng ngắn ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ, trồng trong suốt mùa hè và mùa thu trồng cây đậu tương rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp Đối với ngành trồng trọt, đậu tương có khả năng tích luỹ đạm của không khí để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt sần ở bộ rễ và sinh khối thân, cành lá Các chất hữu cơ này góp phần làm thay đổi tính chất lý hoá học và tăng độ phì nhiêu cho đất Trong hệ thống

thâm canh, trồng đậu tương có tác dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống nạn ô nhiễm do lạm dụng phân bón hoá học và thuốc trừ sâu [2], [9]

Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật… [6] Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra trong tế bào Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết Thiếu nước trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng do đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Cây đậu tương là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác và thuộc nhóm cây chịu hạn kém [6] Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây không đồng đều qua các giai đoạn Hạn thường làm giảm 40% năng suất đậu tương và tác động đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, từ nảy mầm, ra hoa, tạo hạt cũng như chất lượng hạt được tạo thành Nói chung hạn hán ảnh hưởng đến mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt với cây đậu tương thì giai đoạn tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này quá trình tổng hợp protein diễn ra mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc này có ý nghĩa lớn quyết định năng suất Ở cây đậu tương, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-

530 kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [5] Nhu cầu nước của đậu tương phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng của cây, tốc độ phát triển của cây trước khi phủ kín đất và lượng nước có sẵn trong đất Khả năng năng chịu hạn của các giống đậu tương là không giống nhau do chúng có các kiểu

gen khác nhau Vì vậy, chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn cao và tìm kiếm biện pháp cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam quan tâm

Về giá trị kinh tế, đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao về nhiều mặt Với ưu thế ngắn ngày, trồng được nhiều vụ trong năm, có thể trồng thuần, trồng xen, luân canh gối vụ, trồng được nhiều vùng sinh thái khác nhau Sản phẩm của nó được dùng làm thức ăn cho con người, thức ăn cho gia súc, làm nguyên liệu cho công nghiệp, có giá trị xuất khẩu và là loại cây có khả năng cải tạo đất trồng rất tốt [1], [2], [3]

Về giá trị dinh dưỡng, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein khoảng từ 30%- 52%, lipid khoảng 12 – 25%, glucid khoảng 10 – 15% Các thực phẩm làm từ đậu tương được xem là một loại “thịt không xương” vì chứa tỷ lệ đạm thực vật dồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật Thậm chí, lượng đạm (protein) trong 100gr đậu tương có thể tương đương với lượng đạm trong 800gr thịt bò [1]

Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lượng đạm tiêu thụ hàng ngày là do đậu tương cung cấp Hàm lượng chất đạm chứa trong đậu tương cao hơn nhiều so với lượng chất đạm chứa trong các loại đậu khác

Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1, B2, ngoài ra còn có các loại vitamin khác như A, D, E, C… Bên cạnh đó nó còn chứa các loại muối khoáng như Canxi, sắt, photpho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa Trong đậu tương có đủ các acid amine cơ bản như isoleucin, leucin, lysin, valin, methionine, phenylalanine, tryptophan Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chưa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể [1]

Bên cạnh vai trò là một loại cây thực phẩm, đậu tương còn là vị thuốc để

dày và ruột Đậu tương được nhiều nhà khoa học xem như là chìa khóa để giải quyết nạn thiếu protein trong dinh dưỡng của con người, là thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, suy nhược thần kinh và suy nhược dinh dưỡng [1]

Về giá trị trong công nghiệp của cây đậu tương, hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Dầu đậu tương có chỉ số iot cao, nhiệt độ ngưng tụ từ -150C đến -180C Đậu tương còn là nguyên liệu quan trọng cho các ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo,… [1]

Về giá trị trong nông nghiệp của cây đậu tương, đậu tương được sử dụng làm thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân, lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Ngoài ra đậu tương còn

có vai trò trong cải tạo đất trồng đem lại hàm lượng đạm cao cung cấp cho cây trồng 1 ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30 – 60kg N Nhờ khả năng cố định đạm nên sau mỗi vụ thu hoạch thành phần hóa tính của đất trồng được cải thiện rõ rệt, lượng đạm trong đất tăng và khu hệ vi sinh vật trong đất cũng tăng Vì vậy, việc luân canh trồng cây đậu tương với các loại cây trồng khác có thể được xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu [1], [3]

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

Cây đậu tương giữ vai trò quan trọng trong các cây lấy dầu của thế giới,

nó đứng thứ 4 sau ngô, lúa mì, lúa nước Do khả năng thích ứng rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục Mỹ là nước có diện tích năng suất đậu tương đứng hàng đầu thế giới (trên 70%), mặc dù cây đậu tương ở Mỹ mới được

chính phủ Mỹ quan tâm đúng mức từ sau chiến tranh thế giới lần thứ 2 Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế giới Trong đó,

4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc [1], [2]

Ở Việt Nam, có hai loại giống đậu tương đó là giống địa phương và giống nhập nội Đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [2]

Những năm gần đây, cùng với việc nghiên cứu các công nghệ sinh học

và các loại đậu tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu tương địa phương có năng suất thấp nhưng lại có chất lượng hạt cao

và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường, nhất là hạn hán [7]

1.2 Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương

1.2.1 Cơ chế chịu hạn của cây đậu tương

Để thích nghi với điều kiện khô hạn, đậu tương phản ứng thích nghi với những biến đổi của môi trường Hai cơ chế chịu hạn chính được thảo luận nhiều ở thực vật, đó là sự phát triển bộ rễ và sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu [5], [6], [7]

Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật Cơ chế chịu hạn liên quan mật thiết với sự phát triển của bộ rễ Cơ thể thực vật thích ứng với hạn bằng cách phát triển rễ cọc theo chiều dài vươn tới các lớp đất sâu hơn để hút nước dễ dàng hơn, đồng thời hệ thống rễ con phát triển mở

và nước trong lòng đất Kaspar và cs khi đánh giá 105 giống đậu tương trong điều kiện khô hạn đã nhận thấy, cây đậu tương không được tưới nước thì bộ rễ

có chiều dài hơn hẳn cây đậu tương được tưới nước, ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ như trọng lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ con ở các giống chịu hạn Các tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá

và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn [5], [8]

Một trong những đáp ứng về phương diện hóa sinh thường thấy ở thực vật khi cây gặp tình trạng khan hiếm về nước, đó là khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào Áp suất thẩm thấu được định nghĩa là sự tích lũy chủ động các chất trao đổi trong mô, tế bào của thực vật để duy trì sức căng của tế bào và mô khi lượng nước bên ngoài tế bào thụt giảm Áp suất thẩm thấu có thể duy trì cường độ thoát hơi nước của khí khổng và quá trình quang hợp trong các trường hợp thế năng nước thấp, làm chậm quá trình úa của lá, giảm quá trình héo hoa, kích thích rễ phát triển và tăng cường khả năng hút nước từ đất

24 Ngoại trừ duy nhất mà các nhà khoa học tin rằng khả năng duy trì áp suất thẩm thấu giữ vai trò quan trọng, đó là khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của

bộ rễ do ảnh hưởng đến sức căng của rễ sẽ giúp cho việc đâm sâu vào các lớp đất và vì vậy khả năng thu nhận nước sẽ được cải thiện hơn cho cây trong các điều kiện hạn Tính trạng được quan tâm trong việc nâng cao khả năng chống chịu hạn của cây trong điều kiện bất lợi về nước Vấn đề chính gặp phải đối với việc chọn lọc các giống có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu đó là sự giới hạn

về số lượng nguồn gen [6]

Áp suất thẩm thấu có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của đậu tương, áp suất thẩm thấu quá cao cây không lấy được nước đây cũng chính là nguyên nhân gây hạn cho cây Quá trình sinh trưởng và phát triển của đậu tương cần rất nhiều nước, trong cả vụ nhu cầu nước của đậu tương dao động từ 330 – 766 mm nước Nước trong cây không chỉ ảnh hưởng đến các

phản ứng sinh hóa, các biến đổi chất trong tế bào mà còn có ảnh hưởng đến

bộ máy quang hợp do nó là nguồn nguyên liệu và là điều kiện đặc biệt quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các chất hữu cơ cần thiết cho cơ thể thực vật [6], [24]

1.2.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương

Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn hán liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã Vì vậy, sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn hán chịu ảnh hưởng rất nhiều của môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa [7]

Stress hạn làm giảm mạnh năng suất đậu tương và để thích ứng với điều kiện hạn các gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương đã khởi động kháng lại stress hạn Một số lượng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn

đã được xác định Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều gen liên quan đến tính chống chịu của đậu tương còn chưa được nghiên cứu kỹ, vì vậy nghiên cứu chức năng gen liên quan đến stress hạn để cải thiện khả năng chống chịu hạn của cây đậu tương được quan tâm Có hai nhóm gen có liên quan chủ yếu đến tính chịu hạn của cây đậu tương: (1) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới đặc tính chịu hạn; (2) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn [4]

Các gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn bao gồm: LEA, HSP, chaperons, LTP, P5CS, EXP, … các gen điều khiển quá trình phiên mã

của nhóm gen chịu hạn tuy không tác động trực tiếp đến tính chịu hạn của thực vật nhưng chúng lại có vai trò đáng kể trong việc kích thích sự biểu hiện các gen chức năng Các gen điều khiển sự phiên mã mà sản phẩm của chúng có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trình tự DNA điều khiển (nhân tố tác động cis) trên vùng khởi động (promoter) của gen và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi

đầu quá trình phiên mã của các gen chức năng Nhiều gen mã hóa nhân tố

phiên mã điều khiển tính chịu hạn như: DREB, ABRE, NAC, bZIP, ZFHD…[6],

[7], [16], [21]

1.3 Phân họ gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB

Các gen trong tế bào được biểu hiện mạnh hoặc yếu dưới sự điều khiển của các yếu tố phiên mã Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với điều kiện hạn ở thực vật nhưng chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn

ở thực vật [4]

Các gen DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là phân họ

gen tổng hợp protein DREB tìm thấy nhiều trong tế bào sống khi thực vật gặp

các điều kiện bất lợi Các nhà khoa học cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã

tham gia tích cực vào quá trình kích hoạt nhanh hoạt động của các gen tham gia chống lại các điều kiện bất lợi từ ngoại cảnh như hạn, mặn, lạnh [21]

Các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu về DREB từ

những năm 80 của thế kỷ XX, so sánh được trình tự gen của các loài cây trồng

và hoang dại thấy rằng có sự sai khác giữa chúng Từ đó, họ đã đề xuất phương

án cải thiện khả năng chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế chống chịu điều kiện bất lợi trong môi trường sống Những gen này bao gồm cả các gen chức năng, chẳng hạn như mã hóa những chất chuyển hóa khác nhau quan trọng đối với khả năng chịu hạn, hoặc gen mã hóa các nhân tố phiên

mã Đối với cây đậu tương, hướng nghiên cứu này bước đầu đã đạt được những thành công nhất định [21]

Khi nghiên cứu cấu trúc protein họ DREB đã cho thấy rằng chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2, cho phép

chúng tương tác với một loạt các gen liên quan Các miền AP2 khá bảo thủ và

có khoảng 60 amino acid [12], [15], [17]

Họ nhân tố mã AP2 (APETALA2) đã được nghiên cứu kỹ và trong đó

nhân tố phiên mã DREB là một phân họ [20] Một số thành viên của phân họ gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [21] Mỗi gen trong phân họ DREB có trình tự, độ dài

khác nhau nhưng đều được biểu hiện mạnh khi đậu tương gặp các stress hạn

Nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh, trong khi nhóm DREB2 có

vai trò chủ yếu trong điều khiển tính chịu hạn, chịu nóng [21]

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu protein DREB ở cây đậu tương đã thu được kết quả khả quan và đóng góp cho khoa học Liu và cs (2005) đã phân lập

gen DREB3 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước 819 bp, mã hóa cho 272

amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 60 amino acid và được công bố trình tự gen trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số DQ055133 [19] Chen và cs (2007)

đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước

là 927 bp; Cao và cs (2008), phân lập và nhận dạng GmGβ1 liên quan tới protein GmDREB5 trong đậu tương [10] Li và cs đã phân lập ba gen DREB (GmDREBa, GmDREBb và GmDREBc) từ cây đậu tương và cho rằng mỗi phân

tử protein của các gen này chứa một miền AP2 gồm 64 amino acid [18] Thực nghiệm đã chứng minh cả 3 protein này đều liên quan đến sự mất nước và đáp ứng sự mất nước của tế bào Ở nấm men, GmDREBa và GmDREBb có khả năng kích hoạt quá trình phiên mã còn GmDREBc lại không có khả năng này Các protein GmDREBa và GmDREBb trong lá cây đậu tương được tổng hợp bởi tác động của muối, hạn, mặn và lạnh Một số nghiên cứu khác về kết quả

phân lập gen DREB1 [16], gen GmDREB2 [12], gen GmDREB3 [10] và gen GmDREB5 [13] đã được công bố

Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu các gen DREB ở cây trồng nói chung và

cây đậu tương nói riêng vẫn còn rất mới mẻ, chỉ có một vài công trình công bố

về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở cây đậu tương của Chu Hoàng Mậu (2011) [7], tách dòng và biểu hiện gen GmDREB2 trên cây

thuốc lá của Tan và cs (2015)

Trên GenBank, gen GmDREB6 được phân lập từ mRNA của đậu tương mang mã số EF551166 có kích thước 693 bp mã hóa protein DREB6 gồm 230 amino acid [20] Ở đậu tương, gen GmDEB6 có một exon và nằm trên NST số

5 (Hình 1.1) [26]

Hình 1.1 Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu tương [26]

Phần khung đỏ ở hình 1.1 là gen GmDREB6 ở vị trí LOC100101914)

Protein DREB6 chứa vùng AP2 chứa 58 amino acid từ amnio acid thứ 59 đến 117 (Hình 1.2A) Vùng AP2 có các vị trí amino acid số thứ tự 60, 61, 63,

65, 67, 73, 75, 82, 84, 87 là những vị trí bám của protein DREB vào sợi DNA (Hình 1.2B)

A

A

B Hình 1.2 Trình tự amino acid của protein DREB6 trên Genbank mang mã số

ABQ42205 Phần màu ở hình 1.1B là các amino acid thuộc vùng AP2, ở

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng giống đậu tương chịu hạn DT2008 trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp làm vật liệu nghiên cứu Hạt của giống đậu tương DT2008 thu tại vụ Hè-Thu năm 2017 thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 Hạt của giống đậu tương DT2008

Giống đậu tương DT2008 được chọn tạo bằng phương pháp xử lý đột biến chiếu xạ tia gamma trên hạt khô dòng 2001HC từ tổ hợp lai DT2001 với HC100 Theo các kết quả đã được khảo nghiệm công bố, giống DT2008 sinh trưởng hữu hạn, dạng cây bán đứng, lá hình trứng nhọn, hạt màu vàng và rốn hạt màu đen, thuộc nhóm giống trung ngày từ 95 – 110 ngày Đặc biệt, DT2008 sinh trưởng khỏe, chiều cao cây từ 55 – 75cm, số cành cấp 1 trên cây lớn từ 3,5 – 4,5 cành, có khả năng chống chịu tổng hợp với những yếu tố bất lợi của sản

xuất như hạn úng, nhiệt độ, các loại bệnh, đất nghèo dinh dưỡng, cho năng suất cao

Vector và chủng vi khuẩn

Vector tách dòng pBT và chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công

nghệ ADN ứng dụng, viện Công nghệ sinh học cung cấp

Hình 2.2 Vector pBT sử dụng trong tách dòng phân tử gen GmDREB6 từ cây

đậu tương

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam; phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học

Sư phạm – Đại học Thái Nguyên

Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2017 đến tháng 8/2018