Báo cáo thực hành hoa sinh

Tai liệu báo cáo thực hành hóa sinh

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

-Dưới tác dụng của lực mao quản thì các acid amin trong dung dịch acidamin mẫu sẽ chạy theo các mạch cellulose với lực mao dẫn khácnhau,tùy vào trọng lượng của mỗi loại acid amin mà nó mà nó sẽ rơi rớtlại các vị trí khác nhau trên giấy săc kí.Khí đó thông qua việc so sánh chỉ

số Rf của acid amin mẫu với acid amin chuẩn mà định tính các acid amin

có trong mẫu dung dịch đó

-1 bóp cao su-1 bình xịt thuốc hiện màu

b Hóa chất :

-Ninhydrin 0,5% trong axeton

- chuẩn và mẩu khảo sát

-Dung môi: butanol – acid acetic – nước theo tỉ lệ 4:1:5

c.Cách tiến hành:

Giấy sắc kí,vẽ đường xuất phát bằng bút chì,chấm điểm xuất phát ở giữa→chấm dung dich acid amin vào vòng tròn điểm xuất phát,xấy khô,làm như vậy khoảng 5 lần

Móc giấy sắc kí và cho ngập vào phần dung môi (không ngập quá vạch xuất phát).

Đợi cho dung môi chạm vạch đích,lấy ra sấy khô

Phun nihydrin và sấy khô lần nữa các vệt màu hiện ra

Xác định acid amin có trong mẫu bằng so sánh Rf của nó với Rf của acid amin chuẩn

(1)

(3) (2)

IV Kết quả thí nghiêm và bàn luận:

Trên giấy sắc kí mẫu:

+Hai là một loại acid amin chưa thể định danh được.

V.Trả lời câu hỏi :

1 Các dạng acid amin thường gặp trong thực phẩm?

-Có khoảng 20 loại acid amin thường gặp là thành phần căn bản trong cấu tạo protein.Trong đó có 10 loại acid amin mà con người không tổng hợp được (với 8 acid amin ở người lớn Valine,Leucine,

Isoleusin,Methionine,Phenylalanine,Trytophan,Lysine,Threonine và thêm 2 acid nữa ở trẻ em đó là Arginine và Histidine) mà cơ thể con người phải hấp thu bằng thực phẩm

-Các acid amin thường gặp ở dạng peptid (có cấu tạo từ một amino acid đến hàng chục amino acid) như: Glutathione, Caroisne, Ansrine

2 Phương pháp trên sẽ chính xác khi sử dụng để xác định loại acid amin nào?

Phương pháp trên thích hợp dùng để xác định các acid amin phân cực từtrung bình đến phân cực mạnh như glucosid, các hợp chất polyphenol.VìCellulose trong giấy là một chất phân cực nên nó sẽ liên kết với các acidamin có tính phân cực.Mặc khác,pha động ta dùng ở đây là một hỗn hợpcác dung môi_tức nó có tính phân cực nên việc sử dụng pha động nhưthế này sẽ làm tăng chỉ số Rf của các acid amin,trong khi đó chiều dàicủa giấy sắc kí có hạn nên việc xác định các acid amin bằng phương

pháp này thì acid amin phải có tính phân cực trung bình đến mạnh đểgiảm chỉ số Rf lại,đảm bảo acid amin đó không vượt quá tuyến dungmôi.

3.Viết phương trình phản ứng xảy ra trong thí nghiệm trên?

Trong thi nghiệm trên thì xảy ra phản ứng tạo màu của nyhydrin với acidamin

-Khi đun nóng acid amin với nyhydrin thì tạo thành CO2,NH3,Aldehyde

và dicetooxihydrinden

-Nihydrin pha trong môi trường aceton với pH của acetoon trong khoảng

pH 6-7 nên dicetooxyhydrinden sẽ phản ứng với 1 phân tư NH3 tạo phứcmới.Phức này lại kết hợp với NH3 tạo hợp chất có màu xanh tím đỏ (trừproline và oxiproline tạo thành hợp chất có màu vàng)

4.Trình bày ý nghĩa thực tiễn của thí nghiệm?

Ý nghĩa thực nghiệm của phản ứng đó là:Xác định được gần như làchính xác một acid amin nào đó có tính phân cực mạnh nếu khi đem sosánh với các acid amin mẫu đã biết

BÀI 2 : XÁC ĐỊNH PROTEIN THÔ TRONG THỰC PHẨM

-Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác,cácchất hữu cơ có chứa nito bị phân giải và bị oxi hóa đến CO2 và H2O cònnitơ chuyển thành amoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thànhamoni sunfat xảy ra theo các bước:

+Vô cơ hóa mẫu:

- Dung dịch vô cơ hóa mẫu

- Dung dịch phenolphthalein 1% trong etanol 90%

- Chỉ thị MR 1%

- Dung dịch H2SO4 0,1N

- Dung dịch NaOH 30%

Rửa máy chưng cất

Đun sôi bình đun

Cho vào phễu 10ml mẫu vô cơ hóa,thêm nước cất khoảng 50ml,5 giọt phenolphthalein 1%,trung hòa bằng NaOH 30% Sau đó tráng lại phễu bằng nước cất

Chưng cất lien tục 20 phút kể từ khi bình bắt đầu sôi, hạ bình hứng, rửa sạnh đầu ống sinh hàn bằng nước cất Đặt giấy pH sát miệng ống sinh hàn, nếu giấy pH không đổi màu thì quá trình chưng cất đã hoàn tất

Lấy dung dịch trong bình hứng chuẩn độ với dung dịch NaOH đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt

Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng gồm 25ml dung dịch H2SO4 0,1N, 3 giọt Metyl Red 1%

c Các bước tiến hành :

Thực hiện 1 lần thử không và 1 lần thử thật ( thử không thay vì 10mldung dịch đạm vô cơ hóa thì cho10ml nước cất)

IV Kết quả thí nghiêm và bàn luận:

- Khối lượng dung dịch vô cơ hóa mẫu: m = 9,851g = 9851mg

- Số ml NaOH dùng để chuẩn mẫu trắng : T = 23,9 ml

- Số ml NaOH dùng để chuẩn mẫu thử thật: B = 20,1 ml

- Nồng độ đương lượng của dd NaOH dùng để chuẩn độ:N = 0,1N

Hàm lượng nitơ tính theo công thức:

+Mẫu lấy không mang tính đại diên

+Sai số do dụng cụ,cũng như trong quá trình thao tác thí nghiêm…

V.Trả lời câu hỏi :

Câu 1 :Vô cơ hóa mẫu là gì?Viết PTPƯ xảy ra trong quá trình vô cơ hóa.

-Vô cơ hóa mẫu là chuyển các hợp chất hữu cơ trong mẫu về dạng vôcơ

-Phương trình phản ứng xảy ra trong quá trình vô cơ hóa mẫu :

RCHNH2-COOH +H2SO4 H2O + CO2 +NH3

NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 ((Mẫu đã vô cơ hóa)

Câu 2 : Viết PTPƯ xảy ra trong quá trình chưng cất và chuẩn độ mẫu.

Phương trình phản ứng xảy ra trong quá trình :

Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sống, tương

tự như các acid amin, protein cũng là chất điện ly lưỡng tính do có nhiềunhóm phân cực của mạch bên Protein có tính hòa tan, chúng có thể kếthợp với nước, nói cách khác là có khả năng hydrat hóa cao Tính hòa tancủa protein phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như nồng độ muối trungtính trong dung dịch, bản chất của các acid amin, pH, loại dung môi…Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý, hóa học protein sẽ bị biến tính

* Việc kiểm tra hàm lượng protein thô có ý nghĩa đối với các sản phẩmthực phẩm là : hàm lượng protein quyết định chất lượng của khẩu phầnthức ăn qua việc xác định hàm lượng protein thô trong thực phẩm đểcung cấp đầy đủ lượng protein trong khẩu phần ăn (thông thường nănglượng do protein cung cấp chiếm khoảng 12 – 15%)

Câu 4:Tiêu chuẩn FAO/WHO về hệ số protein thô trong thực phẩm?

Tiêu chuẩn của FAO/WHO về hệ số protein đối với thực phẩm :

30% protein có nguồn gốc từ động vật

70% protein có nguồn gốc từ thực vật

Câu 5:Trình bày một số phương pháp xác định hàm lượng protein thô khác trong thực phẩm.

*Một số phương pháp xác định protein thô trong thực phẩm là :

-Định lượng protein thô theo phương pháp Lowry: có thể tính được hàmlượng protein của mẫu nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của protein vàdựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin cường độ màucủa dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein

-Định lượng nito bằng phương pháp so màu (phản ứng với thuốc thửNESSLER): khi ta cho tác dụng một dung dịch muối ammonium (NH4+)với thuốc thử NESSLER (dung dịch muối Hg và K với Iodur) sẽ tạothành phức chất có màu vàng : cường độ màu vàng này là một hàm sốtuyến tính với nồng độ của muối ammonium

Hút 10ml mẫu+50ml nước cất+ 5 giot PP cho vào erler 250ml Dung dịch có màu phớt hồng bền trong 30s

Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N

-Phương pháp Coomassie Brilliant Blue G-250 dựa vào sự thay đổi màuxảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein trongdung dịch acid dạng proton hóa trong thuốc nhuộm Coomassie Blue cómàu da cam đỏ Thuốc nhuộm liên kết chặc chẽ với các protein tươngtác với nhóm kị nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tửprotein Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương sự protonhóa không xảy ra và có màu vàng xuất hiện

BÀI 3 : XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID HỮU CƠ

TRONG SỮA TƯƠI.

CH3CH0H-COOH +NaOH → CH3-CHOH-COONa +H2OTừ đó xác định được lượng acid lactic

III.Hóa chất,dụng cụ.cách tiến hành:

a.Dụng cụ thiết bị:

-1 cân phân tích-2 beccher 250ml-3 erler 250ml-1 pipet 10

-1 ống nhỏ giọt-1 buret 250ml-1 giá đỡ buret -1 bóp cao su

b.Hóa chất:

-Dung dịch phenolphtalein 1%

-Dung dịch NaOH 0.1N chuẩn

c.Các bước tiến hành:

Tiến hành tương tự với mẫu trắng (thay vì hút 10ml mẫu thì hút 10mlnước cất).

IV Kết quả thí nghiêm và bàn luận:

Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn mẫu thử lần 1: V1=2 ml

Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn mẫu thử lần 2: V2=1.9 ml

→ V

NaOH 0.1 N trung b ì n h d ù ng ch u ẩ n m ẫ u t h ử = V 1+V2

2 =1.95 ml

- Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn mẫu trăng: V’ =0.45ml

V’’ = 10ml là thể tích mẫu dùng ban đầu

Hàm lượng acid chuyển ra theo acid lactic (g/l) tính theo công thức:g/lit acid lactic =(V −V ').0 089 N 1000

+Nồng độ NaOH 0.1 N không đảm bảo chính chính xác

+Sai số do dụng cụ,cũng như trong quá trình thao tác thí nghiêm…

-Vì trong sưa chứa chủ yếu acid lactic nên ta quy về acid đó nên kết quả

sẽ gần đúng vơi acid tổng trong mẫu,khi đó mỗi acid được quy về đó sẽ

có 1 hệ số riếng:

+sữa → acid lactic (0.089)

+cam/chanh → acid citric (0.064)

V.Trả lời câu hỏi :

1.Các dạng acid hữu cơ nào thường gặp trong sữa tươi?

Các dạng acid hữu cơ thường gặp trong sữa tươi đó là: acid lactic,acidbutyric,acid propionic,acid acetic…

2.Các loại vi sinh vật nào thường tạo ra các loại acid nói trên?

-Vi khuẩn lactic → acid lactic

-Vi khuẩn coliform → acid lactic

-Vi khuẩn clostridium → acid butyric

-Vi khuẩn propionic → acid propionic,acetic

3.Viết phương trình phản ứng xảy ra trong thí nghiệm nói trên.

CH3CH0H-COOH +NaOH → CH3-CHOH-COONa +H2O

4.Trình bày ý nghĩa thực tiễn của thí nghiệm.

Việc xác định được hàm lượng acid hưu cơ trong sữa giúp ta đánh giá phần nào chất lượng sữa,từ đó tìm được phương pháp điều chỉnh thích hợp

BÀI 4 : XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

ANPHA-AMYLASE

(Phương pháp Smith and Roe)

I.Mục đích:

Xác định hoạt tính enzyme anpha-amilase

II.Nguyên tắc:

-α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên, song tốc độ rất chậm; nó có khả năng phân cắt các liên kết 1-4 glycoside nằm ở phía trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen) một cách ngẫu nhiên Sản phẩm tạo thành chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp (không có màu với iod), một ít maltose và rất ít glucose

-Hoạt tính của enzyme biểu thị bằng khả năng xúc tác p/ứ thủy phân tinh bôt đến dextrin trong 1 phút ở 500C

-Lượng tinh bột còn lại không bị thủy phân sẽ p/ứ màu vơi iode và được

so màu bằng máy đo màu quang học ở bước sóng 620nm

III.Hóa chất,dụng cụ.cách tiến hành:

a.Dụng cụ thiết bị:

-1 cân phân tích

-1 máy quang phổ

-2 cuvet

-2 beacher250ml

-2 erlen 250ml

-1 pipet 10 ml

-1 cổi chày inox -1 phễu thủy tinh -ống nghiệm -1bóp cao su -1 ống đong -giấy lọc

b.Hóa chất:

-Dung dịch đệm sorensen1/15M

-Dung dịch tinh bột 1%

Khi tất cả cả các cồn đã chảy ra hết, để một ống nghiệm sạch dưới phễu và đổ trên giấy lọc 20ml nước đẻ hòa tan phần kết tủa,ta có dung dịch amylase

Để lắng, đổ phần nước bên trên qua giây lọc chất kết tủa lắng dưới đáy, thêm 5 ml cồn tuyệt đối vào, lắc và để lắng cho phần dịch trong qua giấy lọc và giữ chất trầm hiện lại Rửa 3 đến 4 lần như vậy với cồn tuyệt đối Sau kì rửa chót đổ tất cả các kết tủa lên trên giấy lọc

-Dung dịch HCl 1N-Duntg dịch NaCl 3%

-Thuốc thử Lugol: 0,5g I2 và 5g KI trong nước thành 200ml

c.Cách tiến hành:

*Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau

10g đại mạch nghiền với 30ml nước cất,để yên trong 15 phút,

đem lọc

Lấy 20ml nước lọc+ 80ml cồn tuyệt đối, khuấy đều ta thấy amylase và các

protein sẽ bị kết tủa

Dung dịch hóa chất Ống nghiệmỐng thử (t) Ống chuẩn (0)

IV Kết quả thí nghiêm và bàn luận:

-Khối lượng lúa nảy mầm: 10,013 g

-Mật độ quang ống chuẩn: ODo = 0,299

-Mật độ quang ống mẫu: ODt = 0,027

-Lượng tinh bột tham gia p/ứ

C= C %h ồ tin h d ị c h tin h b ộ t X m dung d ị c h

1 X 1,108

100 =0,0108 g

(1,108g là khối lượng của 1 ml dung dịch tinh bột cân được)

-Thời gian p/ứ T= 30 phút

-Hệ số pha loãng mẫu enzyme L= 10

Hoạt độ của enzyme anpha-amilase tính theo công thức:

Hđ A = (OD0 −OD t)

OD t t C L=

(0,299−0.027) 0,027 30 .0,0108 10=0,0363(UI)

-Trong quá trinh tiến hành thí nghiêm,ta sử dụng dung dịch đệmSorenxen để đưa giá trị pH của dung dịch chiết enzyme về pH tối ưu;dung dịch HCl 1N dùng đê dừng p/ứ cắt mạch tinh bột của enzymeanpha amilase,ủ dung dịch p/ứ ở 500C để đưa về giá tri nhiệt đô tối ưucủa enzyme

-Cuối cùng,khi dùng Lugol nhỏ vào ống chuẩn và ống mẫu thì với ốngchuẩn do không sử dụng dịch chiết enzyme amilase nên lượng tinh bộthầu như còn nguyên vì vậy chỉ cần nhỏ 1 giọt lugol vào thì cho màuxanh đậm còn vơi ống thử thì còn 1 lượng nhỏ tinh bột không bị phângiải p.ứ với lugol nên màu của nó sẽ nhạt hơn

-Đo mật độ quang của ống chuẩn và ống mẫu tức là đo khả năng hấp thụánh sáng của một chất.Vơi ống chuẩn,lượng tinh bột hầu như connguyên nên khả năng hấp thụ của nó cao hơn nhiều so vơi ống mẫu,nêngiá trị OD của nó cao hơn

V.Trả lời câu hỏi :

Câu 1:Trình bày tính chất chung của enzyme?

Tính chất chung của enzym:

-Enzym là protein có hoạt tính sinh học, các enzyme xúc tác cho hầu hếtcác phản ứng trao đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường bênngoài, nghĩa là đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể

-Enzyme có bản chất là protein có dạng hình cầu và không đi qua màngbán thấm do có kích thước lớn

-Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trongcác ete và các dung môi không phân cực

-Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzyme bị biếntính, môi trường acid, bazo cũng làm enzyme mất khả năng hoạt động -Enzyme có tính lưỡng lưỡng tính, tùy theo pH của môi trường mà tồntại ở các dạng cation, anion hay trung hòa điện

Câu 2:Trình bày tính chất và ứng dụng của một vài loại enzyme phân giải protein thường gặp trong tự nhiên?

Tính chất và một số phản ứng protein phân giải protein thường gặp trong

tự nhiên:

* Bromelain: được thu từ thân và trái dứa có hoạt tính xúc tác phân giảiprotein, thành phần chủ yếu là nhóm sunphydryl thủy phjaan protein-Ứng dụng :

+ hỗ trợ chữa các bệnh về đường tiêu hóa

+ giảm đau sau chấn thương , phẫu thuật mau lành vết thương

+ giảm đau nhức cơ, viêm khớp, viêm khoang, gout

+ chống rối loạn tim mạch

+ chữa ung thư, chữa HIV- AIDS

*Papain: là chất bột màu trắng hoặc xám nhạt, dễ hút nước, không tantrong dung

môi hữu cơ, được tách từ nhựa đu đủ

-Ứng dụng :

Được dùng trong công nghiệp nhẹ, công nghệ thực phẩm, y học, xử lý

da, làm mềm thịt, dùng trong đồ uống làm làm sạch vết thương, điều chếđạm thủy phân

* Ngoài ra còn có một số enzyme được tách chiết từ động vật như: ficin,tripsin

*Ứng dụng chung của protease

+nhóm enzyme thủy phân protein thành peptit ngắn, acid amin

+ứng dụng trong sản xuất nước chấm, nước mắm, tương chua…

+trong công nghệ thực phẩm dùng làm mềm thịt, enzyme thường dùnglà: Bromelain, papain, dạng chế phẩm protease vi sinh vật

+trong công nghiệp da, làm mềm da, sạch long, bóng da

+trong công nghiệp tơ tằm làm bóng và tách rời các sợi tơ nhờ sự phá bỏprxerixin

xà bông, kem giặt có eym sẽ dễ dàng tẩy các vết bẩn ( máu, sữa)

+trong y học sản xuất môi trương nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanhmiễn dịch

Câu 3: Trình bày tính chất và ứng dụng của enzyme amylase.

Tính chất và ứng dụng của enzyme alpha- amylase

-Amylase là enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân xúc tác phân giảiliên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia củanước

RR’ + H-OH →RH + R’- OH

-Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen

-Sản phẩm của sự thủy phân do enzyme amylase xúc tác là các thànhphần đơn giản như dextrin, maltode, glucose