CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

• Phương pháp MPN most probable number: phương pháp định lượng theo sốlượng VSV có xác xuất cao nhất dựa vào kếtquả định tính của một loạt thí nghiệm được lặplại ở một số độ pha loãng kh

Chương 5:

CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH

THỰC PHẨM

Chuẩn bị mẫu

• Thu mẫu ngẫu nhiên, tại nhiều vị trí để có tínhđại diện

• Mẫu chứa trong bình nhựa hay bao nilon

• Bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển

• Bảo quản -200C cho đến khi phân tích hoặc

• Phương pháp MPN (most probable number): phương pháp định lượng theo số

lượng VSV có xác xuất cao nhất dựa vào kếtquả định tính của một loạt thí nghiệm được lặplại ở một số độ pha loãng khác nhau

Các loại môi trường nuôi cấy VSV

• Về bản chất của thành phần môi trường:

- Môi trường tự nhiên

- Môi trường tổng hợp

- Môi trường bán tổng hợp

Mt tổng hợp hoặc bán tổng hợp dưới dạngđông khô thương phẩm của các hãng MERCK,OXOID,DIFCO, BBL, HIGH-MEDIA

- Môi trường tiền tăng sinh

- Môi trường tăng sinh

- Môi trường chọn lọc

- Môi trường thử nghiệm sinh hóa

QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ

TIÊU VI SINH VẬT

1 TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

• Chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh

giá chất lượng của mẫu về VSV, nguy cơ hư

hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm

• Xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

• Biểu diễn bằng đơn vị CFU/g hay CFU/ml

Cấy mẫu bằng pp hộp đổvới 10-15ml

mt Plate Count Agar

Đếm khuẩn lạc

Đồng nhất mẫu Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân

Dung dịch nước muối pepton Lắc đều, ít nhất 2 phút

Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào các đĩa petri vô trùng ( mỗi nồng độ 2 đĩa)

Ủ 30 0 C, 72h

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

A: số tế bào VK trong 1g hay 1ml mẫu

N: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ I

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

A =

• Mt nước muối pepton (SPW)

- 8,5g NaCl

- 1g pepton

- Nước cất cho đủ 100ml

2 COLIFORMS VÀ E.COLI

• Coliforms là nhóm VK Gram âm, hiếu khí

hoặc kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, lên men lactose sinh hơi trong 24- 48h ở 35 0 C

• Nhóm Coliforms bao gồm 4 giống là

Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae và Citrobacter

• Coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên

men sinh hơi khi ủ 44 0 C trong mt EC (E.coli medium)

• Coliforms phân là những coliform chịu nhiệt có khả năng

sinh Indol trong mt trypton

• E.coli là coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC

(++ )

• Nhóm Coliform sinh hơi khi nuôi trong mt canh thang

lactose mật bò BGBL (Brilliant Green Bile Broth Lactose)

và LSB ( Lauryl Sulphate Broth)

• Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, MPN (Most

Probable Number)

• Cơ sở khoa học:

Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy

phân acid amin tryptophan sinh indol, acid pyruvic và NH3+ Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO) của p – dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ.

• Thử nghiệm MR (Methyl-Red)

- Kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo

ra từ quá trình lên men glucose của vi sinh vật

- Thực hiện: Nuôi VSV trên canh thang (broth)MR-VP, thêm 5 giọt dung dịch đỏ methyl 0,2%(chỉ thị pH), phản ứng (+) khi mt có màu đỏ

• Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer):

- Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose củamột số vi sinh vật

- Thực hiện: nuôi VSV trên MR-VP Broth, nhỏ

6 giọt dung dịch a-napthol 5%, 2 giọt KOH 40% Phản ứng (+) khi có màu đỏ xuất hiệnsau 15-20 phút

• Thử nghiệm citrate:

- Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất trong quá trình biến dưỡng của vi sinh vật.

- Môi trường (Simmons citrate) có chứa muối ammonium vô

cơ Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn Carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm Trong mt có Bromthymol blue – chất chỉ thị pH, chuyển từ xanh lục sang xanh dương khi mt kiềm.

- Thực hiện: nuôi VSV trên mt Simmons citrate, ủ 24h, phản ứng (+) khi mt chuyển từ màu xanh lục sang xanh dương.

Qui trình định lượng Coliforms, coliforms chịu nhiệt,

coliforms phân và E.coli bằng pp MPN

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu

để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 …

Chuyển 1ml dung dịch 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 37 0 C, 48h

Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL

ủ 37 + 1 0 C, 48h

Cấy vào ống canh EC

ủ 44,5 + 0,2 0 C, 24h

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Coliforms Coliforms chịu nhiệt

Cấy lên thạch EMB, ủ 37 0 C, 24h

Eosin Methylene Blue Agar: phân biệt có lên men lactose hay không? Sinh acid phản ứng thuốc nhuộm tạo màu ánh kim tím

Hòa tan từng loại rồi trộn chung.

pH cuối 7,2 + 0,2 Phân phối vào các nghiệm chứa ống Durham.

• Mt canh Trypton

- Trypton :10g

- Nước cất: 1 lít

pH 6,9 + 0,2

Qui trình định lượng Coliforms, coliforms phân và E.coli

Chọn ống canh (+)( sinh hơi)

Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đỉa petri bổ sung

5ml mt TSA, lắc đều, để yên 1-2h

Violet Red Bile

Tryptone casein soy agar

Thử nghiệm Indol Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC(+) và

Indol (+)

Đếm số ống canh EC(+) và IMViC (++ ), tra bảng MPN

• Mt TSA (Tryptic Soy Agar)

• Mt VRB (Violet Red Bile Agar)

3 Staphylococcus aureus

• VK hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, hình cầu, Gram dương, có thử nghiệm coagulase, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, sucrose

• Sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin bền

nhiệt, không bị phân hủy 1000C trong 30 phút

• Gây triệu chứng nôn mữa, tiêu chảy kéo dài

Qui trình định lượng Staphylococcus aureus

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu

vàng) ở mỗi độ pha loãng

Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 37 0 C, 48h

Trải lên đĩa thạch BPA, ủ 37 0 C, 24- 48h, trải lên đĩa thạch máu, ủ 37 0 C, 24h

Chọn khuẩn lạc đặc trưng (lồi, đen

bóng có vòng sáng rộng bao quanh)

Đếm số khuẩn lạc đặc trưng

Đếm số khuẩn lạc không đặc trưng

Cấy vào TSA,

ủ 37 + 1 0 C, 24h

Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào TSA,

ủ 37 + 1 0 C, 24h

Thử nghiệm ngưng kết

coagulase

Tỉ lệ khuẩn lạc đặc trưng, coagulase (+)

• Thử nghiệm coagulase: VSV tiết ra enzymcoagulase làm kết tụ các thành phần huyếttương tạo thành các khối đông làm đông huyếttương

- Huyết tương người hay dạng đông khô thươngphẩm hoặc tự điều chế bằng cách ly tâm máuchứa chất chống đông (citrate) để thu huyếttương

- Cho vào ống nghiệm 0,5ml huyết tương, bổsung 0,5ml dịch nuôi cấy chủng thuần Trộnđều, ủ 370C Kết quả (+) khi có xuất hiện khốikết tụ

• Mt MSB (Mannitol Salt Broth)

• Mt Baird- Parker (BPA), pH:7,0

mt trên Đổ đĩa, sử dụng.

4 Streptococcus phân

• Liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, Gramdương, không di động không sinh bào tử, sốnghiếu khí tùy ý nhưng tốt nhất trong đk kỵ khí

• Chỉ thị chất lượng vệ sinh thực phẩm

Qui trình định lượng Streptococcus phân

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha

Đếm khuẩn lạc đặc trưng (màu hồng

• Thử nghiệm catalase :

Trên phiến kính hoặc nhỏ trực tiếp H 2 O 2 30% trực tiếp lên sinh khối VSV Ghi nhận (+) nếu có bọt khí sủi quanh sinh khối

• Thử nghiệm oxidase

Giấy lọc nhúng dung dịch 1% tetramethyl phenylenediamin dihydrochloride hoặc oxalate Dùng que cấy lấy sinh khối dàn đều lên miếng giấy lọc tại vị trí có thuốc thử, ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương

–p-• Mt BHI (Brain Heart Infusion)

• Mt Bile Esculin agar

4 Salmonella

• Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý,

có khả năng di động, không tạo bào tử, lênmen glucose và mannitol sinh acid nhưngkhông lên men saccharose và lactose, khôngsinh Indol, không phân giải ure, hầu hết đềusinh H2S

• Gây ngộ độc thực phẩm với các triệu chứngtiêu chảy, ói mửa, buồn nôn

Qui trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mt tăng

sinh (BPW), ủ 37 0 C, 18-24h

Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang mt tăng

sinh chọn lọc (RV), ủ 42 0 C, 18-24h

Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang BHI

hay TSA, ủ qua đêm

Kết luận Salmonella (+) hay (-)

• Trên mt XLD: khuẩn lạc có màu hồng trongsuốt, có hay không có tâm đen

• Trên mt BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màuđen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím Môitrường chung quanh khuẩn lạc chuyển thànhmàu nâu và sau đó thành đen nếu kéo dài thờigian ủ

• Thử nghiệm KIA/TSI

- KIA chứa 2 loại đường glucose và lactose

- TSI chứa 2 loại đường trên cùng với sucrose

• Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh

(thực hiện song song chứng âm để loại ngưng kết giả) Phản ứng (+) khi tạo ngưng kết với

kháng huyết thanh Poly O và Poly H

4 Shigella

• Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùyý,cho thử nghiệm catalase (+), oxidase (-), lênmen glucose không sinh hơi, không lên men vàsinh acid từ lactose, không sinh H2S

• Tác nhân gây bệnh lỵ Biểu hiện bệnh lý từnhẹ tiêu chảy đến mức nặng đi tiêu ra máu,mất nước, sốt cao, bị co rút thành bụng

Qui trình phát hiện Shigella trong thực phẩm

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mt tăng sinh (TSB), pH 7,2, ủ 37 0 C, 16-20h

Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang 10ml mt tăng sinh chọn lọc (GN), ủ 37 0 C, 16-20h

Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang BHI

hay TSA, ủ qua đêm 37 0 C

Kết luận Shigella (+) hay (-)

trong 25 g mẫu

Thử nghiệm sinh hóa: Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (-), sinh hơi(-)

Không di động trong thạch mềm, Oxydase (-)

Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mt chọn lọc phân biệt (HE,DC), ủ 37 0 , 24h

Thử nghiệm sinh hóa khẳng định

• Trên mt thạch HE : khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt, trong suốt

• Trên mt thạch DC : khuẩn lạc Shigella có màu đỏ nhạt

• Thử nghiệm sinh hóa khẳng định

4 Vibrio

• Phẩy khuẩn, Gram âm, di động, sống kỵ khítùy ý, catalase và oxidase (+), lên men glucosenhưng không sinh hơi, không sinh H2S,

• Tác nhân gây bệnh tả do tạo độc tố tả làchlorae-toxin, có độ tính mạnh, chỉ cần 5µg cóthể gây tiêu chảy ở người trưởng thành

• Triệu chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng,viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy

Qui trình phát hiện và định danh Vibrio trong thực phẩm

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml APW hoặc Colistine

Ủ canh khuẩn ở 37 0 C

Chọn khuẩn lạc đặc trưng (V.parahaemolyticus :xanh; V.cholerae:

vàng), ria trên TSA chứa 1% NaCl hay BHI , ủ qua đêm 37 0 C

Kết luận: V.parahaemolyticus hay V.cholerae

Thử nghiệm sơ bộ: Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (-), sinh hơi(-), di

động trong thạch mềm, Oxydase (+), Gram (-)

• Mt TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Salt- Sucrose)

- Cao nấm men: 5g

- Sucrose: 20g

- Sodium thiosulfate.75H 2 O:10g

- Sodium citrate.72H 2 O:10g

Qui trình định lượng Clostridium

Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy thập phân, xử lý mẫu

• Mt SDB (Sabouraud’s Dexrotrose Broth)

Qui trình định lượng tống số nấm men nấm mốc

Đồng nhất và pha loãng mẫu thành các

độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 …

Đếm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc,

tính mật độ (CFU/g)

Định danh

Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc

DG18, ủ ngửa đĩa ở 25 0 C, 5-7 ngày

Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ 30 0 C,

7 ngày

Các phương pháp hiện đại

• Phương pháp phát quang ATP

• Phương pháp ELISA

• Phương pháp lai phân tử

• Phương pháp PCR

Phương pháp phát quang sinh học ATP

trong giám sát vệ sinh

• ATP là dấu hiệu nhận biết sự tồn tại của vật

chất sống

• Có thể phát hiện nhanh ATP bởi lượng ánh

sáng phát ra khi ATP kết hợp với enzym

luciferase

E + LH 2 + ATP + O 2 Oxyluciferin + AMP + CO 2 + PP i

(E: Luciferase, LH 2 :luciferin)

• Oxyluciferin phát ra ánh sáng vàng xanh vàđược ghi nhận trị số ánh sáng phát ra bằng mộtmáy đo ánh sáng

• ATP của eukaryote được tách chiết bởi cácchất tẩy không ion như Triton X-100 ATP nàyđược tách ra trước và bị thủy phân bởi ATPaseđược bổ sung vào Sau đó mới trích ly ATP từVSV bằng trichloacetic acid 5%

Qui trình phát hiện VSV bề mặt bằng

dụng cụ Clean-Track

Phương pháp ELISA

• Phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợpgiữa một tế bào (kháng nguyên) với một khángthể đặc hiệu

• Tín hiệu của phản ứng miễn dịch được nhậnbiết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính củakháng nguyên- kháng thể hoặc bằng cách sửdụng các kháng thể đã đánh dấu bằng chấtnhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạhay enzym)

Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzym (ELISA) sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài các đĩa giếng Khi có kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, nó sẽ gắn kết với kháng thể đã có trong giếng Sau đó phức hợp này được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn enzym horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzym vào giếng, enzym xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng Từ đó định lượng kháng nguyên

Phương pháp lai phân tử

• Dựa trên phản ứng bắt cặp giữa một mẫu dò(oligonucleotit) với DNA/RNA mục tiêu trongmẫu Mẫu dò luôn được đánh dấu bằng chấtphát huỳnh quang để có thể được nhận biết khi

có phản ứng bắt cặp xảy ra

• Trình tự:

- Phá vỡ tế bào thu nhận DNA hoặc RNA

- Mẫu dò có gắn đuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử được đặt vào phản ứng.

- Que thử được bao bọc với polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò

- Que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzym

- Sau khi rửa loại phần enzym thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu

- Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450nm

Phương pháp PCR

• Khuyếch đại 1 trình tự DNA nhờ mồi chuyên biệt và nhận biết sản phẩm khuyếch đại bằng điện di sau khi nhuộm với ethidium bromide