Tìm hiểu phương pháp Lai Phân Tử

• Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trộn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai hybrid... - Các mạch đơn sẽ bị thủy gi

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TPHCM

Nội dung chính

• I Lịch sử lai phân tử

• II Khái niệm về lai phân tử

• III Các phương pháp lai phân tử

• IV Ứng dụng của lai phân tử

• V Ví dụ của lai phân tử

I Lịch sử lai phân tử

• 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing) Quá trình này bao gồm

sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững Từ

sự khám phá ra quá trình reannealing, phương pháp lai các sour nucleic được phát triển

• Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic

có thể trộn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid)

II Khái niệm về lai phân tử

• Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột

• Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được giảm từ

từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại

Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization)

II Khái niệm về lai phân tử

II Khái niệm về lai phân tử

Hình – sự lai giữa DNA và RNA

Các yếu tố ảnh hưởng

Các yếu tố ảnh hưởng

Nhiệt độ

Độ dài các trình tự

Độ dài các trình tự

1 Nồng độ DNA và thời gian phản ứng

- Nồng độ DNA nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng, kết quả là tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên.

- Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất trên càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp (lai).

2 nhiệt độ

• Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại ở nhiệt

đố thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%.

3 Độ dài của các trình tự

• Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của độ dài các trình tự bổ sung

III Các phương pháp lai phân tử

Gồm 3 phương pháp

Lai tại chỗ

1 Lai trên pha lỏng

• Nguyên tắc : Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do

chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ

1 Lai trên pha lỏng

• Phân tích định lượng các phân tử lai: 3 phương pháp

Phương pháp dùng quang phổ kế

- DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn

- Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm

- Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện

tượng này có tên gọi là hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect)

do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi.

Phương pháp sử dụng nuclease S1

- Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm

- Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, đem xử lí với nuclease S1

- Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng

Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

- Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci

- Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết

- Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600C trong một dung dịch đệm Natri phosphat

1 Lai trên pha lỏng

2 Lai trên pha rắn

• Nguyên tắc : Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng Điểm khác biệt ở đây là 1 trong 2 trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên 1 giá thể rắn

• Ưu điểm :

+ Thao tác dễ dàng

+ Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở dung dịch thuốc thử

+ Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng 1 phân tử

2 Lai trên pha rắn

Hình – các bước lai trên pha rắn

2 Lai trên pha rắn

Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong phương pháp lai trên pha rắn :Giá thể rắn dùng để

cố định nucleic acid là các màng lai, có 2 loại màng lai : (1) màng lai bằng nitrocellulose và (2) màng lai bằng nylon.

2 Lai trên pha rắn

2 Lai trên pha rắn

3 Đem lai các DNA được cố định trên màng này với các mẫu dò có đánh dấu phóng

xạ Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng

4 Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai Người ta sẽ đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, các mẫu dò được đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên phim

1 Biến tính RNA, điện di trên gel agarose để phân tách kích thước

2 Chuyển RNA lên màng lai

3 Đem lai RNA trên màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ

4 Các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi

PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT  

Mục đích : dùng để phát hiện protein

• - Protein sau khi được chiết tách và điện di trên polyacrylamide gel sẽ được chuyển lân màng nitrocellulose.

• - Protein cố định trên màng tạo ra những vệt (blot) có thể thăm dò (probe) được nhờ sử dụng kháng thể.

• - Trước khi thăm dò, các vị trí còn trống trên màng được trám bằng protein để ngăn cản hiện tượng gắn không đặc hiệu của kháng thể lên màng.

• - Sau đó 1 loại kháng thể (primary antibody) có kháng nguyên chính là protein được xác định được thêm vào và kháng thể này sẽ gắn lên các vệt protein trên màng.

• - Một kháng thể khác (secondary antibody) có mang một lọai enzyme sẽ bắt cặp với khácg thể ban đầu, enzyme trên phản ứng với cơ chế đặc hiệu tạo ra sản phẩm kết tủa có màu tại vị trí của phức hợp kháng nguyên_kháng thể

DOT VÀ SLOT BLOT 

Mục đích : định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp

RNA mà không cần phải phân tách chúng ra Phương phá này có thể sử dụng cho RNA.

• Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1

điểm_Dot hay 1 khe_Slot) Quá trình lai và phân tách phâan tử lai giống như đề cập ở phần trên Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươ 5c phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thục nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai.

Southern Blot Northern Blot Western Blot

2 Cắt với

enzyme giới hạn

2 Làm biến tính với fomaldehyde

4 Chuyển lên màng

nitrocellulose (thường bằng

hoạt động mao dẫn).

4 Chuyển lên màng nitrocellulose (thường bằng hoạt động mao dẫn).

4 Chuyển lên màng nitrocellulose (thường do chạy điện di).

6 Lai với mẫu dò DNA được

7 Rửa sạch khỏi mẫu dò

chưa được liên kết ( dưới sự

kiểm soát nghiêm ngặt).

7 Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết ( dưới sự kiểm soát nghiêm ngặt).

7 Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết.

hiện rõ với chất nền có màu

Northern Blot Western Blot

Hình – Chuyển DNA từ gel lên màng lai

Hình – Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu

Southern Northern Western

Ứng dụng -Bản đồ giới hạn của gene X

trong chromosome.

- Phát hiện các fragment polymorphysm của cùng 1 gen ở các cá thể khác nhau

-Phát hiện đột biến mất đoạn, điểm hay tái tổ hợp trên 1 gen.

- Bao nhiêu mRNA của gene X hiện diện?

- Độ dài mRNA của gene X?

- Bao nhiêu protein X hiện diện ?

- Độ lớn của protein X?

Ứng dụng Dot blot

• - Cho phép định lượng tương đối một DNA hay RNA đặc trưng trong một hỗn hợp mà không cần phải tách chúng ra.

- Kỹ thuật Dot (dot là khe) đơn giản hơn nhiều so với các phương pháp khác vì:

 Không cần giai đoạn cắt bởi những enzyme cắt giới hạn

 Không cần chạy điện di

• Kỹ thuật dot được dùng trong nghiên cứu những đoạn DNA ngắn

3 Lai tại chỗ

- Định nghĩa : Lai tại chỗ là 1 kiểu lai phân tử trong đó trình tự nuclic acid cần tìm (trình

tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô

- Nguyên tắc : Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan tách chiết chúng tế khỏi mô hay tế bào

• Định vị gen trên NST

• Nghiên cứu 1 mRNA riêng biệt trong tế bào và mô

Lai trên khuẩn lạc

Lai trên tế bào và mô Lai trên NST

3 Lai tại chỗ

• Các phương pháp :

3.2 Lai trên khuẩn lạc

• Phương pháp này được sử dụng

để phát hiện dòng vi khuẩn có

mang vector tái tổ hợp cần tìm

trong một ngân hàng gen

3.3 Lai trên tế bào và mô

• Trong tế bào và mô, các RNA, đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô Nghiên cứu trên mRNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể Trong trường hợp đó, người ta thường sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô

IV.Ứng dụng của lai phân tử

Ứng dụng

Y họcSinh học

Thực phẩm

Chăn nuôi

Nông nghiệp

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong sinh học : tRNA (transfer

RNA–RNA vận chuyển) được tạo ra

trong nhân sau đó được tống xuất ra

khỏi nhân chỉ một lần duy nhất

Nhưng sự trưởng thành và quá trình

chuyển vận của nó từ nhân ra tế bào

chất thật sự không đơn giản như

trước nay người ta vẫn nghĩ, thực tế

nó phức tạp hơn rất nhiều.

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong y học : Đối với các tác nhân gây

bệnh khó nuôi cấy hay không thể nuôi cấy

thì kỹ thuật sinh học phân tử là giải pháp

duy nhất Đặc biệt phương pháp lai tại

chỗ còn cho phép xác định trực tiếp virus

trên lát cắt sinh thiết

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong nông nghiệp : Chẩn đoán các virus

gây bệnh thực vật có ý nghĩa quan trọng

trong bảo vệ cây trồng

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong chăn nuôi : trong ngành thủy sản,

dùng phương pháp lai tại chỗ (in situ

hybridization) để chẩn đoán bệnh virus

đốm trắng của tôm.

IV Ứng dụng của lai phân tử

• Trong thực phẩm : dùng phương pháp lai

phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi

gen

V Ví dụ

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH CÁC LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử, trong đó đầu

dò đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa, và/hoặc nhân tế bào ở gian kỳ, nhằm phát hiện một

cách chính xác các bất thường NST

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence insitu

hybridization )

Kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử, trong đó đầu dò đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa, và/hoặc

nhân tế bào ở gian kỳ, nhằm phát hiện một cách chính xác các bất

thường NST (6) Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh là nhằm phát hiện các lệch bội NST thường gặp như 13,18,21, X,Y (10)

1 Đối tượng nghiên cứu:

Tiến hành kỹ thuật FISH và nuôi cấy NST theo phương pháp mới cho 28 thai phụ

mang thai 17-25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật

2 Phương pháp nghiên cứu:

          Các thai phụ có kết quả siêu âm bất thường hoặc xét nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhóm nguy cơ cao được bác sỹ Sản khoa và bác sỹ chuyên khoa Di truyền tư vấn

về phương pháp chọc hút nước ối, kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào ối, những nguy cơ, giới hạn của các kỹ thuật này

3.Quy trình chọc hút nước ối

- Siêu âm kiểm tra thai: các số đo, tim thai, vị trí bánh rau Chọn vị trí chọc kim thuận lợi (khoang ối rộng, xa các phần thai, đặc biệt đầu thai nhi)

- Kim chọc ối: dùng kim chọc tủy sống số 22G

- Dùng bơm tiêm 5 ml hút loại bỏ 2 ml dịch ối đầu tiên để tránh lẫn tế bào của mẹ.

- Thay bơm tiêm 20ml, hút 15-18ml dịch ối Dịch ối có màu vàng sáng, không lẫn máu của mẹ

- Mẫu dịch ối được lấy vào ống Falcon 15ml vô trùng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền- Bệnh viện Nhi TW làm FISH với tế bào ối trực tiếp, song song với nuôi cấy NST từ tế bào ối Mục đích nuôi cấy NST là để kiểm chứng độ nhạy và đặc hiệu của kỹ thuật FISH, phát hiện các bất thường NST khác không nằm trong nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc.

Kỹ thuật FISH

-Xử lý bệnh phẩm: Mẫu được xử lý theo quy trình thống nhất bằng Trypsin-EDTA 1X (Gibco), dung dịch KCl   0.075M, dung dịch cố định Methanol  

- Tạo tiêu bản: Nhỏ cặn tế bào lên lam kính sạch Đánh giá mật độ tế bào dưới kính hiển vi soi ngược.

- Nhỏ đầu dò : 10µl đầu dò đặc hiệu cho NST 13,18,21,X,Y (Vysis) trên vùng tế bào đã đánh dấu Vùng lai với đầu dò được phủ bằng DAPI (Sigma), cuối cùng được phủ bằng lamme 22x22mm (BDH).

- Phân tích dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang với phần mềm ISIS (Metasystem) Đếm tối thiểu trên 50 nhân tế bào đối với từng loại đầu dò Kết luận kết quả lai bình thường nếu trên 80% nhân tế bào có 2 tín hiệu đối với từng loại đầu dò Kết luận kết quả lai bất thường khi có trên 30% nhân tế bào có số tín hiệu bất thường đối với từng loại đầu dò.

  Kỹ thuật nuôi cấy nhiễm sắc thể từ tế bào ối      

Nuôi cấy NST từ tế bào ối theo phương pháp mới trên lammen 22x22mm Thực hiện chụp ảnh ít nhất 05 cụm NST bằng hệ thống Karyotyping (Karl Zeiss) và phân tích bằng phần mềm IKaros (Metasystem) Đếm 20 cụm dưới kính hiển vi thường

Kết quả

Kết quả FISH sau 24 - 48 h thấy có 1 trường hợp lệch bội với NST 13 và

1 trường hợp lệch bội với NST 21 01 trường hợp có bất thường nhánh dài NST 16, không nằm trong nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc 100% kết quả FISH phù hợp với kết quả phân tích NST từ tế bào ối sau

10 ngày

THANK YOUR FOR LISTENING!