hướng làm dẫn báo cáo thực hành hóa sinh thực phẩm

Quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật Bước 1:Chuẩn bị dụng cụ -Chuẩn bị đầy đủ -Dụng cụ rửa sạch, tráng bằng nước cất sau đó sấy khô trước khi sử dụng Bước 2: Cân đong hóa c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM



HƯỚNG DẪN BÁO CÁO THỰC TẬP

MÔN VI SINH ĐẠI CƯƠNG

GV: Lưu Huyền Trang

BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT

I Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật?

- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt

- Với c ấc dụng cụ như pipet, que trải phải dùng giấy bao kín toàn bộ Có thể dùng hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên đẻ khử trùng

II Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghi ệm vi sinh vật?

- Tủ sấy (vacuum oven): dùng dòng không khí nóng (đối lưu hoặc không) Có hai loại sấy:

o Sấy khô: vật dụng thủy tinh, kim loại (105oC), nhựa (60-80oC)

o Sấy khử trùng: 160oC (2 giờ), 180oC (30 phút)

- Tủ ấm/ ủ (incubator): ủ, nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng

- Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đ ặt ở nhiệt độ nhất định để ổn định nhiệt

độ cho các thí nghiệm

- Máy lắc (trộn đều): lắc ngang ho ặc lắc vòng, để tăng lượng oxy hòa tan hoặc tăng khả năng vi sinh vật tiếp xúc với cơ chất

- Máy đo pH: đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật (đo trước khi cho agar vào)

- Cân: vệ sinh cân trước và sau khi dùng, khi cân chú ý đơn vị đo

- Máy ly tâm (centrifuge): thu sinh khối vi sinh vật Các ống ly tâm c ần đ ặt đối xứng và nhất thiết có khối lượng bằng nhau

- Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (flux laminar): có không gian vô trùng được sử dụng để thao tác với sinh, bao gồm:

o Đèn UV: khử trùng khí bề mặt trongb tủ

o Bộ phận thổi khí vô trùng

o Lỗ lọc khí: đường kính 0,2-0,45µm

- Nồi hấp ướt (autoclave): thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao, dùng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm

- Kính hiển vi: nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đ ặc điểm hình thái, sinh lí nhờ vào khả năng phóng đại của kính

- Thiết bị khác: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đong khô,

- Dụng cụ thí nghiệm:

o Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lí tế bào vi sinh vật

o Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu

o Hộp lồng (đĩa petri): dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái , đặc điểm nuôi cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật

o Que gạt (que trải): là dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải đĩa

o Que cấy, co 3 loại: que cấy đầu tròn (vi khuẩn, nấm men), que cấy nhọn (cấy sâu trên môi trường rắn), que cấy móc (khuẩn ty, đoạn tơ nấm)

o Micro pipette: dùng khi cần hút một lương chính xác môi trường sử dụng trong định lượng vi sinh vật

o Pipette Pasteur:dùng để lấy dung dịch môi trường nuôi cấy

III Trình bày phương pháp tiêt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

1 Phương pháp lí học:

- Nhiệt khô:

 Đối với dụng cụ ấy ikm loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt: đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt

 Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy và sấy ở 160oC trong 1-2 giờ h oặc 180oC trong

30 phút Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun

- Nhiệt ẩm:

 Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật Tuy nhiên, chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào

tử vẫn còn

 Phương pháp Pasteur:chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh (kí sinh), không diệt bào tử và vi khuẩn hoại sinh Phương phấp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài vi sinh vật đối kháng mạnh nhất Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng loại vi sinh vật Phương pháp này thường dùng nhiệt độ 70-75oC trong thời gian 10-15 phút

 Phương pháp Tyndalll: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80oC, mỗi lần 30-60 phút và liên tiếp trong 3 ngày liền

 Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave Nhiệt độ và thời gian hấp tùy thuộc vào loại nguyên liệu cần hấp Thường dùng nhất ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15-30 phút

- Diệt trùng bức xạ:

 Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật

 Tia âm cực:dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm Vật khử trùng phải bao gói kín

 Sóng ngắn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế bào sinh vật, làm chết các tế bào sồng

- Diệt trùng bằng cách lọc:

 Dụng cụ lọc thường là các những màn lọc bằng sứ, aminate, celluose, có kích thước lỗ lọc từ 0,2-0,45µm, thường dùng để lọc các vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được

 Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy locjkhis có trang bị màn lọc hay hấp phụ vi khuẩn

2 Phương pháp hóa học:

- Chất sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác dụng sát khuẩn như xanh methylenne)

- Chất diệt khuẩn và chất tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor,

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

VI SINH VẬT

I Khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Khái niệm

Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa - khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của môi trường

Phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

 Phân loại theo nguồn gốc:

-Môi trường tự nhiên: dịch nước thịt, máu động vật, nước chiết khoai tây,

-Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB,

-Môi trường bán tự nhiên: PGA, giá đậu đường,

- Môi trường bán tổng hợp: BPA,

 Phân loại theo trạng thái vật lý:

-Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay chất làm giá thể khác trong thành phần môi trường

-Môi trường bán lỏng: có 0.5% agar hay chất làm giá thể

-Môi trường rắn: có chứa 1.5 - 2% agar hay chất làm giá thể

-Môi trường bán rắn: cơm nguội, đậu,

 Phân loại theo công dụng

-Môi trường tiền tăng sinh

-Môi trường tăng sinh

-Môi trường phân lập

-Môi trường Chromogenic

 Phân loại theo chủng loại

-Môi trường nuôi cấy nấm men

-Môi trường nuôi cấy nấm môc

-Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

-Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

-Môi trường nuôi cấy virus

II Quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Bước 1:Chuẩn bị dụng cụ

-Chuẩn bị đầy đủ

-Dụng cụ rửa sạch, tráng bằng nước cất sau đó sấy khô trước khi sử dụng

Bước 2: Cân đong hóa chất pha chế môi trường

Bước 3:Phối chế tạo môi trường nuôi cấy

-Các thành phần hòa tan riêng rẽ trong nuocs cất trước khi phối trộn

-Phối trộn theo trình tự

-Lọc môi trường

-Đối với môi trường rắn: sau khi phối trộn cần nấu sôi để hòa tan hoàn toàn agar Bước 4Điều chỉnh độ pH của môi trường

Bước 5Phân phối vào dụng cụ chứa

-Trình tự phân phối:

+ Đun cho lỏng hóa chất rồi đổ qua phễu vào dụng cụ

+Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra

+Nhanh tay rót dụng cụ vào môi trường và đậy nút bông lại

-Viết nhãn môi trường lên dụng cụ chứa

Bước 6 :Khử trùng môi trường

Bước 7 :Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đia petri

Bước 8:kiểm tra độ vô trùng và bảo quản

III Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng

 Đĩa petri: môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng Thể tích

môi trường khoảng 12 - 15ml mỗi đĩa và lớp môi trường thạch dày khoảng 2mm

 Ống nghiệm thạch nghiêng: lượng môi trường phân phối vào chiếm 1/4 thể tích ống

nghiệm Sau khi phân phối môi trường vào ống nghiệm, ống nghiệm phải được đặt nghiêng cố định trên giá đỡ Phần đỉnh nghiêng phải cách nút đậy 3 - 5cm Phần đáy phải có một phần thạch đứng 0,5-1cm

 Ống nghiệm thạch đứng: lượng môi trường phân phối vào chiếm 1/3 - 1/2 thể tích

của ống nghiệm Sau đó để yên trên giá cho đến khi môi trường nguội và đông đặc

IV Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng?

- Không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng vì:

+ Chiều cao đĩa rất thấp, khi ta cho môi trường vào rồi tiến hành hấp khử trùng sẽ làm cho môi trường trong đĩa bị trào ra ngoài, dẫn đến môi trường bị đục và khó quan sát được vi sinh vật

+ Môi trường bị trào ra ngoài khi hấp sẽ ảnh hưởng đến chất lượng môi trường Bên cạnh đó, môi trường dễ bị nhiễm những vi sinh vật không mong muốn, lượng môi trường trong đĩa giảm ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy và việc quan sát

V Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ng ửa? Tại sao?

Đĩa petri chứa môi trường trước khi nuôi cấy vi sinh vật nên để ngửa để có thể làm kín khu vực nuôi cấy, tránh bị vi sinh vật lạ rớt ngoài không khí vào và tránh sự bốc hơi

nước bám vào bè mặt môi trường, và lúc đó nước sẽ ngưng trên nắp trên

BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT

I Phương pháp cấy truyền vi khuẩn, nấm men, nấm mốc

Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng

 Cấy truyền vi khuẩn, nấm men :

- Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy, tên sinh viên thực hiện vào thành ống nghiệm

- Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy

- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy

- Dùng ngón út và ngón áp út đ ậy ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút đậy ra

- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng hai ống nghiệm

- Đợi khi que c ấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật trong ống giống

- Rút que c ấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi trường để thực hiện thao tác cấy:

+ Hình chữ chi

+ Hình vòng xoắn

+ Hình vạch ngang song song

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng hai ống nghiệm rồi đậy nút bông

- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

 Cấy truyền nấm mốc

- Thực hiện các thao tác tương t ự giống như cấy truyền vi khuẩn, nấm men chỉ khác đối với nấm mốc, khi cấy trên ống nghiệm thạch nghiêng, dùng que móc vô trùng l ấy bào tử từ ống giống Cấy truyền bào tử từ ống nghiệm môi trường mới theo hai cách: + Cấy điểm: Cắm ngập đầu que cấy thành ba điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch + Cấy gõ: Đưa que que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng que cấy vào thành ống nghiệp đối diện với mặt thạch để rãi bao tử xuống

Cấy truyền trên thạch đĩa

-Dùng que cấy đầu tròn , hoặc que trải thủy tinh

-Dùng que cấy tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách

-Tay trái c ầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó để cách đền cồn chừng 1-2 cm, khẽ mở nghiêng một bên hộp(phần hơ lửa), sao cho vừa đ ủ để cho que cấy vào

- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy bề mặt thạch theo một trong các kiểu sau: + Theo hình zích zắc trên toàn bộ mặt thạch

+ Theo những đường song song

+ Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc

- Khi dùng que trải, hút s ẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên bề mặt thạch đĩa Khử trùng que trải thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên ngọn lửa Làm nguội que trải và trải đều giọt dung dịch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường thạch đĩa

II Các điều kiện nuôi ủ nấm men và vi khuẩn sau khi gieo cấy

- Nhiệt độ: phụ thuộc vào từng lo ại vi sinh vật Duy trì sự ổn định của nhiệt độ đó bẳng tủ ủ vi sinh vật

- Độ ẩm: để duy trì độ ẩm, trong quá trình nuôi cần đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc

để nước bốc hơi trong tủ ấm

- Oxy: đối với vi sinh vật hiếu khí, cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kì Đối với vi sinh vật kị khí: hạn chế sự tiếp xúc với oxy bằng cách đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vaselin ho ặc cấy trích sâu vào môi trường đ ặc, nuôi cấy trong bình hút chân không, nuôi cấy trong bình hút đặc biệt, sau khi rút hết không khí và hàn kín lại, đun sôi môi trường trong một thời gian để lọai hết oxy Để nguội 45 độ C Dùng pipette cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm Làm nguội nhanh rồi đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế tiếp xúc với oxy

III Đĩa petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp vì một số lí do sau:

- Hạn chế việc hơi nước đọng trên nắp rơi xuống làm hỏng khuẩn lạc nuôi c ấy, làm nhiễm , hư môi trường

- Hạn chế một phần tạp nhiễm trong thời gian nuôi c ấy do phần đáy nặng có xu hướng úp từ trên xuống nên đậy kín đĩa thạch

- Dễ dàng c ầm nắm, vận chuyển đĩa thạch mà không bị rơi nắp bất ngờ làm môi trường bị nhiễm

- Riêng đối với nấm mốc thì nên để ngửa, tránh bào tử rơi khỏi môi trường(khi để úp

có khả năng bào tử rơi xuống dưới và mộc lum tum, bị nhiễm)

IV Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, ta phải ria que cấy ngược

từ đáy ống nghiệm lên phía trên

- Ria từ dưới lên, que cấy sẽ theo chiều từ dưới đi lên và ra khỏi ống nghiệm mà không cần di chuyển qua đường đã cấy.(trường hợp cấy từ trên xuống lúc kéo que c ấy ra

dễ rớt vi sinh vật vào lúc vi sinh vật mọc không trên đường cấ khó xác định là bị nhiễm

vi sinh vật lạ hay chính vi sinh vật muốn cấy rớt vào )

- Môi trường từ đáy lên phía trên ít dần, nên khi cấy từ dưới lên trên đảm bảo lượng vi sinh vật được phân bố hợp lí vào môi trường theo hướng ít dần

- Nếu ria từ trên xuống sẽ khó thao tác và làm rách thạch

- Khi môi trường được chuẩn bị xong sẽ có một giọt nước ở đáy ống nghiệm, khi thao tác thường dùng que cấy hòa vào giọt nước và bắt đầu ria, như vậy vi sinh vật sẽ mọc đều ở đường cấy

BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUANG SÁT VI SINH VẬT BẰNG

KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

I Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi

1.1 Cấu tạo

Hệ thống giá đỡ gồm:Bệ, thân, Revonve mang vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu bản

Hệ thống phóng đại gồm:

- Thị kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi mà người ta để mắt và để soi kính, có 2 loại ống đôi và ống đơn (Bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự rất ngắn, dùng để tạo ra ảnh thật của vật cần quan sát)

- Vật kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi quay về phía có vật mà người ta muốn quan sát, có 3 độ phóng đại chính của vật kính:x4, x10, x40, x100 (Bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, đóng vai trò như kính lúp để quan sát ảnh thật)

Hệ thống chiếu sáng gồm:

- Nguồn sáng (gương hoặc đèn)

- Màn chắn, được đặt vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua tụ quang

- Tụ quang, dùng để tập trung những tia ánh sáng và hướng luồng ánh sáng vào tiêu bản cần quan sát Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và bàn để tiêu bản Di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng

Hệ thống điều chỉnh:

- núm chỉnh tinh (thứ cấp)