ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:• KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không •Urea -, Indol -, VP - •LDC +, ONPG - Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: • KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S,

1,GIỚI THIỆU VI KHUẨN SALMONELLA

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực khuẩn gram

âm, hô hấp hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử

Các loại thực phẩm đều yêu cầu phải kiểm nghiệm

Salmonella với tiêu chuẩn không phát hiện/25g (ml)

Động vật nuôi trong nhà cũng có

thể mang vi khuẩn salmonella.

Nguồn lây ngoài thực phẩm

Salmonella là loại vi khuẩn có thể sống trong

các ống ruột của người và động vật khác

Bất kỳ thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật như thịt lợn, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm sữa, trứng, hải sản cùng với một số rau, quả có

thể chứa salmonella.

Nơi sống

Nguồn chứa

1,GIỚI THIỆU VI KHUẨN SALMONELLA

Xác định Salmonella thông thường chỉ

dừng ở mức độ định tính, tên chủng chỉ được xác định trong những trường hợp

quan trọng

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml dung dịch BPW ủ

37C, 18-24 giờ

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml dung dịch BPW ủ

37C, 18-24 giờ

Cấy 0,1 ml canh khuẩn BPW sang RV (10ml) , ủ

42C, 18-24 giờ và sang Selenit cystein/TT, ủ 37C /

24 giờ

Cấy 0,1 ml canh khuẩn BPW sang RV (10ml) , ủ

42C, 18-24 giờ và sang Selenit cystein/TT, ủ 37C /

24 giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường

chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS…

Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường

chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS…

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHB

hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37C

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHB

hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37C

2.QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

• KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

•Urea (-), Indol (-), VP (-)

•LDC (+), ONPG (-)

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

• KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

•Urea (-), Indol (-), VP (-)

•LDC (+), ONPG (-)

Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh:

(ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB)

Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh:

(ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB)

Salmonella dương tính/ âm tính trên 25g (ml) thực

phẩm

Salmonella dương tính/ âm tính trên 25g (ml) thực

phẩm

NGUYÊN TẮC

TĂNG SINH

TĂNG SINH CHỌN LỌC

BƯỚC 1: TĂNG SINH

Cân 25g mẫu đã nghiền, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml dung dịch BPW và lắc đều để ở 370C

trong 18 – 24 giờ

Cân 25g mẫu đã nghiền, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml dung dịch BPW và lắc đều để ở 370C

trong 18 – 24 giờ

Hút 0,1ml canh khuẩn BPW sang

môi trường selenit-cystin/TT, nuôi trong 24h ở 370C

Hút 0,1ml canh khuẩn BPW sang

môi trường selenit-cystin/TT, nuôi trong 24h ở 370C

BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC

BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC

-Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên

một đặc điểm phát triển của Salmonella

-Một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường

này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác

Để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện

diện trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh

chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống

từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho

Salmonella như XLD, HE, BS

Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc

Salmonella trên từng môi trường cũng

khác nhau

Môi trường

XLD

Môi trường

XLD

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu

hồng

Khẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi trường

XLD

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Khuẩn lạc đặc trưng

của Salmonella

trên môi trường HE

Môi trường BS

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng

có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu

và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ

Khẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi

trường BS

Từ mỗi môi trường

phân lập cấy chuyển

VP, LDC,

Phần nghiêng / phần sâu / hơi /

H2SJvgvn

phần nghiêng của môi trường TSI

có màu đỏ, phần sâu có màu vàng

Chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI

Salmonella

xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường TSI.

có khả năng H2S

Salmonella

THỬ NGHIỆM TSI/KIA

Cột thạch:

Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)

Màu đỏ hoặc không đổi màu:glucose âm tính (không lên men glucose0

Màu đen: tạo thành sunfua hidro

Có bọt khí hoặc có vết nứt:sinh khí từ glucose

THỬ NGHIỆM UREASE

Phát hiện VSV có mang enzym urease

THỬ NGHIỆM UREASE

g

Môi trường sử dụng urea Broth (Rustigian – Stuart )

Ủ ở

37oC trong 48h

Quan sát

THỬ NGHIỆM UREASE

Thử nghiệm ure

Salmonella không phản ứng với ure nên không làm thay

đổi pH môi trường Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ

nguyên màu

Salmonella không phản ứng với ure nên không làm thay

đổi pH môi trường Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ

nguyên màu

Phản ứng dương tính việc phân giải ure sẽ sinh ra

NH3 làm thay đổi màu phenol red sang màu hồng

và sau đó sang màu tím hoa cà.

THỬ NGHIỆM UREASE

Thử nghiệm LDC

Lấy một que cấy đầy

khuẩn lạc trên môi

trường TSA cấy

Salmonella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi

trường sang tím hay đỏ tía, phản ứng dương tính

Salmonella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi

trường sang tím hay đỏ tía, phản ứng dương tính

Phản ứng âm tính khi môi trường màu

Mục đích

Cở sở sinh hóa

Môi trường

Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính

(acetoin) trong quá trình lên men glucose

Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP) 

Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn 2 pyruvate → acetoin + 2 CO2.

Thử nghiệm VP

Thêm 2 giọt creatin , 6 giọt dd - naphthol trong cồn ,sau đó thêm 2 giọt KOH 40%

Ủ ở 37oC trong 24h

Lấy 0,2ml dịch cấy vào 1 ống nghiệm,

Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống môi trường MR-VP

CÁCH TIẾN

HÀNH

Thử nghiệm VP

Salmonella cho phản ứng âm tính với thừ nghiệm VP ,

không đổi màu trên bề mặt môi trường.

• Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi

trường

Thử nghiệm VP

THỬ NGHIỆM SINH INDOL

Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol

 các VSV có hệ emzym tryptophanase

Mục đích

Chủng VSV MT canh trypton

Thuốc thử Kovac’s

Pứ dương tính

37oC / 24h

Pứ âm tínhCÁCH TIẾN HÀNH

THỬ NGHIỆM SINH INDOL

Salmonella cho phản

ứng âm tính với thử

nghiệm

Phản ứng dương tính khi có vòng đỏ trên bề mặt môi

trường

THỬ NGHIỆM SINH INDOL

Kết quả:

(a) An uninoculated tube of tryptone broth

(b)   A positive indole test c) A negative indole test. 

Tham gia vào quá trình

lên men lactose ở vi

sinh vật

• Sự thủy phân cơ chất đường lactose bởi enzyme β-

galactosidase sẽ phóng thích nitrophenol có màu vàng

• ONPG → nitrophenol

o-Không màu Màu vàng

THỬ NGHIỆM β-GALACTOSIDASE

Thả một đĩa giấy 0NPG vào ống nghiệm

Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy 37±1oC

Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy 37±1oC

Đọc kết quả

Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm

β-galactosidase

Phản ứng dương tính đổi màu môi trường sang vàng

PHẢN ỨNG β-GALACTOSIDASE VỚI ONPG

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng

Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra kháng nguyên O

Kiểm tra kháng nguyên O

Kiểm tra kháng nguyên H

Kiểm tra kháng nguyên

H Kiểm tra kháng

nguyên Vi

Kiểm tra kháng nguyên Vi

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Nếu các vi khuẩn vón lại thành các đơn vị ít nhiều có

kết dính thì chủng này được coi là tự kết dính, không

cần phải thử tiếp vì việc phát hiện kháng nguyên

không thể thực hiện được

Lắc nhẹ phiến kính trong 30-

60 giây

Quan sát

Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết

không tự ngưng kết

Tiến hành như phương pháp kiểm

tra sự tự dính ở trên bằng cách thay

một giọt kháng huyết thanh O thay

cho dung dịch muối

Kiểm tra kháng nguyên O

Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự kết

dính bằng cách thay một giọt huyết thanh Vi

thay cho dung dịch nước muối

Nếu xuất hiện kết dính, phản ứng coi là

dương tính

Kiểm tra kháng nguyên Vi

Kiểm tra kháng nguyên H

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Cấy từ 1 khuẩn lạc không tự

dính kết thuần khiết lên thạch

dinh dưỡng thể nữa dặc Ủ ấm 18-24 giờ, 37+- 1

 Nghiên cứu và phát hiện Salmonella trên một số mẫu thịt

gà tươi sống trên địa bàn hai quận Phú Nhuận và Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh

 Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Khoa Môi trường

và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

3.VÍ DỤ

Nội dung thực hiện 3.VÍ DỤ

25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong

30 giây độ pha loãng 10-1

25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong

30 giây độ pha loãng 10-1

Đem ủ ở 37oC trong 24 giờĐem ủ ở 37oC trong 24 giờ

Lấy 0.1ml canh trường cho vào môi trường

KL đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD : tròn,

lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao

trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu

đỏ

Quy trình phân

tích

Cấy chuyển vào môi trường test sinh hóa : môi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC,

Trypton, VP

Biểu hiện đặc trưng của Salmonella : trên TSI:

đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-);

LDC(+); Indol(-); VP(-)

Ủ ở 37oC trong 24 giờ

Chuẩn bị mẫu

Cấy mẫu

Thử nghiệm khẳng định Kết quả

Các bước tiến hành

Chuẩn bị mẫu

Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không

lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào

bao nilong vô khuẩn

Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không

lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào

bao nilong vô khuẩn

Thêm vào 225ml môi trường PBW đã

-Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD

-Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của

Salmonella

Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi

trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở

37 ± 0,5oC trong 24 giờ

Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi

trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở

37 ± 0,5oC trong 24 giờ

Thử nghiệm khẳng định.

- Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm

Lên men mannitol

Thử nghiệm trên môi trường TSI Thử nghiệm Urea Broth

Thử nghiệm LDC Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI

Salmonella không phân giải urea nên không làm

thay đổi pH môi trường Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím

Thử nghiệm Urea Broth

Lên men mannitol

 Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4,

 Chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8

Môi trường sau khi nuôi cấy salmonella

bị acid hóa và chuyển thành màu vàng

Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống Durnham

Phản ứng (+): môi

trường giữ nguyên

màu tím ban đầu,

canh khuẩn đục .

Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng.

Sau khi nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành

kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu

Thử nghiệm LDC

Mục đích: cắt nhóm carboxyl ra khỏi gốc lysine

Thử nghiệm LDC

Thử nghiệm Indol

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Negative

KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ

NHIỄM SALMONELLA

Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với

quy đinh mức độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25g

The End

&

Thank You!