Xây dựng phương pháp phân tích đồng phân tích đồng phân tích đồng phân đối quang của amlodipin

β--Nhóm 4: chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện tử π và nhóm nhận điện tử π chất chọn lọc kiểu Pirkle -Nhóm 5: trao đổi ligand ion đồng tạo phức với nhóm hoạt qu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THU TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI

QUANG CỦA AMLODIPIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THU TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA AMLODIPIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Chi

PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

HÀ NỘI, NĂM 2011

LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp với nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành cuả mình tới những người thầy đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- TS Lê Đình Chi

- PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

Là hai người thầy đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thị Hường Hoa – Trưởng khoa Mỹ Phẩm cùng toàn thể cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học và các thầy cô đã dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bạn bè, đồng nghiệp và gia đình tôi- những người luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2011

Học viên

Đỗ Thu Trang

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN 3

1.1.1 Tính chất 3

1.1.2 Định tính, định lượng 4

1.1.3 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng 4

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG 6

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG 7

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): 9

1.3.2 Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE) 11

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 14

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 14

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.2 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 18

2.2.1 Hóa chất, chất chuẩn: 18

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 19

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 20

2.3.2 Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin bằng phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao 20

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 211

2.3.4 Ứng dụng để phân tích amlodipin trong các chế phẩm 211

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.4.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên cột sắc ký hoạt quang 21

2.4.2 Điện di mao quản sử dụng các dẫn chất cyclodextrin làm chất chọn lọc đối quang 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA AMLODIPIN BẰNG HPLC 26

3.1.1 Khảo sát khả năng tách các đối quang của pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang 26

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng tách đồng phân 31

3.1.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký 33

3.1.4 Thẩm định qui trình phân tích 33

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA AMLODIPIN BẰNG HPCE 2646

3.2.1 Khảo sát khả năng tách các đối quang bằng CE 466

3.2.2 Lựa chọn điều kiện điện di 51

3.2.3 Thẩm định qui trình phân tích 522

3.3 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ ĐÁNH GIÁ BẢN CHẤT ĐỒNG PHÂN CỦA AMLODIPIN ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG MỘT SỐ BIỆT DƯỢC TRÊN THỊ TRƯỜNG 59

3.3.1 Phân tích đồng phân đối quang của amlodipin trong một số chế phẩm

bằng HPLC 59

3.3.2 Phân tích đồng phân đối quang của amlodipin trong một số chế phẩm bằng CE 61 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 70

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AGP: acid α1- glycoprotein

BGE (background electrolyte): Dung dịch điện ly nền

BP (British Pharmacopoeia): Dược điển Anh

BSA (Bovine Serum Albumine): Albumin huyết thanh bò

CE (capillary electrophoresis): Điện di mao quản

CD: cyclodextrin

CMCD: carboxymethyl-β-cyclodextrin

EOF ( Electro-osmotic flow):Dòng điện thẩm

EP (European Pharmacopoeia): Dược điển châu Âu

GLP (Good Laboratory Practice): Thực hành tốt phòng thí nghiệm

HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSA (Human Serum Albumine): Albumin huyết thanh người

ISO/IEC 17025: Quy chuẩn quốc tế về quản lý phòng thí nghiệm

LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of Quantitation): Giới hạn định lượng

PDA (Photo Diode Array): Mảng diod quang

RSD (Relative Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối

TRIS: tris (hydroxymethyl) aminomethane

USP (United States Pharmacopoeia): Dược điển Mỹ

UV-VIS (Ultraviolet - visible): Tử ngoại - khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Độ pha loãng của dung dịch chuẩn

Bảng 3.2 Độ pha loãng của dung dịch chuẩn amlodipin besilat racemic

Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng S-amlodipin và R-amlodipin trong chuẩn

amlodipin besilat racemic

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của R-Amlodipin

34

34

35

38

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của S-Amlodipin 39

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống 41

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với R-amlodipin 44

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với S-amlodipin 45

Bảng 3.10 Quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ S-amlodipin 54

Bảng 3.11 Quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ R-amlodipin 54

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ lặp lại trên hai đồng phân đối quang

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ đúng với S-amlodipin 57

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ đúng với R-amlodipin 57

Bảng 3.15 Thành phần công thức các chế phẩm chứa amlodipin đã

Bảng 3.16 Kết quả xác định hàm lượng amlodipin trong

Bảng 3.17 Thành phần công thức các chế phẩm chứa amlodipin đã kiểm

tra bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp CE

Bảng 3.18 Kết quả xác định hàm lượng amlodipin trong

62

chế phẩm bằng quy trình phân tích sử dụng phương pháp CE 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử amlodipin besilat (a), cấu hình tuyệt đối

Hình 3.1 Sắc ký đồ thu được với dung dịch chất đối chiếu amlodipin

besilat racemic với cột Cyclobond I 2000, pha động là Triethylamin

Hình 3.8 Sắc ký đồ thu được với dung dịch chuẩn amlodipin besilat

racemic khi phân tích trên cột Chiral AGP khi thay đổi pH pha động

32

Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn amlodipin racemic (a), dung

dịch thử viên nén Amlodipin amsyn-5(b)

36

Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn S-amlodipin (a), dung dịch thử

viên nén Asomex(b)

37

Hình 3.11 Chồng phổ dung dịch chuẩn, dung dịch thử S-amlodipin

Hình 3.14 Ảnh hưởng của bản chất của chất hoạt quang tới độ phân

giải các đồng phân đối quang của amlodipin (a) β-cyclodextrin; (b)

CMCD

48

Hình 3.15 Ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền acid phosphoric

50 mM tới độ phân giải các đồng phân đối quang của amlodipin

a) pH = 1,6; b) pH = 2,5; c) pH = 3,5

49

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ CMCD tới độ phân giải các đồng

phân đối quang của amlodipin a) 0,1% ; b) 0,2%; c) 0,3%

50

Hình 3.17 Điện di đồ của dung dịch chuẩn amlodipin racemic (a) và

dung dịch chuẩn S-amlodipin (b)

51

Hình 3.18 Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình phân tích đồng phân

đối quang của amlodipin bằng CE (Điện di đồ của chuẩn S-amlodipin

racemic (a), mẫu Asomex 2,5 (b), chuẩn amlodipin racemic (c) và mẫu

Amlodipin STADA (d))

53

Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích

pic của S-amlodipin

54

Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích

pic của R-amlodipin

55

Hình 3.21 Điện di đồ chuẩn amlodipin besilat racemic ở giới hạn

phát hiện (a) và giới hạn định lượng (b)

58

Hình 3.22 Phân tích định tính amlodipin trong chế phẩm bằng HPLC

(Sắc ký đồ của chuẩn amlodipin racemic (a), mẫu Amsyn-5 chứa

amlodipin racemic (b), chuẩn S-amlodipin (c) và mẫu Asomex 5 chứa

S-amlodipin (d))

60

Hình 3.23 Phân tích định tính amlodipin trong chế phẩm bằng CE

(Điện di đồ của chuẩn S-amlodipin racemic (a), mẫu Asomex 2,5 (b),

chuẩn amlodipin racemic (c) và mẫu Amlodipin STADA (b))

63

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiều hoạt chất đang lưu hành trên thị trường là các hợp chất hoạt quang [17] Các nghiên cứu khoa học đã cho thấy việc sử dụng đồng phân tinh khiết thay thế cho hỗn hợp racemic của cùng hoạt chất đã đem lại nhiều hiệu quả hơn trong điều trị như giảm liều dùng, giảm tác dụng không mong muốn và giảm độc tính của thuốc Thảm họa thalidomid vào những năm 60 của thế kỷ XX gây ra khoảng 10.000 trường hợp quái thai như giống hải cẩu, mất chi, bất thường tim, thận, tai, mắt, hở mũi hở vòm miệng do dùng thalidomid để gây ngủ cho phụ nữ mang thai Các nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây quái thai là do dạng đồng phân (S) trong hỗn hợp racemic này [23] Levamisol dạng đồng phân tả tuyền là tetramisol có tác dụng trị giun sán nhưng đồng phân hữu tuyền lại gây độc tính

Vì những lý do trên đã khiến ngành công nghiệp dược phẩm thế giới chuyển từ

sử dụng hỗn hợp racemic sang dùng riêng đồng phân đối quang tinh khiết

Amlodipin là chất đối kháng kênh calci thuộc nhóm dehydropyridin Phân

tử amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên hợp chất này cũng tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang Nhiều nghiên cứu đã chứng minh trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả tuyền (levamlodipin hay S(-)-amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng điều trị tăng huyết áp

và đau thắt ngực S-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn R-amlodipin 1000 lần [26] Trên thị trường, amlodipin đã được sử dụng dưới dạng hỗn hợp racemic Gần đây, sau những nghiên cứu cho thấy sự khác biệt về tác dụng dược lý giữa hai đồng phân đối quang của hợp chất này, nhiều nhà sản xuất đã đưa ra thị trường các chế phẩm chỉ chứa S-amlodipin

Phân tích đồng phân đối quang là một trong những kỹ thuật khó trong hóa phân tích do bản chất lý hóa của hai đồng phân đối quang trong mỗi cặp đồng phân đối quang là quá gần nhau

Với cơ quan quản lý việc cấp số đăng ký cho các hoạt chất có bản chất là đồng phân đối quang tinh khiết sẽ gặp nhiều khó khăn nếu năng lực kiểm nghiệm của Việt Nam chưa đáp ứng được yêu cầu Để nâng cao năng lực quản lý chất lượng của thuốc trong hệ thống kiểm nghiệm nhằm góp phần bảo vệ, chăm sóc sức khỏe nhân dân cũng như hội nhập với xu hướng phát triển chung của ngành dược trên thế giới là nhiệm vụ cần và cấp thiết không chỉ của cơ quan quản lý mà của cả ngành y tế

Trước tình hình trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp phân tích đồng phân đối quang của amlodipin” với hai mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp tách các đồng phân đối quang của amlodipin nhằm định tính và định lượng các dạng đồng phân đối quang của amlodipin trong các chế phẩm thuốc bằng HPLC và CE

2 Áp dụng phương pháp xây dựng được để đánh giá bản chất đồng phân (racemic hay enantiomer tinh khiết) của amlodipin được sử dụng trong một

số biệt dược trên thị trường

Đây là một phần của đề tài cấp bộ: “Phân tích một số đồng phân đối quang

có tính chất dược lý chọn lọc khác nhau của chlorpheniramin,

dexchlorpheniramin, amlodipin,lamivudin”

- Hơi tan trong nước và 2-propanol, tan tốt trong methanol, ít tan trong ethanol,

- Năng suất quay cực: -0,0020 (dung dịch 1% kl/tt trong methanol, đo ở 200C)

pyridin, ứng dụng trong định lượng

1.1.2 Định tính, định lượng

1.1.2.1 Định tính

- Phương pháp quang phổ hồng ngoại

Nguyên tắc: So sánh phổ hồng ngoại giữa chất thử và chất chuẩn Amlodipin

Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của amlodipin

besilat chuẩn (ĐC)

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc: tiến hành sắc ký lớp mỏng đối với chất thử và chất đối chiếu Amlodipin, kết quả phải cho vết chính tương ứng về vị trí, kích thước và màu sắc với vết chính của dung dịch đối chiếu khi quan sát dưới đèn tử ngoại 366 nm

- Phương pháp đo quang

Nguyên tắc: Amlodipin có khả năng hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ của

Amlodipin trong dung môi acid hydrocloric 0,1 N/methanol (TT) là 360 nm

Tính toán độ hấp thụ riêng trong khoảng 113-121 hoặc so với chất chuẩn

nghiên cứu đã chứng minh trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả tuyền (levamlodipin hay S(-)-amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực S-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn R-amlodipin 1000 lần [26]

- Amlodipin ngăn chặn kênh calci loại L phụ thuộc điện thế, tác động trên các mạch máu ở tim và cơ

- Amlodipin có tác dụng chống tăng huyết áp bằng cách trực tiếp làm giãn

cơ quanh động mạch ngoại biên và có ít tác dụng hơn trên kênh calci cơ tim Vì vậy thuốc không làm dẫn truyền nhĩ thất ở tim kém đi và cũng không ảnh hưởng xấu đến lực co cơ

- Amlodipin không có ảnh hưởng xấu đến nồng độ lipid trong huyết tương hoặc chuyển hóa glucose, do đó có thể dùng amlodipin để điều trị tăng huyết áp

ở người bệnh đái tháo đường

- Tác dụng chống đau thắt ngực: Amlodipin làm giãn các tiểu động mạch ngoại biên, do đó làm giảm toàn bộ lực cản ở mạch ngoại biên (hậu gánh phải)

Vì tần số tim không bị tác động hậu gánh giảm làm công của tim giảm, cùng với giảm nhu cầu cung cấp nhu cầu oxy và năng lượng cho cơ tim Điều này làm giảm nguy cơ đau thắt ngực Ngoài ra amlodipin cũng gây giãn động mạch vành

cả khu vực thiếu máu cục bộ và khu vực cung cấp máu bình thường Sự giãn mạch này làm tăng cung cấp oxy cho người bệnh đau thắt ngực thể co thắt Điều này làm giảm nhu cầu nitroglycerin và bằng cách này, nguy cơ kháng nitroglycerin có thể giảm

Chỉ định: Điều trị tăng huyết áp (ở người bệnh có biến chứng chuyển hóa như

đái tháo đường) và điều trị dự phòng ở người bệnh đau thắt ngực ổn định

Chống chỉ định: Không dùng cho những người suy tim chưa được điều trị ổn

định Quá mẫn với dihydropyridin

Thận trọng: Với người giảm chức năng gan, hẹp động mạch chủ, suy tim sau

nhồi máu cơ tim cấp

Tác dụng không mong muốn: Phản ứng phụ thường gặp nhất của amlodipin là

phù cổ chân, từ nhẹ đến trung bình liên quan đến liều dùng Nhức đầu, chóng mặt, đỏ bừng mặt, có cảm giác nóng, mệt mỏi, suy nhược, chuột rút, buồn nôn, đau bụng, khó tiêu, khó thở [6]

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG

Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng ảnh

và vật qua gương Chúng có công thức hoá học hoàn toàn giống nhau, chỉ khác

về cách bố trí không gian của các nhóm thế quanh carbon bất đối Đồng phân quang học là hiện tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay của mặt phẳng ánh sáng phân cực Điều kiện cho tính hoạt quang chính là: cấu trúc hình học của phân tử phải như thế nào đó để phân tử không chồng khít với ảnh trong gương của nó tương tự như quan hệ giữa bàn tay phải và bàn tay trái (chirality) Ngoài sự khác biệt trong trong cấu trúc phân tử theo kiểu như sự khác biệt của bàn tay phải và bàn tay trái, khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo những góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau, còn lại tất cả các tính chất lý hóa thông thường của các đồng phân đó là giống nhau Chất mà có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một góc α nào đó gọi là chất hoạt quang [3]

Cấu hình R và S (cấu hình tuyệt đối): Khi nguyên tử carbon liên kết với 4 nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử khác nhau C*abcd Thiết lập trình tự ưu tiên của nhóm thế carbon bất đối: a>b>c>d Người ta quan sát phân tử theo trục C-d từ

phía ngược với d nếu từ a->b->c đi theo chiều kim đồng hồ thì cấu hình là R (rectus = phải ) trường hợp ngược chiều kim đồng hồ thì cấu hình là S (sinister= trái) Trong đấy, thứ tự ưu tiên a, b, c, d theo Cahn- Ingold- Prelog như sau:

- I > Br > Cl > S > F > O > N > C > H

-COOH > -C=O > -CHO > - CH2OH > -CH-R > -CH3 (R ở đây là các CH3) [10] Chính sự khác nhau về cấu trúc không gian này làm cho chúng có tương tác khác nhau với các thụ thể sinh học, như các chất mang, receptor, enzym Vì thế, đặc tính dược động học cũng như đặc tính dược lý của hai đồng phân đối quang của một số thuốc có thể rất khác nhau Có tới một nửa các dược chất đang

sử dụng hiện nay có đồng phân đối quang, mà 1/3 trong số đó có các đồng phân đối quang mang đặc tính dược lý và hoặc dược động học khác nhau

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG

Phân tích đồng phân đối quang là một trong những chủ đề khó trong hóa phân tích do bản chất lý hóa quá gần nhau của hai đồng phân đối quang trong mỗi cặp đồng phân đối quang Các đồng phân đối quang có thể được tách bằng 2 cách, trực tiếp hoặc gián tiếp

Theo cách gián tiếp: hai đồng phân này được tạo dẫn chất với một hợp

chất đối quang khác để tạo ra hai sản phẩm là đồng phân quang học, nhưng không phải là đối quang (diastereoisomers), như vậy chúng sẽ có tính chất vật lý

và hoá lý khác nhau nhiều hơn, do đó sẽ dễ tách ra khỏi nhau hơn

Theo cách trực tiếp: các đồng phân đối quang được tách bằng một công cụ

phân tích có hiệu năng tách cao, và phải có sự góp mặt của một hoặc nhiều chất chọn lọc đối quang Các chất chọn lọc đối quang này có đặc điểm là tương tác khác nhau với các đồng phân đối quang, do cấu trúc không gian của chúng Có nhiều nhóm chất

chọn lọc đối quang, được xếp loại theo cấu trúc của chúng [12], [19]: các cyclodextrin và dẫn chất, các oligo và polysaccarid, crown ether, các kháng sinh vòng lớn, các protein, các chất trao đổi ion, chất diện hoạt và các calixaren

Đặc điểm duy nhất có thể lợi dụng để tách riêng hai đồng phân đối quang

là khả năng tương tác khác nhau của chúng với những chất có ái lực khác biệt với mỗi đồng phân đối quang của một hỗn hợp racemic Những chất này được gọi là các chất chọn lọc đối quang (chiral selector) Các chất này được đưa vào

hệ thống tách để tương tác trực tiếp với hỗn hợp đồng phân đối quang Khi mức

độ khác biệt của quá trình tương tác với chất chọn lọc đối quang giữa hai đồng phân đối quang đủ lớn, chúng sẽ được tách riêng Các chất chọn lọc đối quang

có bản chất hóa học khá đa dạng, có thể chia thành các nhóm chính sau [14], [25]:

-Nhóm 1: có bản chất protein (albumin huyết thanh (HSA, BSA), α1-acid glycoprotein (AGP), ), cyclopeptid, một số kháng sinh macrocyclic glycopeptid (vancomycin, teicoplanin, avoparcin, tubocuracin…) đã được dùng

để tách nhiều đồng phân đối quang

-Nhóm 2: Các oligosaccarid không vòng và dẫn chất polysaccarid, phần

lớn là các phân tử như monosarcharid Một số phân tử disaccarid, trissaccarit cũng có thể ảnh hưởng giống như các monosaccarid tự nhiên đó là vị trí liên kết

và loại liên kết tạo nên khả năng nhận biết chất đối quang Các chất hay dùng là dẫn chất maltose, lactose, succrose, amylose, cellulose

-Nhóm 3: chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành một “hốc”

chọn lọc đối quang (chiral cavity) Đây là các cyclodextrin (CD) và dẫn chất cyclodextrin, dẫn chất sulfat hóa, alkylhydroxy hóa của β-CD), ether vòng, polymer

(β Nhóm 4: chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện

tử π và nhóm nhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle)

-Nhóm 5: trao đổi ligand (ion đồng tạo phức với nhóm hoạt quang)

Sử dụng các chất chọn lọc đối quang kể trên, nhiều phương pháp tách đã được sử dụng để phân tích các đồng phân đối quang, chủ yếu dựa trên các quá trình sắc ký (lỏng, khí, pha siêu tới hạn) và điện di [20] Trong đó, hai kỹ thuật phổ biến nhất hiện nay để tách đồng phân đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản hiệu năng cao

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

1.3.1.1 Khái niệm về phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- High Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao

Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng được bao phủ trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với nhóm hữu cơ

Tùy thuộc vào bản chất các pha, kỹ thuật và phương tiện sắc ký mà người

ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau:

Trong đó sắc ký lỏng phân bố được sử dụng phổ biến nhất hiện nay

1.3.1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang

Có ba lựa chọn để tách các đồng phân đối quang bằng HPLC:

1/Sử dụng pha tĩnh không gắn chất chọn lọc đối quang và một pha động chứa chất chọn lọc đối quang

2/Tạo dẫn chất để biến hai đồng phân đối quang thành hai diastereoisomer

có thể tách được bằng một hệ pha tĩnh-pha động thông thường

3/Sử dụng pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang và pha động không chứa chất chọn lọc đối quang

Lựa chọn thứ nhất không đòi hỏi các cột sắc ký hoạt quang đắt tiền, nhưng nhược điểm là tiêu thụ nhiều chất chọn lọc đối quang hơn và hiệu quả tách không lớn bằng áp dụng trên điện di mao quản

Lựa chọn thứ 2 khó áp dụng do hạn chế trong việc tìm ra dẫn xuất phù hợp và độ tin cậy của phương pháp bị ảnh hưởng bởi độ lặp lại của phản ứng tạo dẫn xuất

Trên thực tế, hiện tại lựa chọn thứ ba là xu thế phổ biến nhất, do số lượng pha tĩnh thương mại hóa sẵn có lớn, tới khoảng 100 loại cột khác nhau [20] giúp người làm phân tích có nhiều lựa chọn phù hợp với nhu cầu Các Pha tĩnh chọn lọc hoạt quang thương mại sử dụng các chất chọn lọc đối quang thuộc cả 5 nhóm kể trên (ví dụ: nhóm 1: Chiral HSA, Chiral AGP, Chirobiotic V; nhóm 2: Chiralpak AD, Chiralcel OD; nhóm 3: Crownpack, Cyclobond; nhóm 4: ULMO, Whelk-O 1; nhóm 5: Chiralpak WH, WM) Trong lĩnh vực phân tích dược phẩm, đây vẫn là kỹ thuật được áp dụng nhiều nhất với số lượng công trình công bố rất lớn [13] So với các kỹ thuật tách đồng phân đối quang khác như kết tinh chọn lọc, chiết… HPLC là phương pháp có khả năng ứng dụng

rộng nhất, cho phép tách các đồng phân đối quang của hầu hết các hợp chất hoạt quang có tác dụng dược lý Ngoài ứng dụng trong phân tích, HPLC hoạt quang

ở quy mô điều chế cũng là một trong những kỹ thuật cơ bản để sản xuất đồng phân đối quang tinh khiết ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, các pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang chỉ cho phép tách tốt đồng phân đối quang của một số chất nhất định [20] Do đó, để tìm ra được điều kiện tối ưu để phân tích đồng phân đối quang của các dược chất hoạt quang thường gặp thì phòng thí nghiệm cần được trang bị một cơ số đầy đủ cột hoạt quang với các loại pha tĩnh khác nhau Đây là hạn chế cơ bản nhất cho áp dụng rộng rãi HPLC hoạt quang vì các cột gắn Pha tĩnh chọn lọc đối quang đều có giá thành cao

1.3.2 Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE)

1.3.2.1 Cơ chế của quá trình diện di trong mao quản

Nguyên tắc của quá trình tách trong điện di mao quản là dựa trên tính chất điện di khác nhau của các phần tử chất tan Quá trình này xảy ra trong mao quản trên nền dung dịch chất điện ly có pH thích hợp, dưới tác dụng của một điện trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản

Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong mao quản dưới tác dụng của lực điện trường nhất định (Electric Field Force, được viết tắt là EFF) và tính chất của dòng điện thẩm ( Electro Osmotic Flow, được viết tắt là EOF) EOF là một dòng chuyển khối phẳng trong mao quản Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng nhất dọc theo mao quản, cho nên không có sụt áp trong mao quản Dòng EOF đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung dịch điện ly nền, bất kể có điện tích hay không, di chuyển theo cùng một hướng Với điều kiện thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng này di chuyển về catod Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc độ

EOF thường lớn hơn nhiều so với tốc độ điện di Cation di chuyển nhanh nhất

do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo các chất không mang điện tích di chuyển theo EOF nhưng không tách khỏi nhau được Cuối cùng là anion Trên điện di đồ thứ tự rửa giải theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích thước nhỏ ra trước nhất, anion có điện tích lớn và kích thước nhỏ ra cuối cùng Điện thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dùng trong

kỹ thuật CE là rất lớn, thông thường từ 10-30 kV Chính lực điện trường này làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất định và các chất có điện tích và độ lớn khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau Do

đó tạo nên sự phân tách của các chất phân tích

Mao quản sử dụng trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm, đường kính trong 25- 100 µm Loại mao quản có đường kính trong khoảng 50- 75 µm

là thích hợp nhất vì hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế nhiệt độ mao quản Mao quản được chế tạo từ vật liệu khác nhau, nhưng phổ biến nhất là silica nung chảy (fused silica)

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng

• Điện thế: Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao quản Tuy nhiên, nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng Joule tạo ra gradient nhiệt trong mao quản và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong mao quản làm cho các phân tử ngay cả một chất tan cũng di chuyển không đồng nhất dẫn đến sự khuếch tán khác nhau và làm mở rộng vùng mẫu

• Nhiệt độ: Ảnh hưởng chính của nhiệt độ là làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện của đệm Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ trong mao quản tăng là nguyên nhân thay đổi cấu tạo của protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu quả phân tích

• Cột mao quản: Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính) ảnh hưởng đến thời gian tách và hiệu quả phân tích Nếu cả hai yếu tố là chiều dài hiệu dụng và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng thời gian phân tích

• Dung dịch đệm:

- Loại đệm và nồng độ: Đệm thích hợp cho CE là đệm có tác dụng tốt nhất trong dãy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt trong đệm

- pH: pH của đệm có tác dụng lên khả năng phân tích và làm thay đổi EOF Tăng pH của đệm thường làm tăng EOF

- Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của một số chất tan trong đệm Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường làm giảm EOF

1.3.2.3 Điện di mao quản hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang

Điện di mao quản hiệu năng cao (HPCE- high performance capillary electrophoresis) đang là kỹ thuật phân tích ngày càng được áp dụng rộng rãi hơn trong phân tích đồng phân đối quang Các chất chọn lọc đối quang sử dụng trong điện di mao quản cũng chính là các chất chọn lọc đối quang được sử dụng trong các pha tĩnh của HPLC Nhưng khác với HPLC, trong điện di mao quản các chất chọn lọc đối quang được hòa tan vào dung dịch điện ly nền (background electrolyte-BGE) Các nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tách đồng phân đối quang bằng CE cho thấy lợi thế lớn nhất của phương pháp này là

sự linh hoạt trong việc điều chỉnh điều kiện phân tích để tối ưu hóa kết quả Một

ưu thế khác của CE trong phân tích đồng phân quang học là giá thành phân tích Các chất chọn lọc đối quang phổ biến nhất đều sẵn có trên thị trường với giá thành hạ hơn rất nhiều so với giá thành các cột sắc ký có gắn cùng chất chọn lọc

đối quang đó Mặt khác, lượng tiêu thụ dung dịch điện ly nền trong điện di mao quản rất nhỏ, do đó lượng chất chọn lọc đối quang đối quang tiêu thụ cũng nhỏ hơn so với trường hợp đưa vào pha động để chạy sắc ký Trong số 5 nhóm chất chọn lọc đối quang đã liệt kê ở trên, các chất thuộc nhóm 1 và 3 được sử dụng phổ biến hơn cả trong điện di mao quản [22], [24] Mặc dù số chất chọn lọc đối quang đã được dùng trong CE cho tới nay hẹp hơn số chất chọn lọc đối quang được gắn lên pha tĩnh dùng trong HPLC, khả năng tách đồng phân đối quang bằng CE hiện hoàn toàn có thể so sánh được với HPLC Do đó, chỉ với một số chất chọn lọc đối quang nhất định, người phân tích có thể giải quyết được việc tách đồng phân đối quang cho một số lượng đối tượng phân tích rất rộng Giải pháp này khả thi và kinh tế hơn nhiều so với việc duy trì một cơ số cột sắc ký hoạt quang cho phổ sử dụng tương đương Trong các nhóm chất chọn lọc đối quang đã kể ở trên, chúng tôi nhận thấy nhóm cyclodextrin, đặc biệt là beta-cyclodextrin và các dẫn xuất của nó, được áp dụng rộng rãi nhất với khả năng tách đồng phân quang học rất mạnh, cho kết quả tốt trên hầu hết các nhóm dược chất hoạt quang phổ biến [13], [21] Loại gốc thế và mức độ thế trên cấu trúc cyclodextrin vòng đóng vai trò quan trọng trong việc làm tăng mức độ của chất hoạt quang Các cyclodextrin có gốc thế mang điện tích âm và mức độ thế nhiều hơn trên cấu trúc vòng cho độ phân giải tốt hơn khi phân tích hỗn hợp đối quang cation so với các cyclodextrin có gốc thế không mang điện Đó là do sự di chuyển ngược dòng của cyclodextrin có các gốc thế mang điện âm so với các cation phân tích

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu đã tách hai đồng phân đối quang bằng phương pháp điện di mao quản và sắc ký Với sắc ký, mặc dù sắc ký khí (GC) và sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC) cũng đã được dùng trong phân tách đồng phân đối quang nhưng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn được sử

dụng nhiều nhất trong lĩnh vực này

Hai đồng phân đối quang của amlodipin đã được nghiên cứu tách bằng HPLC sử dụng pha tĩnh nhóm 1 (AGP, vancomycine) [16], [18] Một số nghiên cứu [16], [29] khảo sát sử dụng một số pha tĩnh dẫn chất cellulose và amylose chưa tách được các đồng phân đối quang của amlodipin B Streel và cộng sự khảo sát khả năng tách enatiomers của amlodipin trong máu bằng phương pháp LC-MS trên các cột hoạt quang Chiral-AGP (150 x 4,0 mm), pha tĩnh chứa chất chọn lọc đối quang acid α1- glycoprotein, trên cột hoạt quang Chiralcel OD-H (250 x 4,6 mm), pha tĩnh chứa chất hoạt quang cellulose tris-(3,5- dimethylphenyl carbamat), cột hoạt quang Chiralcel OJ (250 x 4,6 mm), pha tĩnh chứa chất hoạt quang cellulose tris-4- methylbenzoat và trên cột hoạt quang Chiralpak AD (250 x 4,6 mm), pha tĩnh chứa chất hoạt quang amylose tris-(3,5- dimethylphenyl carbamat) với pha động đệm acetat 0,01M, pH 4,5 – 1-Propanol (99-1) Kết quả cho thấy enatiomers của amlodipin chỉ được tách trên cột cột hoạt quang Chiral-AGP Hệ thống sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ APCI được trang bị giao diện ion hóa, giới hạn phát hiện của phương pháp này là 0,1ŋg/ml Jluksa và cộng sự đã tách R-amlodipin và S-amlodipin bằng HPLC trên cột AGP và HPCE với chất hoạt quang là α-cyclodextrin và methyl cellulose với đệm pH 3,0 [26] Ngoài ra, hai đồng phân của amlodipin cũng được tách bằng pha động acetonitril- NaH2PO4 20 mM, pH 3,95 có chứa chất chọn lọc đối quang sulphobutylether-β-CD 20 mM (35:100), thời gian lưu của S-

amlodipin khoảng 21,5 phút với độ phân giải giữa hai đồng phân là 1,7 Nếu thay chất chọn lọc đối quang trong pha động trên bằng carboxymethyl-β-cyclodextrin 2,5 mM thì thời gian lưu của S-amlodipin kéo dài tới 35 phút và độ phân giải của 2 đồng phân giảm rõ rệt (Rs=1,1) [32]

Phương pháp điện di mao quản sử dụng các chất chọn lọc đối quang nhóm β-cyclodextrin và dẫn chất đã được áp dụng để phân tích hai đồng phân đối quang của amlodipin [29], [30], [31] Jluksa và cộng sự đã tách R-amlodipin và S-amlodipin bằng đã tách bằng mao quản silica nung chảy với dung dịch điện ly nền là tris-HCl 20mM và chất chọn lọc đối quang α-cyclodextrin 18mM và thêm 0,05% (m/V) của methylcenlullose [26] P.K.Owens và cộng sự đã tách hai đồng phân của amlodipin bằng phương pháp điện di mao quản với chất chọn lọc đối

quang là hydroxypropyl-β- cyclodextrin 20mM và anion sulphobutylether-β-CD

1 mM và carboxymethyl-β-cyclodextrin 2,5 mM là những chất tính chọn lọc hoạt quang mạnh hơn CD [32]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong khuôn khổ tìm kiếm của mình, cho tới nay ở Việt Nam chúng tôi vẫn chưa tìm thấy nghiên cứu nào về tách đồng phân đối quang của các chế phẩm chứa amlodipin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Với phương pháp điện di mao quản Lê Thu Cúc và cộng sự đã nghiên cứu tác nhân đối quang 2-hydroxypropyl beta-cyclodextrin trong phân tích đồng phân amlodipin bằng phương pháp điện di mao quản với điều kiện điện di: Cột mao quản chiều dài 64 cm (55,5 cm) đường kính trong: 50µm, nhiệt độ phân tích

ở 25oC, điện thế 20kV, điều kiện tiêm mẫu: 50 mbar x 10 giây, detector: 214 nm, nghiên cứu đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách đồng phân như

pH, nồng độ dung dịch điện ly nền, nồng độ chất chọn lọc đối quang sử dụng

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ chất điện ly nền tris 50 mM, pH 2,5

và nồng độ 2-hydroxypropyl beta-cyclodextrin là 10 mM thì hai đồng phân phân của amlodipin tách hoàn toàn với thời gian lưu của S-amlodipin và R-amlodipin lần lượt là 21,97 và 22,58 [9]

Đối với các hoạt chất khác, phương pháp điện di mao quản đã thường được sử dụng để tách các đồng phân đối quang Tác nhân đối quang hydroxybutyl beta-cyclodextrin dùng để tách đồng phân quang học của ketoconazol, promethazin, beta-cyclodextrin và hydroxyalkyl beta-cyclodextrin dùng để tách đồng phân quang học của miconazol bằng phương pháp điện di mao quản [8,10] Nguyễn Xuân Lý [11] và cộng sự đã tiến hành phân tích Lamivudin và tạp đồng phân bằng phương pháp điện di mao quản vùng với chất chọn lọc đối quang là beta cyclodextrin 3% và dung dịch đệm natri tetraborat 50

mM chứa chất hoạt động bề mặt natri dodecyl sulfat 50 mM

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Viên nén Asomex 2.5 có chứa s-amlodipin 2,5 mg của Emcure®Pharmaceuticals Ltd, (Ấn Độ), SĐK: VN-2979-07, Lô 01C10010, Hạn dùng 07/03/2013

- Viên nén Asomex 5 có chứa s-amlodipin 5 mg của Emcure® Pharmaceuticals Ltd, (Ấn Độ), SĐK: VN-2980-07, Lô 01B09031, Hạn dùng 07/11/2013

- Viên nang Amsyn-5, của Synmedic Laboratories Ấn Độ, SĐK: 997-OSP(H),

Lô AS 002, Hạn dùng 30/09/2013

- Amlodipin Stada 5mg, Cty TNHH LD Stada-VN, SĐK: VD-4493-07, Lô

291110, Hạn dùng 12/11/2013

- Amlibon 5mg, Lek (Slovenia), lô AS1868, Hạn dùng 12/2012

- Amlocard 5, của Minimed Laboratories Pvt Ltd Ấn Độ, SĐK:VN-0347-06, Lô

- Amoni acetat (P.A), Merck, Đức

- 1-propanol (cho HPLC), Merck, Đức

- Methanol (P.A), Merck, Đức

- Acetonitril (cho HPLC), Merck, Đức

- Nước cất (đạt tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV), VKNTW

- Natri hydroxyd (P.A), Merk, Đức

- Triethylamin (P.A), Merk, Đức

- β- Cyclodextrin (P.A), Sigma, Aldrich

- Carboxymethyl-β-cyclodextrin (CMCD), Sigma, Aldrich

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S100

- Bơm chân không Charles Austen

- Cân Mettler Toledo AB- 204-S

- Máy đo pH Metrohm 691 pH Metter

- Hệ thống HPLC Shimadzu với detector PDA

- Hệ thống HPLC Merck HITACHI D-7000 với detector UV

- Máy Điện di mao quản Hewlett packard 3D-CE

- Cột sắc ký hoạt quang: Chiral AGP(acid α1- glycoprotein) (150 x 4,0 mm; 5µm)

- Cột sắc ký hoạt quang: Astec cyclobondTM I 2000 (β-cyclodextrin) (250 x 4,6

- Giấy lọc thô, màng lọc 0,45µm

- Cối, chày và nhiều dụng cụ phân tích khác

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khảo sát các điều kiện thực nghiệm sử dụng trong kỹ thuật HPLC bao gồm:

- Khảo sát bản chất của Pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang sử dụng

- Thành phần pha động: tỷ lệ đệm, dung môi, pH dung dịch

- Các điều kiện khác của hệ thống sắc ký (tốc độ dòng, chế độ rửa giải, điều kiện detector )

Từ đó tìm điều kiện phân tích tối ưu nhất để tách hoàn các đồng phân đối quang của amlodipin trong hỗn hợp racemic và áp dụng các điều kiện phân tích

đó để phân biệt các đồng phân đối quang trong các chế phẩm

2.3.2 Khảo sát khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin bằng phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao

Khảo sát các điều kiện thực nghiệm sử dụng trong kỹ thuật HPCE bao gồm:

- Bản chất, nồng độ chất chọn lọc đối quang sử dụng

- Thành phần dung dịch điện ly nền (pH, nồng độ, loại đệm sử dụng)

- Các điều kiện khác của hệ thống điện di (chế độ phân cực, mức điện áp sử dụng, điều kiện detector, điều kiện tiêm mẫu, điều kiện cân bằng mao quản )

Từ đó tìm điều kiện phân tích tối ưu nhất để tách hoàn các đồng phân đối quang của amlodipin trong hỗn hợp racemic và áp dụng các điều kiện phân tích

đó để phân biệt các đồng phân đối quang trong các chế phẩm

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi tối ưu hóa điều kiện phân tích thẩm định phương pháp trên các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

2.3.4 Ứng dụng để phân tích amlodipin trong các chế phẩm

Thông qua phương pháp phân tích đồng phân đối quang của amlodipin đã được xây dựng và thẩm định phương pháp, ta tiến hành phân tích đồng phân đối quang của R-amlodipin và S-amlodipin có trong một số chế phẩm có chứa amlodipin dạng racemic và dạng S-amlodipin

Định tính phân biệt giữa R-amlodipin và S-amlodipin, dựa vào sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn amlodipin và S-amlodipin ở cùng điều kiện phân tích Thời gian lưu của mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn, hệ số Match phải gần bằng 1

Định lượng R-amlodipin và S-amlodipin có trong chế phẩm ta tính toán dựa trên việc so sánh đáp ứng (diện tích hoặc chiều cao pic) thu được trên sắc ký

đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn amlodipin thu được ở cùng điều kiện phân tích 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các số liệu của đề tài được thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng các phương pháp sau :

2.4.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên cột sắc ký hoạt quang

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

2.4.1.2 Phương pháp xử lý mẫu

Amlodipin trong các chế phẩm thuốc thường tồn tại dưới dạng muối amlodipin besilat nên tan tốt trong methanol vì vậy chúng tôi lựa chọn dung môi pha mẫu trong giai đoạn 1 là methanol- nước (1:1), để tránh ảnh hưởng của nền dung môi pha mẫu giai đoạn 2 chúng tôi pha loãng trong pha động

Các chế phẩm thuốc là viên nén hoặc viên nang đã bỏ vỏ nang được nghiền mịn, hòa tan trong methanol- nước (1-1), sau đó lọc qua giấy lọc rồi pha loãng đến nồng độ định lượng bằng pha động Dịch lọc được lọc qua màng lọc

kích thước 0,45µm

Các dung dịch chuẩn và dung dịch thử để định lượng S-amlodipin và amlodipin racemic được chuẩn như sau:

- Dung dịch chuẩn amlodipin: Cân chính xác một lượng chất chuẩn

S-amlodipin besilat tương ứng với khoảng 25,0 mg S- S-amlodipin vào bình định mức 50 ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng hỗn hợp methanol - nước (1:1) Hút chính xác 1 ml dung dịch thu được, pha loãng bằng pha động thành 20 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch chuẩn amlodipin racemic: Cân chính xác một lượng chất

chuẩn amlodipin besilat racemic tương ứng với khoảng 50,0 mg amlodipin racemic vào bình định mức 50 ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng hỗn hợp methanol- nước (1:1) Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thu được, pha loãng bằng pha động thành 20 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch thử của viên nén Asomex 2.5: Cân và xác định khối lượng

trung bình của 20 viên, nghiền thành bột mịn, trộn đều Cân một lượng bột viên tương ứng với khoảng 2,5 mg S-amlodipin vào bình định mức 20 ml hòa tan và

thêm vừa đủ bằng hỗn hợp methanol - nước (1:1), lọc qua giấy lọc Hút chính xác 5,0

ml dịch lọc pha loãng bằng pha động thành 25 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch thử của viên nén amlodipin racemic: Cân và xác định khối

lượng trung bình của 20 viên, nghiền thành bột mịn, trộn đều Cân một lượng thuốc tương ứng với khoảng 5 mg amlodipin racemic vào bình định mức 20 ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng hỗn hợp methanol- nước (1:1), lọc qua giấy lọc Hút chính xác 5,0 ml dịch lọc, pha loãng bằng pha động thành 25 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Tiến hành tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ

2.4.2 Điện di mao quản sử dụng các dẫn chất cyclodextrin làm chất chọn lọc đối quang

Trong các nhóm chất chọn lọc đối quang đã kể ở trên, chúng tôi nhận thấy

nhóm cyclodextrin, đặc biệt là β-cyclodextrin và các dẫn xuất của nó, được áp dụng rộng rãi nhất với khả năng tách đồng phân quang học rất mạnh, cho kết quả tốt trên hầu hết các nhóm dược chất hoạt quang phổ biến [13], [21]

Khi áp dụng một kỹ thuật tách đồng phân đối quang bằng HPLC, HPCE thích hợp cho phép tách riêng 2 đồng phân đối quang của hoạt chất đó, tiến hành phân tích song song với chất đối chiếu racemic, kết quả phân tích (sắc ký đồ, điện di đồ) của mẫu thuốc có hoạt chất racemic sẽ cho đủ đáp ứng (pic) tương ứng với 2 đồng phân đối quang thu được trên kết quả phân tích của chất đối chiếu, trong khi mẫu thuốc chứa đồng phân đối quang sẽ chỉ cho một đáp ứng trùng với 1 trong 2 đồng phân đối quang của chất đối chiếu

Các phương pháp này dùng để định tính, định lượng, xác định tạp của amlodipin

S-Phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết quả : Tính toán và xử lý thống kê

các số liệu trên Microsoft Excel 2003 về hệ số tương quan r của khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng và định lượng hàm lượng S-amlodipin Một số công thức tính toán các giá trị thống kê như sau :

Giá trị trung bình x= 1

n i i x n

St: Diện tích mẫu thử

Sc: Diện tích mẫu chuẩn f: Độ pha loãng

m: Khối lượng trung bình viên

mt: Khối lượng mẫu thử

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG

CE, trong đó với phương pháp HPLC chúng tôi đã lựa chọn cấu hình Pha tĩnh chọn lọc đối quang – pha động không chứa chất chọn lọc đối quang cho hệ thống sắc ký Trong khuôn khổ điều kiện trang thiết bị và thời gian có được, nghiên cứu của chúng tôi đã được tiến hành trên các hệ thống sắc ký sử dụng pha tĩnh có chứa hai loại chất chọn lọc đối quang: acid α1- glycoprotein và β-cyclodextrin Chúng tôi đã tiến hành khảo sát bản chất của pha tĩnh trên hai cột:

- Trên cột Astec cyclobondTM I 2000 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

- Trên cột CHIRAL- AGP (150 x 4,0 mm, 5 µm) của Chiral Technologies Inc

3.1.1.1 Pha tĩnh là β-cyclodextrin

β-cyclodextrin là một chất chọn lọc đối quang nhóm cyclodextrin được sử dụng rất phổ biến để tách các đồng phân đối quang bằng HPLC và HPCE Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng tách amlodipin trên cột Cyclobond I 2000 có gắn β-cyclodextrin với hệ thống sắc ký gồm các điều kiện sau đây:

- Hệ thống HPLC Shimadzu, Merck HITACHI với detector đặt tại bước sóng 235nm

- Cột sắc ký hoạt quang Astec cyclobondTM I 2000 (50 x 4,6 mm, 5 µm)

- Pha động: Đệm triethylamin (pH= 4,0): dung môi Tỷ lệ dung môi dao động trong khoảng từ 0 - 9% (với các dung môi: acetonitril, methanol, 1-propanol)

- Tốc độ dòng: 0,8ml/phút

- Thể tích mẫu mỗi lần tiêm: 20µl

Khả năng tách các đồng phân đối quang của amlodipin trên cột Cyclobond

I 2000 đã được khảo sát với các tỷ lệ pha động khác nhau, với tỷ lệ dung môi acetonitril, methanol, 1-propanol dao động trong khoảng từ 0 - 9% (tt/tt) Thời gian lưu của amlodipin có tăng lên khi tỷ lệ acetonitril trong pha động giảm xuống Tuy vậy, trên cột Cyclobond I 2000, với mọi tỷ lệ pha động đã khảo sát, hai đồng phân đối quang của amlodipin besilat hoàn toàn không được tách mà vẫn trùng nhau thành một pic duy nhất trên sắc ký đồ, kể cả khi đã hạ tỷ lệ acetonitril trong pha động xuống 0% (xem Hình 3.1) Vậy pha tĩnh β-cyclodextrin không phù hợp để phân tích đồng phân đối quang của amlodipin

Hình 3.1 Sắc ký đồ thu được với dung dịch chất đối chiếu amlodipin besilat

racemic với cột Cyclobond I 2000, pha động là Đệm triethylamin pH 4,0