Bài viết mô tả chi tiết việc hình thành chủng retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/ IL-12-p35. Protein được biểu hiện từ tế bào (TB) động vật có vú có hoạt tính cao. Tuy nhiên, việc đưa các đoạn gen mã hóa protein đích vào TB động vật rất phức tạp, làm tăng chi phí biểu hiện và tính chế sau này. Để khắc phục điều này, công nghệ chuyển gen dựa trên khung virut tái tổ hợp đã được triển khai. Bằng cách kết hợp chuyển gen retrovirut với các công nghệ tổng hợp nucleotid và tối ưu hóa codon, chúng tôi đã tạo ra dòng TB bài tiết virut mã hóa IL-12 mRNA.
Trang 170
THIẾT LẬP HỆ CHUYỂN GEN RETROVIRUT TÁI TỔ HỢP
BIỂU HIỆN IL-12 Ở MỨC ĐỘ mARN
Ngô Tất Trung*; Lê Hữu Song*; Phan Quốc Hoàn*
Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn**
TÓM TẮT
Protein được biểu hiện từ tế bào (TB) động vật có vú có hoạt tính cao Tuy nhiên, việc đưa các đoạn gen mã hóa protein đích vào TB động vật rất phức tạp, làm tăng chi phí biểu hiện và tính chế sau này Để khắc phục điều này, công nghệ chuyển gen dựa trên khung virut tái tổ hợp
đã được triển khai Bằng cách kết hợp chuyển gen retrovirut với các công nghệ tổng hợp nucleotid và tối ưu hóa codon, chúng tôi đã tạo ra dòng TB bài tiết virut mã hóa IL-12 mRNA
* Từ khóa: IL-12; Retrovirut; Protein tái tổ hợp
Construction of Recombinant Retrovirus Plasmid Engineering System for Expression of Interleukin-12 mRNA Level
Summary
Recombinant protein expressed from mammalian cell culture is a good activity However, the current procedure of delivery target open reading frame into mammalian host is cumbersome, which makes the chimeric protein expension To overcome the limits of available mammalian expression systems, many recombinant virus based gene deliver technologies have been implemented, in which the retrovirus backbone is one option of choice In this study, by combining recombinant retrovirus plasmid engineering with codon optimization, we have successfully created a cell line with significant secreted level of IL-12 mRNA
* Key words: IL-12; Retrovirus; Recombinant protein
ĐẶT VẤN ĐỀ
Interleukin-12 ban đầu được biết đến
như là một cytokine tiÒn viªm, thường
được tạo ra bởi tÕ bµo Dendritic (DCs) và
thực bµo Cytokine này có vai trò cảm
ứng bài tiết interferon-γ (IFN-γ), nhờ đó
kích thích quá trình biệt hóa hình thành
TB T helper 1 (TH1), đây chính là yếu tố
kết nối các phản ứng miễn dịch bẩm sinh
với miễn dịch thích nghi Sau này, khoa
học đã chứng minh IL-12 đóng
vai trò là tác nhân tăng trưởng cho TB giết tự nhiên (Natural killer cell growth factor) Cytokine này được hợp thành từ hai tiểu phần (subunit) mã hóa bởi hai gen khác nhau Khi các tiểu phần này được dịch mã tạo thành 12 p35 và
IL-12 p40 Hai tiền cytokine này sau khi bài tiết sẽ tiếp tục được sửa đổi sau dịch mã
và lai ghép với nhau, tạo thành phân tử cytokine heterodimer IL-12 p70 với đầy
đủ chức năng sinh học cần thiết cho điều hòa miễn dịch
* Bệnh viện TWQĐ 108
** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/09/2014
Trang 271
Tác dụng kinh điển mà con người vẫn
biết về IL-12 trong điều trị ung thư đó là: i)
kích thích quá trình biệt hóa và định hình
tính đặc hiệu thụ thể (T cell receptor
-TCR) trên bề mặt TB lympho T trợ giúp
(helper T cell) thông qua kích thích quá
trình tăng sinh của TB trình diện kháng
nguyên Dendritic; ii) định hướng độc
tính của TB T gây độc (cytotoxic CD8
T lymphocyte) [1, 2], iii) ức chế quá trình
tạo mạch máu: một trong những thay đổi
căn bản của TB ung thư so với TB thông
thường cùng mô, đó là liên tục tham gia
phân bào, nhu cầu dinh dưỡng cao hơn
mức bình thường Vì thế, chúng tiết ra
các hormon làm tăng quá trình phát triển
của mạch máu tới khối u (angiogensis)
Cho đến nay, người ta biết rằng IL-12 là
một trong những cytokine ức chế quá
trình đó, do đó gián tiếp ức chế phát triển
khối u [2]
Gần đây, một khám phá quan trọng
liên quan đến tính chất sinh học của IL-12
đó là cytokine này có khả năng ức chế
quá trình phát triển của khối u trên mô
hình động vật thực nghiệm thiếu hụt miễn
dịch (nude mice) [3] Trên cơ sở các
nghiên cứu cơ bản, triển khai thử nghiệm
lâm sàng sử dụng protein tái tổ hợp IL-12
Tuy nhiên, độc tính của IL-12 rất mạnh,
thậm chí gây chết người [4], điều này làm
chậm quá trình triển khai ứng dụng IL-12
trong điều trị ung thư Để khắc phục độc
tính do IL-12 gây nên, một số thử nghiệm
kết hợp IL-12 với các cytokine khác như
2, interferon alpha, B7.1, 7, 21,
IL-15 [5], đặc biệt là IL-18 Bằng cách này,
độc tính của IL-12 giảm xuống mức gần
như không có [6], mang lại triển vọng cho
ứng dụng một trong các interleukine có
tính ức chế ung thư mạnh nhất IL-12 vào thử nghiệm lâm sàng tiếp theo Vì vậy, công nghệ sản xuất interleukine tái tổ hợp IL-12 không chỉ đem lại lợi ích cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư liên quan đến IL-12, mà còn có thể phối kết hợp sử dụng IL-12 với các interleukine tiềm năng khác như: IL-7, IL-15, IL-18, IL-21…
Do IL-12 được hợp thành từ hai tiểu phần mã hóa và hai gen khác nhau, việc tạo ra p70 với đầy đủ chức năng sinh lý phải được tiến hành trên hệ retrovirut cho phép biểu hiện đồng thời cả 2 tiểu phần p40/p35 Các nghiên cứu thường tạo ra IL-12 tái tổ hợp từ 2 ORF mã hóa tương ứng cho 2 tiểu phần p40, p35 nối với nhau bởi một linker peptide, hoặc tạo ra 2 đơn
vị mARN độc lập nằm xen kẽ một internal ribosome entry site (IRES) Ở phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi sẽ mô tả chi tiết việc hình thành chủng retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/ IL-12-p35
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
Dòng TB đóng gói PT-76, human embryonic kiney - HEK 293T do Nolan lab - Standford University phát triển và được Clone Tech (USA) cung cấp; bộ khung retrovirut plasmid pMXs-IP của Trường Đại học Toshio Kitamura - Tokyo, phần mềm Vector NTI và các vật tư sinh học phân tử khác
2 Phương pháp nghiên cứu
* Hệ retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35:
Trang 372
Chiến lược thiết kế retrovirut plasmid
mang gen ghép IL-12 như sau: đoạn gen
mã hóa cho các cấu phần p35, p40 của
IL-12 được clon xen kẽ với một đoạn
ADN mã hóa cho một linker theo thiết kế
của Mulligan RC [7], chúng tôi bổ sung
thêm đoạn ADN mã hóa leader peptide
để đảm bảo protein sẽ được tiết ra môi trường, ngoài ra phần C terminal sẽ được
bổ sung đoạn mã hóa cho Tev - cleavage site và 6His tag, nhờ đó protein có thể được làm tinh sạch bằng kỹ thuật chelating
và proteolytic cleavage sử dụng Tev-cleavage proteolytic enzyme
Hình 1: Chiến lược thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12
* Tối ưu hóa các trình tự codon IL-12:
Dựa trên trình tự human IL-12 subunit
beta (UniProtKB: accession P29460) và
human IL-12 subunit alpha (UniProtKB:
accession P29459), kết hợp đoạn signal
peptid đầu 5’ (MCHQQLVISWFSLVF-
LASPLVA) và đoạn linker kết nối 2 tiểu phần
p40/35 (GGGGSGGGGSGGGGSRNLPV),
ngoài ra đầu 3’ của cấu hình IL-12-p40/
linker/IL-12-p35 được tích hợp đoạn ADN
mã hóa cho Tev-cleavage proteolytic site
(NQNLYFQG) và 6(His) tag 9 (HHHHHH),
từ đó hình thành nên chuỗi polypeptid
p40-linker-p35-His:
Trình tự polypeptid này được mã hóa bởi một ORF có kích thước 1.680 bp, có
vị trí cắt của enzyme EcoRI đầu 5’, trong khi đó đầu 3’ của cassette có thể bị cắt bởi XhoI
* Quy trình tạo chủng retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35:
Retrovirut plasmid mang cấu hình IL-12- p40/linker/IL-12-p35 ®-îc t¨ng sinh b»ng
vi khuÈn E coli - DH5 alpha, thu ho¹ch
th«ng qua quy trình maxi-prep để có được các lô plasmid với nồng độ ≥ 200 ng/ul,
OD nằm trong khoảng 1,7 - 2,0
Trang 473
Chuyển retro-plasmid mang cấu hình
IL-12-p40/linker/IL-12-p35 vào TB human
embryonic kidney - HEK 293T bằng quy
trình kết tủa canxi hoặc sử dụng phương
pháp cationic - liposome mediated gen
transfer
500 ml dịch nổi từ TB 108Retro@
linkerIL-12 và TB đối chứng H293T được
thu nhận riêng rẽ cho mục đích tách ARN
tổng số Lượng ARN này sau đó sẽ được
dùng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp
cADN
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Kiểm chứng thiết kế retrovirut
plasmid mang gen ghép IL-12
Thiết kế retrovirut plasmid mang gen
ghép IL-12 có đặc điểm là phần 5’ của
expression cassette có vị trí cắt của
enzyme E coRI, trong khi đó đầu 3’ của
cassette có thể bị cắt bởi XhoI và nếu kết
hợp cắt bằng cả 2 enzyme XhoI/EcoRI ta
sẽ được một insert 1.680 bp
Điều này được kiểm chứng bằng phản
ứng cắt enzyme cho kết quả như hình 1
Hình 1: Kiểm chứng thiết kế retrovirut
plasmid mang gen ghép IL-12 được cắt
bằng enzyme giới hạn
Đoạn insert được cắt bởi 2 enzyme XhoI/EcoRI cho kích thước điện di phù hợp với mong đợi 1.680 bp
2 Kiểm chứng sự có mặt của virut
mã hóa IL-12 trong dịch nổi TB đóng gói
Hình 2: Kết quả PCR điện di kiểm chứng
sự có mặt của ORF mã hóa IL-12-p40/linker/ IL-12-p35 từ dịch nổi TB.108Retro
@linkerIL-12
Để chắc chắn hơn, chúng tôi tiến hành
thu nhận dịch nổi TB 108Retro@linkerIL-12,
thực hiện phản ứng phiên mã ngược là khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho IL-12
Giải trình tự đoạn 320 bp nhân lên từ cADN dịch nổi TB 108Retro@linkerIL-12
và thu được một đoạn đọc 189bp có phổ
sắc ký như hình 3 Sử dụng trình tự này
để blast (blast nucleotide against polypeptide - Translated BLAST), thu được kết quả độ tương đồng 100%
Trang 574
Hình 3: Kết quả translated BLAST với inquiry là trình tự băng PCR điện di từ c AND dịch nổi
TB 108Retro@linkerIL-12
Dòng TB 108Retro@linkerIL-12 do chúng tôi tạo ra thực sự đã bài tiết retrovirut particle mang
cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35
BÀN LUẬN
Cho đến nay, nhiều hệ biểu hiện gen đã
được triển khai để tạo protein IL-12 tái tổ
hợp, nhưng được sử dụng nhiều nhất chính
là hệ chuyển gen có nguồn gốc virut bao
gồm cả adenovirut và retrovirut Thông
thường, các plasmid có nguồn gốc
adenovirut không có khả năng tích hợp vào
hệ gen của TB vật chủ Nó chỉ tồn tại tự do
trong nhân và nồng độ sẽ giảm dần sau mỗi
chu kỳ phân bào Hơn nữa, do kích thước
các adenovirut vector thường rất lớn, sẽ khó
khi tích hợp ngẫu nhiên vào nhiễm sắc thể
của TB chủ Vì vậy, khó tạo được các dòng
TB ổn định cho biểu hiện một protein đích
thông qua các hệ chuyển gen
adenovirut và khó có thể sử dụng liệu pháp
gen cơ bản dựa trên hệ adenovirut cho sửa
đổi các đoạn gen lỗi Một yếu điểm khác nữa của adenovirut vector đó là nó thường gây các phản ứng miễn dịch rất mạnh, vì thế
dễ bị thải loại bởi hệ miễn dịch vật chủ Việc khó tích hợp ngẫu nhiên các phân tử adenovirut vào hệ gen của vật chủ, cũng đồng nghĩa với việc làm giảm các nguy cơ gây chuyển đoạn nhiễm sắc thể hay các biến đổi di truyền học của TB chủ, vì thế TB này sẽ ít bị chuyển dạng sang thể TB ác tính khi dung nạp virut Về lý thuyết, đây cũng là
lý do adenovirut được coi là phương tiện chuyển gen ít gây ung thư hơn so với retrovirut nếu sử dụng cho liệu pháp gen
So với adenovirut, khả năng tích hợp retrovirut vào hệ gen vật chủ tốt hơn rất nhiều, làm cho quá trình biểu hiện protein đích trở nên dễ dàng, mặt khác nó lại có thể
Trang 675
làm rối loạn khu vực nhiễm sắc thể được tích
hợp Trong trường hợp retrovirut tích hợp vào
các khu vực mã hóa cho gen chÑn ung th-
hoặc gen ung thư, làm thay đổi tính chất tự
nhiên của đối tượng này, khơi mào cho sự
chuyển dạng ác tính của TB vật chủ và vì
thế, trên lý thuyết, sẽ gây lo ngại về sự hình
thành các thể bệnh ung thư khi sử dụng
retrovirut cho các ứng dụng liệu pháp gen
Tuy nhiên, quan sát thử nghiệm lâm sàng
mới nhất vừa được công bố trên tạp chí
Science cho thấy không có trường hợp nào
được ghi nhận mắc bệnh sau khi sử dụng
liệu pháp gen có nguồn retrovirut [8] Đây
cũng là báo cáo thống kê đầu tiên ghi nhận
tính an toàn của retrovirut cho mục đích
chuyển gen Trong khi đó, các ứng dụng
khác như tạo protein tái tổ hợp ở TB nuôi
cấy, retrovirut có ưu thế hơn tất cả các hệ
biểu hiện gen và chuyển gen mà con người
ta đã biết trước đây với những lý do sau:
Thông thường, đoạn gen đích (ví dụ IL-12
ORF) sẽ được cài vào giữa 5’ long terminal
repeat (LTR) và 3’ long terminal repeat
(LTR) của một retrovirut plasmid, LTR khi đó
vừa đóng vai trò là một promoter điều hòa
biểu hiện của gen đích vừa là một insulator
bảo vệ gen đích không bị ảnh hưởng bởi bộ
máy phiên mã các gen kề bên Ngoài ra, quá
trình tích hợp của retrovirut plasmid vào hệ
gen của TB chủ sẽ không còn ngẫu nhiên,
nó diễn ra theo kiểu tái tổ hợp đồng dạng với
đích đến là các đảo retrotransposon của
nhiễm sắc thể Bằng cách này loại bỏ được
nguy cơ đoạn gen đích di chuyển đến các
khu vực nối tiếp hoặc khu vực sợi chromatin
dị hợp ngẫu nhiên (facultative heterochromatin) Vì vậy, gen bị bất hoạt biểu hiện Chính vì những tính ưu việt đó, chúng tôi đã tiến hành thiết lập hệ retrovirut biểu hiện IL-12 tái tổ hợp này tại Việt Nam
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu chúng tôi đã thiết lập thành công hệ retrovirut biểu hiện IL-12 mức
độ mARN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Trinchieri G Interleukin-12 and the
regulation of innate resistance and adaptive
immunity Nat Rev Immunol 2003, 3 (2),
pp.133-146
2 Del Vecchio M et al Interleukin-12:
biological properties and clinical application Clin
Cancer Res 2007, 13 (16), pp.4677-4685
3 Eisenring M et al IL-12 initiates tumor
rejection via lymphoid tissue-inducer cells bearing the natural cytotoxicity receptor NKp46 Nat Immunol 2010, 11 (11), pp.1030-1038
4 Cohen J IL-12 deaths: explanation and a
puzzle Science 1995, 270 (5238), p.908
5 Weiss JM et al Immunotherapy of cancer by
IL-12-based cytokine combinations Expert Opin
Biol Ther 2007, 7 (11), pp.1705-1721
6 Rodriguez-Galan MC et al Coexpression of
IL-18 strongly attenuates IL-12-induced systemic toxicity through a rapid induction of IL-10 without
affecting its antitumor capacity J Immunol 2009,
183 (1), pp.740-748
7 Lieschke GJ et al Bioactive murine and
human interleukin-12 fusion proteins which retain antitumor activity in vivo Nat Biotechnol 1997, 15 (1), pp.35-40
8 Scholler J et al Decade-long safety and
function of retroviral-modified chimeric antigen
receptor T cells Sci Transl Med 2012, 4 (132),
pp.132-153