ĐỀ TÀI TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP PCR

2.1.Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCRDNA mẫu Đoạn mồi Enzyme DNA-polymerase Các nucleotid... - DNA thật tinh sạch, đặc biệt là DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào sẽ cho kế

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE

CHAIN REACTION(PCR)

PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG

XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA

TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI

NỘI DUNG

GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP

POLYMERASE CHAIN

REACTION

( PCR)

• Là một phương pháp in vitro để tổng hợp AND dựa trên khuôn

là một trình tự đích AND ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao.

Lịch sử

ra đời và

nguồn

gốc

• Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985

• Ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này

• Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985

• Ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này

Khái

niệm

Tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA- polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung

Đoạn DNA cần nhân bản phải mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần

có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược)

Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu

Tổng hợp mạch mới nhờ enzym ADN polymerase(giai đoạn

kéo dài)

PHƯƠNG PHÁP

PCR VÀ ỨNG DỤNG

2.1.Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR

DNA mẫu

Đoạn mồi

Enzyme DNA-polymerase Các nucleotid

- DNA thật tinh sạch, đặc biệt là DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào sẽ cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên vẫn có thể sử dụng mẫu có độ tinh sạch không cao để sử dụng.

- Mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb

DNA mẫu

Xác định DNA với một lượng thấp, khoảng nhỏ hơn 100 ng (1g = 109ng).

Đoạn mồi

- Đoạn mồi tức là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18-30)

+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có

nhiệt độ nóng chảy gần như nhau

+ Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần

khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp

lại trên gen

+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi

+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base

+ Khoảng cách giữa hai mồi tốt nhất là 150-500

base

Enzyme DNA-polymerase

Là enzim xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp, phải là men polymerase chịu được nhiệt độ cao

Nếu mất trạng thái cân bằng thì sẽ gây ra lỗi khi sao chép, nếu nồng độ các nucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả.

Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng

MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym polymerase hoạt

động Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định

- Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng

được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác

- Mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị. 

- Ống nghiệm dùng cho các phản ứng cuả cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại

THIẾT BỊ CHO PHẢN ỨNG PCR

- Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của

bộ vi xử lý

Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR

Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn, nhiệt độ tăng lên

sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA, nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA

ra Thời gian ở giai đoạn này khoảng : 1-2 phút.

Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Sau khi 2 sợi

DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Nhiệt

độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính khoảng 45-60°C Thời gian bắt cặp từ 1-2phút

Giai đoạn kéo dài chuỗi (extension): tổng hợp chuỗi AND mới giống

chuỗi AND gốc DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Như một quy

tắc 1000bp/ 1 phút

Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR

Ưu

điểm

Đơn giản và ít tốn kém

Thời gian thực hiện nhanh

Độ tinh sạch của mẫu không cần cao

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học Không cần dụng cụ và môi trường chuẩn đoán phức tạp

Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện vi sinh vật gây bệnh

Có thể phát hiện những vi khuẩn khó nuôi cấy Việc tăng sinh là đơn giản không cần thiết

• Kích thước của trình tự cần khuếch đại: phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb.

• Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên đa số trường hợp cần tăng sinh

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR

Phát hiện VSV gây bệnh

Phát hiện VSV gây bệnh

Di truyền

Phát hiện các

khuyết điểm gen

Khảo cổ học

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tổng cộng có 260 mẫu thực phẩm được được mua ở các chợ tại địa bàn thành phố Cần Thơ vào buổi sáng và chiều:

• 40 mẫu thịt heo, 40 mẫu thịt bò, 60 mẫu thịt gà, 20 mẫu lòng trắng, đỏ trứng gà,

• 20 mẫu vỏ trứng gà, 20 mẫu nem chua, 20 mẫu chả lụa, 10 mẫu ba khía, 10 mẫu da heo và 20 mẫu sò huyết

Vật liệu

Nguồn vi sinh vật

Viện Pasteur TPHCM

Các giống vi khuẩn S enteritidis, S typhimurium

PhƯƠng pháp

Chuẩn bị mẫu

Cân 25g mẫu Thêm vào túi 225 ml dung dịch môi trường BPW Đồng hóa mẫu bằng máy Stomacher trong 30s

Ủ ở 37 o C trong 5h

Chuyển 1ml dung dịch qua bình tam giác 50ml có chứa 9ml môi

truờng TT và nuôi ở 42 o C trong 4h

Cho 1ml dung dịch mẫu nuôi cấy từ môi trường TT qua bình tam giác 50ml có

chứa 9 ml môi truờng RV, nuôi ở 42 o C trong 15h

Ly trích DNA

• Cho 800 µl phenol (pH=7) vào, lắc đến khi có màu trắng đục, ly tâm 13.000 vòng/p trong 10p

• Hút phần dung dịch phía trên cho vào tuýp nhựa 1.5ml có sẵn 150 µl TE Thêm vào khoảng 700 µl Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol lắc cho đến khi dung dịch có màu trắng đục, ly tâm 13.000 vòng/p trong 10p

• Sau khi ly tâm, chuyển phần trong phía trên sang tuýp nhựa 1.5 ml mới có chứa sẵn

75 µl Natri acetate (3M, pH=7.2), lắc đều bằng tay Thêm vào 1ml ethanol 96 %, lắc đều, đặt trong nước đá 10p Ly tâm 13000 vòng/p trong 15p, giữ lại phần tủa Thêm ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/p trong 5p, làm khô phần tủa và hoà tan DNA với

30 µl nước cất vô trùng, trữ ở -20 o C

Ly trích DNA

(phương pháp phenol-chroroform)

Thiết kế các đoạn mồi PCR từ vi

khuẩn Salmonella

• Các đoạn mồi được thiết kế cho Salmonella spp và S enterica dựa

trên trình tự gen invA và gen spvC

• Trình tự nucleotid của gen invA và spvC đã sẵn có từ GenBank

Accession number M90846 là của gen invA

Accession number FN432031 là của gen spvC

Phối hợp hai cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR giúp phát hiện

cùng một lúc cả hai dòng vi khuẩn Salmonella spp và S enteritia

giúp tiết kiệm thời gian và kinh phí

Cặp mồi spvC rất chuyên biệt

PhẢn Ứng PCR ĐA MỒI

50-100ng DNA

2.5 buffer 10X (Tris 100mM, KCl 500mM, pH 9.0, 1% (v/v) Triton X-100)

0.25 Taq DNA polymerase (5U/ ), 0.25 BSA(0.1%)

3 MgCl2 25mM, 4 dNTP (0.2 mM mỗi loại), 8 M của mỗi loại mồi

(mồi ngược và mồi xuôi)

50-100ng DNA

2.5 buffer 10X (Tris 100mM, KCl 500mM, pH 9.0, 1% (v/v) Triton X-100)

0.25 Taq DNA polymerase (5U/ ), 0.25 BSA(0.1%)

3 MgCl2 25mM, 4 dNTP (0.2 mM mỗi loại), 8 M của mỗi loại mồi

(mồi ngược và mồi xuôi)

Thành phần của phản ứng PCR đa mồi gồm:

Thêm nước cất vô trùng cho đủ thể tích 25

94 o C trong 2p

94 o C trong 2p

Gắn mồi ở 60 o C trong 1p và kéo dài ở 72 o C trong 1p30s

Gắn mồi ở 60 o C trong 1p và kéo dài ở 72 o C trong 1p30s

Sau cùng phản ứng được duy trì 72 o C trong 7p

Sau cùng phản ứng được duy trì 72 o C trong 7p

Tiến hành phản ứng

PhẢn Ứng PCR ĐA MỒI

Phân tích sẢn phẨm PCR

Sử dụng thang chuẩn 100bp

• Những mẫu nào xuất hiện hai vạch 600bp và 400bp chứng tỏ mẫu

đó có chứa vi khuẩn S enteritica

• Những mẫu chỉ xuất hiện một vạch 600bp chứng tỏ mẫu chỉ chứa vi khuẩn Salmonella spp nhưng không chứa chủng S enteritica

Kết quả nghiên cứu cho thấy

Qui trình PCR mang lại kết quả chính xác, nhanh gọn và độ nhạy rất cao

Hiện trạng ô nhiễm trong thức ăn là khá cao

Phần lớn thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp., thực phẩm

nhiễm S enteritica có mang gen spvC khá thấp

_THE END_

THANK YOU FOR YOUR LISTENING!

HAVE A NICE DAY!

Phương pháp ELISA

• Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng

nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng

độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.