Quy trình định tính Salmonella trong công nghệ thực phẩm

MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤTMôi trường và hóa chất Mục đích DD Buffered Peptone Water Canh Rappaport – Vasilia Soya Peptone RVS Tăng sinh chọn lọc Selenit xystin/ Tetrathionat TT Xylose Lysine

Bộ môn; PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Đề tài: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH

SALMONELLA

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

Nhóm: 5

NỘI DUNG

Các bước tiến hành

Quy trình phân tích Môi trường và hóa chất Nguyên tắc

Phạm vi áp dụng Tổng quan về Salmonella

Kết quả

Tình hình ngộ độc Salmonella

TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC

SALMONELLA

 Salmonella có trong nhiều loại thực phẩm (đồ nguội,

thịt nguội, nghêu sò, gà chưa nấu chín, chế phẩm từ sữa sống…) nhất là các món ăn chế biến từ trứng tươi hoặc còn hơi tươi sống

 Triệu chứng của ngộ độc do salmonella: Tiêu chảy,

Đau bụng, Buồn ói và ói, Sốt, Đau đầu… Ngộ độc

salmonella là một vấn đề xã hội rất phức tạp và khó

giải quyết

 Không lên men Saccharose

và lactose, không sinh

Indol, không phân giải Ure.

 Không cho phép có mặt

Salmonella trong 25g/25ml

mẫu

 Kém chịu nhiệt.

NGUYÊN TẮC

Kết luận: Có hay không sự hiện diện của

Salmonella trên lượng mẫu đã lấy.

Bắt buộc trải qua 5 giai đoạn, và phải sử dụng

chủng đối chứng trong suốt quá trình phân tích.

+ Tiền tăng sinh

+ Tăng sinh

+ Phân lập

+ Phục hồi

+ Khẳng định

MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

Môi trường và hóa chất Mục đích

DD Buffered Peptone Water

Canh Rappaport – Vasilia Soya

Peptone (RVS) Tăng sinh chọn lọc

Selenit xystin/ Tetrathionat (TT)

Xylose Lysine Desoxycholate

Hektoen Entric Agar (HE)

Tryptone Soy Agar (TSA) Phục hồi

Voges – Proskauer (VP) Thử nghiệm sinh hóa để khẳng

định SalmonellaUre Broth

MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

Môi trường và hóa chất Mục đích

Lysine Decarboxylase broth

(LDC) Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella

Tryptone Water

Kligler Iron Agar (KIA)/TSI

Đĩa giấy ONPG

Dung dịch creatin Thuốc thử các phản ứng sinh

hóaKháng huyết thanh

Dung dịch α – naphtol

KOH 40%

Thuốc thử Kovac’s

HCL và NaOH 10% Chỉnh pH

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Cân 25g/25ml mẫu

Ủ ở (37 ± 1 C/18 ± 2h) ⁰ Thêm 225ml BPW Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu

10ml môi trường RVS broth

Thử 4 khuẩn lạc còn lại

đã được đánh

Thử một khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ

Tryptone broth VP

ONPG LDC

Ure agar TSI

Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h ⁰ Báo cáo kết quả

Âm tính

Không phát hiện

Salmonella trong

25g/25ml

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

TĂ N G S IN H C H Ọ N

L Ọ C

P H Â N

L Ậ P

P H Ụ C H Ồ I

K H Ẳ N G Đ ỊN H

BƯỚC 2 BƯỚC 3 BƯỚC 4 BƯỚC 5

TIỀ

N

T Ă N G S IN H

BƯỚC 1

BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH

Cân 25g/25ml mẫu

Đồng nhất bằng máy dập mẫu

Stomacher 60s Thêm 225ml BPW Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu

Stomatcher

BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC

DD TIỀN TĂNG SINH

1ml

0.1m l

Môi trường RVS broth Môi trường MKTTn Broth

BƯỚC 3: PHÂN LẬP

 Dùng que cấy vòng cấy phân

lập từ mỗi canh tăng sinh

chọn lọc XLD và HE Sau khi

cấy, lật ngược các đĩa sao

cho đáy hướng lên trên và ủ

ở 37 ± 1 C/24 ± 3h.⁰

 Kiểm tra các đĩa: Trên MT

XLD, khuẩn lạc Salmonella

điển hình có màu hồng trong

suốt, trên MT HE có màu

xanh lam, có hoặc không có

tâm đen Đánh dấu vị trí các

khuẩn lạc này trên đáy đĩa Salmonella on XLD agar Salmonella on HE Agar

BƯỚC 4: PHỤC HỒI TRÊN MÔI TRƯỜNG

DINH DƯỠNG NA/TSA

 Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường phân lập XLD và HE Nếu mỗi đĩa có

ít hơn 5 KL điển hình hoặc KL nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc đó cấy ria lên NA/TSA Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h.⁰

 TH1: Từ mỗi đĩa thử 1 khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện

Salmonella trong mẫu.

 TH2: Nếu KL đầu cho kết quả không phù hợp thì tiến

hành thử 4 KL còn lại, nếu 1 trong 4 KL này cho kết quả

thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận có Salmonella trong mẫu, ngược lại kết luận không có Salmonella trong

mẫu

Salmonella

on TSA

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ KHÁNG

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ KHÁNG

HUYẾT THANH

 Thạch TSI

Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn

Cacbonhydrate cụ thể kết hợp với môi trường tăng trưởng căn bản, cớ hoặc không có sinh hơi và H2S

Cách cấy mẫu: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy, ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h.⁰

Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi

trường TSI → phần nghiêng của thạch có màu đỏ, phần sau có màu vàng

Salmonella có khả năng sinh H2S → Xuất hiện các vệt

màu đen trong môi trường TSI

Có thể thấy hiện tượng sinh khí qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ

 Cách cấy mẫu: Cấy ngay

phía dưới của bề mặt môi

trường lỏng, phủ một lớp

paraffin hay dầu khoáng

lên bề mặt môi trường Ủ ở

37 ± 1 C/24 ± 3h ⁰

 Dương tính: Môi trường

giữ nguyên màu tím

 Âm tính: Môi trường có

màu vàng

Salmonella on (LDC)

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ

Dương tính: Môi trường từ

màu đỏ chuyển sang màu

hồng, sau đó chuyển thành

màu đỏ hồng

Âm tính: Môi trường không

đổi màu (vàng cam) Salmonella on Ure Broth

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ

KHÁNG HUYẾT THANH

Môi trường phản ứng Indol

Nguyên tắc: Phát hiện khả

năng oxi hóa tryptophan thành

các dạng của Indol: Indol,

Skatol (methyl indol) và

indol-acetate

Cách cấy mẫu: Cấy khuẩn lạc

nghi ngờ vào ống chứa 5ml

môi trường tryptone water Ủ

ở 37 ± 1 C/24 ± 3h Sau khi ủ, ⁰

thêm 1ml thuốc thử Kovac’s

Dương tính: Bề mặt môi

trường xuất hiện màu đỏ

Âm tính: Xuất hiện màu khác

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ

KHÁNG HUYẾT THANH

Phát hiện β-galactosidase

Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men

Lactose của vi sinh vật

Cách cấy mẫu: Cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vô trùng có chứa 0.25ml dung dịch muối sinh lý Thêm 1 giọt Toluen và lắc ống Đặt ống này vào nồi cách thủy ở

37 C/vài phút Thêm 0.25ml thuốc thử để phát ⁰hiện β-galactosidase và lắc đều Đặt lại ống vào nồi cách thủy để ở 37 C/24 ± 3h.⁰

Dương tính: Màu vàng (xuất hiện sau 20 phút)

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ KHÁNG

HUYẾT THANH

Voges – Prokauer

Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật

Cách cấy mẫu: Cấy VSV vào môi trường glucose

phosphate (MR –VP Broth) Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h Sau ⁰

đó thêm 2 giọt Creatin, 3 giọt α-naphthol và sau đó thêm

2 giọt dung dịch Kali hydroxide, lắc đều sau mỗi lần thêm thuốc thử

Dương tính: Xuất hiện màu hồng đến mà đỏ sang trong

15 phút

Âm tính: Dịch vi khuẩn không đổi màu

BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ

KHÁNG HUYẾT THANH

 Thử phản ứng kháng huyết thanh

Loại trừ chủng tự ngưng kết: Nhỏ một giọt nước muối sinh lí lên phiến kính thủy tinh đã được làm sạch một cách cẩn thận, dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu được huyền phù đục và đồng nhất Lắc nhẹ phiến kính Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp Nếu có sự vón cục thì chủng xem như ngưng kết, không cần thử phản ứng huyết thanh tiếp theo Ngược lại cần phải tiếp tục phản ứng thử huyết thanh

Kiểm tra O, H,…

Kết luận

Mẫu được kết luận dương tính với Salmonella khi có khuẩn lạc

đặc trưng trên môi trường phân lập và cho những kết quả sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng, có/không có H2S và sinh hơi, Ure (-), Indol (-), VP (-), ONPG (-), LDC (+)

KẾT QUẢ

Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella

trong 25g/25ml mẫu

Ví dụ

TRONG MẪU THỊT GIA CẦM

Ví dụ

© Giang Nam™