PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực khuẩn gram

âm, hô hấp hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử

Các loại thực phẩm đều yêu cầu phải kiểm nghiệm

Salmonella với tiêu chuẩn không phát hiện/25g (ml)

1,Giới thiệu vi khuẩn Salmonella

Salmonella là loại vi khuẩn có thể sống trong

các ống ruột của người và động vật khác

Bất kỳ thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật

như thịt lợn, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm

sữa, trứng, hải sản cùng với một số rau, quả có

thể chứa salmonella.

Nơi

sống

Nguồn chứa

1,Giới thiệu vi khuẩn Salmonella

Xác định Salmonella

thông thường chỉ dừng

ở mức độ định tính, tên chủng chỉ được xác định trong những

trường hợp quan trọng

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml dung dịch BPW ủ

37°C, 18-24 giờ

Cấy 0,1 ml canh khuẩn BPW sang RV (10ml) , ủ

42°C, 18-24 giờ và sang Selenit cystein/TT, ủ 37°C /

24 giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường

chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS…

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHB

hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37°C

2.QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

• KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

•Urea (-), Indol (-), VP (-)

•LDC (+), ONPG (-)

Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh:

(ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB)

Salmonella dương tính/ âm tính trên 25g (ml) thực

phẩm

NGUYÊN TẮC

TĂNG SINH

TĂNG SINH CHỌN LỌC

KHẲNG ĐỊNH PHÂN LẬP

BƯỚC 1 BƯỚC 2 BƯỚC 4 BƯỚC 3

Qui trình phân tích Samonella gồm 4 bước:

Cân 25g mẫu đã nghiền, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml dung dịch BPW và lắc đều để ở 370C

trong 18 – 24 giờ

BƯỚC 1: TĂNG SINH

Hút 0,1 ml canh khuẩn BPW

sang môi trường RV, nuôi trong 24h ở 420C

Hút 0,1ml canh khuẩn BPW sang

môi trường selenit-cystin/TT, nuôi trong 24h ở 370C

BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC

-Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa

trên một đặc điểm phát triển của Salmonella

-Một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường

này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác

Để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng

Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần

phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc

khác nhau cho cùng một mẫu

BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống

từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho

Salmonella như XLD, HE, BS

Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc

Salmonella trên từng môi trường cũng

khác nhau

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Môi trường

XLD

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu

hồng

Khẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi trường

XLD

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Môi trường

HE

Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Khuẩn lạc đặc trưng

của Salmonella trên

môi trường HE

Môi trường BS

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng

có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu

và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ

Khẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi

trường BS

Từ mỗi môi trường

phân lập cấy chuyển

VP, LDC,

Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S

Jvgvn

phần nghiêng của môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng

Chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI

Salmonella

xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường TSI

có khả năng H2S

Salmonella

THỬ NGHIỆM TSI/KIA

Cột thạch:

Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)

Màu đỏ hoặc không đổi màu:glucose âm tính (không lên men glucose0

Màu đen: tạo thành sunfua hidro

Có bọt khí hoặc có vết nứt:sinh khí từ glucose

THỬ NGHIỆM UREASE

Phát hiện VSV có mang enzym urease

Mục

đích

(NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2

 tăng pH môi trường  đỏ phenol

 (vàng – đỏ)

Cơ sở

sinh hoá

Môi trường sử dụng urea Broth (Rustigian – Stuart )

THỬ NGHIỆM UREASE

g

Ủ ở 37oC trong 48h

Quan sát

THỬ NGHIỆM UREASE

Thử nghiệm ure

Salmonella không phản ứng với ure nên không làm thay

đổi pH môi trường Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ

Lấy một que cấy

đầy khuẩn lạc trên

môi trường TSA cấy

Salmonella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi

trường sang tím hay đỏ tía, phản ứng dương tính

Phản ứng âm tính khi môi trường màu

vàng.

KẾT

QUẢ

Mục đích

Cở sở sinh hóa

Môi trường

Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính

(acetoin) trong quá trình lên men glucose

Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP)

Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn

toàn 2 pyruvate → acetoin + 2 CO2.

Thử nghiệm VP

Thêm 2 giọt creatin , 6 giọt dd - naphthol trong cồn ,sau đó thêm 2 giọt KOH 40%

Ủ ở 37oC trong 24h

Lấy 0,2ml dịch cấy vào 1 ống nghiệm,

Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống môi trường MR-VP

CÁCH TIẾN

HÀNH

Thử nghiệm VP

Salmonella cho phản ứng âm tính với thừ nghiệm VP ,

không đổi màu trên bề mặt môi trường.

• Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi

trường

Thử nghiệm VP

THỬ NGHIỆM SINH INDOL

Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol

 các VSV có hệ emzym tryptophanase

Mục đích

Chủng VSV MT canh trypton

Thuốc thử Kovac’s

Salmonella

cho phản ứng

âm tính với thử nghiệm

Phản ứng dương tính khi có vòng

đỏ trên bề mặt môi trường

THỬ NGHIỆM SINH INDOL

Tham gia vào quá trình

lên men lactose ở vi

sinh vật

• Sự thủy phân cơ chất đường lactose bởi enzyme β-

galactosidase sẽ phóng thích nitrophenol có màu vàng

• ONPG → nitrophenol

o-Không màu Màu vàng THỬ NGHIỆM β-GALACTOSIDASE

Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy 37±1oC

Đọc kết quảCÁCH TIẾN HÀNH

THỬ NGHIỆM β-GALACTOSIDASE

Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm

β-galactosidase

Phản ứng dương tính đổi màu môi trường sang vàngPHẢN ỨNG β-GALACTOSIDASE VỚI ONPG

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra kháng nguyên O

Kiểm tra kháng nguyên

H Kiểm tra kháng

nguyên Vi

Nếu các vi khuẩn vón lại thành các đơn vị ít nhiều có

kết dính thì chủng này được coi là tự kết dính, không

cần phải thử tiếp vì việc phát hiện kháng nguyên

không thể thực hiện được

Lắc nhẹ phiến kính trong 30-

60 giây

Quan sát

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết

không tự ngưng kết

Tiến hành như phương pháp kiểm

tra sự tự dính ở trên bằng cách thay

một giọt kháng huyết thanh O thay

cho dung dịch muối

Kiểm tra kháng nguyên O

Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự kết

dính bằng cách thay một giọt huyết thanh Vi

thay cho dung dịch nước muối

Nếu xuất hiện kết dính, phản ứng coi là

dương tính

Kiểm tra kháng nguyên Vi

Cấy từ 1 khuẩn lạc không tự

dính kết thuần khiết lên thạch

dinh dưỡng thể nữa dặc Ủ ấm 18-24 giờ, 37+- 10C

Kiểm tra kháng nguyên H

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự dính kết,nhưng sử dụng một giọt huyết thanh H thay cho dung dịch nước muối sinh lý

Nếu xuất hiện kết dính, phản ứng coi là dương tính

 Nghiên cứu và phát hiện Salmonella trên một số mẫu thịt

gà tươi sống trên địa bàn hai quận Phú Nhuận và Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh

 Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Khoa Môi trường

và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

3.VÍ DỤ

Nội dung thực hiện 3.VÍ DỤ

Mẫu thịt gà

Thu mẫu tại các địa điểm

khảo sátĐánh giá các chỉ tiêu

Cảm quan Salmonella

Nhận xét, Kết luận

25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong

30 giây độ pha loãng 10-1

Đem ủ ở 37oC trong 24 giờLấy 0.1ml canh trường cho vào môi trường RV

Ủ ở 42oC ± 0,5 trong 24 giờ

Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 37 oC

trong 24 giờ

KL đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD : tròn,

lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao

trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu

đỏ

Quy trình phân tích

Cấy chuyển vào môi trường test sinh hóa : môi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC,

Trypton, VP

Biểu hiện đặc trưng của Salmonella : trên TSI:

đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-);

LDC(+); Indol(-); VP(-)

Ủ ở 37oC trong 24 giờ

Chuẩn

bị mẫu

Cấy mẫu

Thử nghiệm khẳng định Kết quả

Các bước tiến hành

Chuẩn bị mẫu

Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không

lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào

bao nilong vô khuẩn

Thêm vào 225ml môi trường PBW đã

-Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD

-Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của

Salmonella

Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi

trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở

37 ± 0,5oC trong 24 giờ

Thử nghiệm khẳng định.

- Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm

Lên men mannitol

Thử nghiệm trên môi trường TSI Thử nghiệm Urea Broth

Thử nghiệm LDC Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI

Salmonella không phân giải urea nên không làm

thay đổi pH môi trường Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím

Thử nghiệm Urea Broth

sinh acid và sinh hơi

Lên men mannitol

 Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4,

 Chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8

Môi trường sau khi nuôi cấy salmonella

bị acid hóa và chuyển thành màu vàng

Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống Durnham

Sinh acid (+):

môi trường màu cam chuyển sang vàng

Phản ứng (+): môi

trường giữ nguyên

màu tím ban đầu,

canh khuẩn đục .

Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng.

Sau khi nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành

kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu

Thử nghiệm LDC

Mục đích: cắt nhóm carboxyl ra khỏi gốc lysine

Thử nghiệm LDC

Thử nghiệm Indol

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Negative

KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ

NHIỄM SALMONELLA

Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với

quy đinh mức độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25g

The End

&

Thank You!