Xây dựng phương pháp phân tích phát hiện một số chất ức chế men phosphodiesterase 5 trộn trái phép trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năng

LÊ THỊ QUỲNH NGAXÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍsCH PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHẤT ứ c CHê MEN PHOSPHODIẼSTERASE-5 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG THUố C ĐÔNG DƯỢC VÀ THựC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SỸ • •

LÊ THỊ QUỲNH NGA

XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍsCH PHÁT

HIỆN MỘT SỐ CHẤT ứ c CHê MEN

PHOSPHODIẼSTERASE-5 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG THUố C ĐÔNG DƯỢC VÀ THựC PHẨM

CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ • • Dược • HỌC •

CHUYÊN NGHÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Việt Hùng

LỜI CẢM ƠN

V ới lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần V iệt Hùng, người thầy tận tụy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện v à hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện K iểm N ghiệm thuốc

T rung Ư ơng, Ban giám hiệu, Phòng quản lý sau đại học và các thầy cô giáo trường Đại học D ược H à N ộ i đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập cũng nh ư thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các bạn đồng nghiệp K hoa Kiểm nghiệm các dạng bào chế và K hoa Vật lý đo lường và đã giúp đỡ, san sẻ công việc và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn này Đ ặc biệt, tôi xin cảm

ơn DS D ương M inh Tân, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng n hư thực hiện luận văn này

H à N ội, ngày 06 tháng 10 năm 2011

DS Lê Thị Q uỳnh Nga

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN

1.3 Phương pháp phân tích chất ức chế PDE-5 trộn trái phép 7

trong thuốc và thực phấm chức năng1.3.1 Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với 6

detector DAD (HPLC-DAD)

1.4 Thực trạng trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 trong thuốc 18

đông dược và thực phẩm chức năng

2.2.1 Hóa chất - thuốc thử 21

2.3.1 Phương pháp phát hiện các chất ức chế PDE-5 bằna phương 22

pháp khối phổ trực tiếp (MS)2.3.2 Xây dựne chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao (IIPLC) 27

để định tính, định lượng một số chất ức chế PDE-52.3.3 Khảo sát một số mẫu thuốc đôrm dược và thực phẩm chức 28

năng điều trị rối loạn cương dương

3.1 Xây dựna phương pháp phát hiện một sổ chất ức chế PDE-5 31

bằng phương pháp khối phổ trực tiếp (MS)

3.2 Xây dựns phương pháp định tính, định lượng một số chất 35

ức chế PDE-5 bằnơ phương pháp HPLC

4.2 Ket quả khảo sát một số mẫu thuốc đông dược và thực 63

phấm chức năns điều trị rối loạn cươns dương bằnạ phương pháp khối phố trực tiếp và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD

ACPI : Atmospheric Pressure Chemical Ionization

ADP : Adenosin diphosphat

ATP : Adenosin triphosphat

CE-MS : Capillary electrophoresis - Mass Spectrometry

Điện di mao quản kết hợp khối phổ

c GMP : Cyclic guanosine monophosphate

CI : Chemical ionization (lon hóa hóa học)

DAD : Diod array detector

El : Electron Impact (Va chạm điện tử)

ESI : Electro Spray Ionization (lon hóa bang phun điện tử)GC-MS : Gas Chromatogarphy - Mass Spectrometry

Sắc ký khí kết hợp khối phổ GLP : Good laboratory practice

HPLC : High Performance Liquid Chromatogarphy

Sắc ký lỏng hiệu năng cao IEC : International Electrotechnical Commission

ISO : International Standard Orgnization

LOD : Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ : Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)

47

484949

Tên bảng

Đặc trưng phổ khối của các chất chống rối loạn cương

dương nhóm ức chế PDE-5

Ket quả các eiá trị chiều cao và diện tích pic của dãy chuẩn

xác định LOD của sildenafil

Ket quả các giá trị chiều cao và diện tích pic của dãy chuẩn

xác định LOD của vardenaíìl

Ket quả các giá trị chiều cao và diện tích pic của dãy chuẩn

xác định LOD của tadalafil

Ket quả khảo sát tính tuyến tính của sildenafil

Ket quả khảo sát tính tuyến tính của vardenaíìl

Ket quả khảo sát tính tuyến tính của tadalaíìl

Ket quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC (đối với

Ket quả khảo sát độ lặp lại (đối với sildenafil)

Ket quả khảo sát độ lặp lại (đối với vardenaíĩl)

Kêt quả khảo sát độ lặp lại (đôi với tadalaíìl)

6

8

14141520

22

24252532

Tên hình

Sơ đồ biểu diễn cơ chế tác dụng của chất ức chế PDE-5

Cấu trúc hóa học của Sildenafil

Cấu trúc hóa học của Vardenafil

Cấu trúc hóa học của Tadalafil

Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Quá trình phân mảnh của phân tử Sildenafil

Quá trình phân mảnh của phân tử Vardenafil

Quá trình phân mảnh của phân tử Tadalafil

Phổ khối MS 1 lần full scan của dung dịch sildenafil 10

Phổ khối MS/MS full scan của dung dịch tadalafil 10 Ịig/ml

Sắc ký đồ của mẫu trắng phân tích bằng HPLC

Hình 3.8 Sắc ký đồ của dung dịch sildenafil 10 ng/ml phân tích bằng 38

HPLCHình 3.9 Sắc ký đồ của dung dịch vardenafil 10 |ig/ml phân tích bane 38

HPLCHình 3.10 Sắc ký đồ của dune dịch tadalafil 10 ng/ml phân tích bằng 39

HPLCHình 3.11 Sắc ký đồ xác định LOD của sildenafil 40Hình 3.12 Sắc ký đồ xác định LOD của vardenafil 41Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOD của vardenaíll 42Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (mcg/ml) và 43

diện tích pic (mAu.s) của sildenafil Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa none độ (mcg/ml) và 44

diện tích pic (mAu.s) của vardenafil Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (mcg/ml) và 45

diện tích pic (mAu.s) của tadalaíìl

ĐẬT VÁN ĐÈ

Từ năm 1998 đên nay, mới chỉ có 3 dược chất tônơ họfp thuộc nhóm ức chế men phosphodiesterase-5 (PDE-5) được công nhận làm thuốc điều trị rối loạn cươna, dươns đó là: sildenafil citrate (Viagra, Pfizer, 1998), vardenafil hydroclorid (Levitra, Bayer, 2003), tadalafil (Cialis, Lily, 2003)[19], [25],

Tuy nhiên, từ xa xưa con naười đã có nhữne bài thuốc dân eian dùno đế đièu trị cho đàn ông yêu sinh lý Do vậy trên thị trườne cũn Si đã tồn tại rất nhiều loại thuôc đône dược và thực phâm chức năng có nguồn sốc từ dược liệu dùng để diêu trị rối loạn ciron 11 dương

Trong những năm íiần đây, trên thế e,iới và cả ở Việt Nam đã phát hiện thấy

cả 3 dược chất trên và nhiều chất tương tự chúns chưa được côna nhận làm thuốc được trộn trái phép trong nhiều thuốc và thực phâm chức năng [19], [20], [25] Việc nàv đã và đang đe dọa nghiệm trọna đen sức khởe cộng done Bơi vì việc chỉ định 3 loại thuôc trèn đê điều trị roi loạn cương dươn? cho bệnh nhân cần có

sự theo dõi chặt chỗ của bác sỹ về liều dùng và thời gian sử dụng Doi với thuốc đỏng dược và thực phâm chức năng thường, dược mua và điều trị mà không cần sự

kè đơn cua bác sỹ Vì vậv, nếu nhữna loại thuốc nàv mà bị trộn trái phép các dược

chât trên, n s ư ờ i bệnh không biết sử dụns, lâu dài với lư ợng lớn thì sẽ Hây ra n h ừ n e

biến chứng và tác dụng phụ rất nguy hiếm

Viện Kiêm nghiệm Thuốc Trung ưưng - Bộ y tế đã phát hiện một số thực phâm chức năn2, và thuôc đôna dược có chứa các chât ức chê PDH-5 như: Supai

99 Tonskat All Plus (Malaisia) có chứa nor-acctildcnafil, Spartan (Malaisia) cỏ chứa acetildenaíìl Mãnh nam (neuyên liệu nhập từ Trune, Quốc) có chứa acctildenafil

Hiện nay, Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm đã có quyết định yêu cầu các thuôc đông dược và thực phẩm chức năne có nguồn ?ốc từ dược liệu dùng để điều trị rối loạn cươne dương phải được kiểm tra phát hiện sự có mặt của các chất ức chế PDE-5 Tuy nhiên chưa có một phươnơ pháp phân tích chính thức và thốne nhất để kiểm tra các chất này

Vì vậy, chúne tôi tiến hành thực hiện đề tài

“XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN MỘT SÓ CHẤT

ỨC CHẾ MEN PHOSPHODIESTERASE S TRỘN TRÁI PHÉP TRONG THUÓC ĐÔNG DƯỢC VÀ THỤC PHẨM CHỨC NĂNG ’, với các mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất ức chế PDE-5 trộn trái phép trong thuốc đône dược và thực phấm chức năng bang MS

2 Xây dựnR phươns pháp định tính, định lượns sildenafil, vardenafil và tadalafil trone mẫu tự tạo bans, HPLC-DAD

3 ứ n e dụng kiểm tra một số chất ức che PDE-5 trên một số loại thuốc đôna dược và thực phẩm chức năng

CHƯƠNG I

T Ổ N G Q U A N

1.1 RỐI LOẠN CƯƠNG DƯƠNG [21]

Cương dươns; là một quá trình huvết độne lực học dựa trên nhữna tương tác phức tạp giữa các yêu tố ngoại biên và các thành phần của hệ thần kinh trune, ương, làm giãn cơ trơn và mạch máu ở thể hang tối đa Khi có kích thích tinh dục, các dây thần kinh ở thê hang và các tế bào nội mô sẽ phóng thích nitric oxid, thúc đẩy sản sinh cGMP thông qua men guanylat cyclase, kết quả là làm giảm calcium nội bào dẫn đến aiãn cơ trơn thô hang Lưu lượne máu đến dươne; vật tăng lên, các khoane bên trong căng phone, neăn cản máu tĩnh mạch trở về và kết quả là dương vật cươnạ lèn Khi chuỗi tươnẹ tác trên bị phá vỡ bởi các nguyên nhân vê tâm lý, nội tiêt, thần kinh, mạch máu cũne như tôn thươna

ở thể hang thì gây ra rối loạn cương dương (RLCD) ở nhiều mức độ khác nhau

khôi phục khả năna cươne của dương vật ở nhữne bệnh nhân bị rối lọan cươne,

dương

H ình 1.1 Sơ đồ biêu diên cơ chế tác dim ẹ của chất ức chế PDE-5

Sildenafil đã được dưa vào thử nạhiệm lâm sànơ ở Đức từ năm 1995 và năm 1998

đã được cơ quan dược phâm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận và cho phép lưu hành rộne rãi Mặc dù cơ chê tác dụns của các loại thuốc nàv là giống nhau nlurna chúng khác nhau về dược độna học, cấu trúc phân tử của sildenafil và vardenalìl tươniĩ đối siốna nhau trong khi tadalaíìl thì lại rất khác với 2 loại này Chính vì sự khác biệt mới này trong câu trúc phân tử mà tadalaíĩl có vài ưu đicm hơn sildenafil như: ức chế chọn lọc PDE5 hơn thuốc có tác dụng nhanh hơn và kéo dài hưn, khône, bị ảnh hưởntí bởi thức ăn lên sự hấp thụ của thuốc, và ít tác dụng phụ hưn

Tính chất: Bột kết tinh trắng đến trắna xám nhạt, không mùi, vị đắna, khône tan trone nước và ethanol.

Tác dụng phụ: Nhức đầu, đỏ bừng mặt, xung huyết mũi, khó tiêu, thị giác thay đổi, nhìn mờ Đặc biệt, có thê sâv quen thuốc và phụ thuộc vào thuốc

Một số biệt dược có hoạt chất là sildenafil: Viagra (Pfizer); Kamaẹra (Ajata pharma); Evadam (cône ty TNHH dược pham Sao Kim): Adraein (Cons tv Co phan Cône nehệ Sinh học - Dược phâm ICA): Revatio (Pfizer)

'l ính chất: Bột kết tinh trang đến trắne nhạt, không mùi, vị đang, tan trong nước và ethanol

rác dụns phụ: Nhức đầu, đỏ bừng mặt xung huyết mũi, khó tiêu, thị eiác thay đôi, nhìn mờ Trong một sô ít trường hợp, ạây cứng cơ, cương kéo dài, hoặc cương đau Đặc biệt, có thể uây quen thuốc và phụ thuộc vào thuốc

Một số biệt dược có hoạt chất là vardenaíìl: Levilra (Bayer); Levivina (cône ty dược phâm Hà Tây); Staxyn (GlaxoSmithKline)

Tác dụng phụ: Nhức đầu khó tiêu, sưng mí mat Đặc biệt, có thể eây quen thuốc

và phụ thuộc vào thuốc

Một số biệt dược có hoạt chất là tadalaíìl: Cialis (Lily); Adcirca (Lily); Cialove (Côna ty cổ phần sinh học dược phấm Ba Đình); Pycalis (Pymepharco) Tadalaiìl

20 mẹ (cône ty cổ phần dược phẩm Phú Thọ); Fadalafil Stada (Cônơ ty lien doanh TNIIII Stada - Việt Nam)

1.2.5 Các chát ức chế PDE-5 khác ị 26Ị

Hiện nay, chỉ có 3 dược chất tông hợp thuộc nhóm chất ức chê PDE-5 được công nhận làm thuốc điều trị rối loạn cương dương Ngoài ra các chất tương tự chúne như: Homosildenafil, Hydroxyhomosildenafil Acetildenafil Nor-acetildenafil Hydroxyacetildenafil Piperadino acetildenafil, Piperadino vardenafil Aminotadalafil Dimethylsildenafil, Sulfosildenafil, Sulfohomosildenafil, Sulfoaildenafil, Benzamidenafil chưa được công nhận là thuốc

1.3 Phuo’ng pháp phân tích chất ức chế PDE-5 trộn trái phép trong thuốc đông dược và thực phấm chức năng

1.3.1 Phương pháp phân tích bằng sắc kỷ lỏng hiệu năng cao với detector DAD (HPLC-DAD) Ị1J, [2], /5/, /9/, [15]

1.3.1.1 Khái niệm [2], [9]

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography -

HPLC) là phương pháp pho biến nhất hiện nay được sử dụng để định tính và định lượng trong phân tích kiêm nghiệm Ra đời từ năm 1967 - 1968 trên cơ sở phát triên và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột co điển, sắc ký lởng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ, dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ

- Detector DAD (Detector mảng diod)

Detector có một hoặc hai mảng diod đế nhận bức xạ đã tản sắc từ một cách tử kẻ vạch băng laser Quang phô và săc ký đô có thê hiên thị trên màn hình nhờ phân mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Mặt khác, hệ thống này có thế cho

đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian

1.3.1.2 H ệ thống H P L C [9], Ị15J

Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đồ hình 1.5

1 Bình chứa dung

2 Bơm cao áp

3 Bộ phận tiêm mâu

4 Cột HPLC (pha tĩnh)

Sau đây là một sô pha tĩnh điên hình:

- Silcageỉ trung tính' Dùng để tách các chất không phân cực và ít phân cực

Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước Ví dụ: Lichrosorb Si 40, Si 60, Si 100; Hypersil; M- partisil; Micropack - S i

Pha động dùng cho loại này là những chất không phân cực hay ít phân cực, thường

là các dung môi hữu cơ đơn hay hỗn hợp của vài dung môi hữu cơ không tan trong

nước như: Benzen, tolnen, cloroform, hex an, ethyl a c e ta t .

- Silỉcageỉ đã alkyl hoá: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực,

các chất phân cực có khả năng tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OI ỉ

đã bị alkyl hoá tức là đã được gắn với mạch carbon thăng (C8 C18) hay các

carbon vòng (phenyl) vì thế nó không còn phân cực hay rất ít phân cực

Ví dụ: Hvpersil ODS, lichrosorb RP18 - RP8 C8 corasiỊ phenyl - corasil

Pha động dùng cho loại này là các chât hữu cơ phân cực như methanol,

acetonitriì, nước hoặc hôn họp của chủng.

- Siìicaẹel đã được sulfonic, nỉtro hoả hay amiiì hoá: Dùng đê tách các chât

có cấu tạo ion như các kim loại và hợp chất của chúne, hay các chât khi tan trong

pha độns; thì phân lv thành ion như các acid hay base Ví dụ: Lichrosorb - NH2:

Lichrosorb - CN; Nucleosil - 5NII2; Partisil - SAX; Micropack; Hypcrasil APS

b) Pha độne,

Dung môi dùng đề chuẩn bị pha động thường khône được chứa các chất

làm ổn định và phải trone suốt ở vùna bước sóne phát hiện, nêu như sử dụne

detector tử ngoại Điều chỉnh pH trong trườnR hợp cần thiết, thực hiện với thành

phần nước của pha động mà khône điêu chỉnh với hôn hợp

Pha dộng có thể chứa những thành phần khác, ví dụ như một ion trái dấu

dối với sắc ký tạo cặp ion hoặc một chât chọn lọc dối quang trons trường hợp săc

ký sử dụng, pha tĩnh bất đối chất đệm pH để ổn định pi I chất tạo phức đè tạo ra sự

rửa giai chọn lọc chất điện li

Các loại tluna mồi thích hợp cho tìm ạ loại pha tĩnh dùng phô biên dã dược

ncu ở phần chọn pha tĩnh

1.3.1.3 Các đai lương đăc trưng / / / , [9Ị

* Thời gian lun tR (Retention time)

Thời e,ian lưu của một chất là thời gian cần dế chất đó di chuyển từ nơi tiêm

mẫu qua cột sac ký, tới detector và cho píc trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm mau đến

khi xuất hiện đỉnh của píc) t R = t() X (1 + k')

t(l: thời aian chêt, tức là thời gian lưu của một chất khône bị lưu RÌừ, tốc độ

di chuyển của nó bans tốc độ di chuyên của các phân tử dung môi

k': hộ số dung lượng

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.

đó phân bố nhiều vào pha tĩnh nên sẽ di chuyển chậm, và ngược lại

* Hệ so dung lượng k' (Capacity factor)

Hệ so duns, lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha và được tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan Qs trong pha tĩnh (hoặc thể tích pha tĩnh Vs) và lượng chất tan Q m trong pha động (hoặc thể tích pha động V m) ở trong thời điểm cân bằng

Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chat A, B có k'A

và khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biếu thị ở độ chọn lọc a:

a = —^ với điều kiện k > k B

k' B t RA tl 0

a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng ( a từ 1,5 đến 2,0 là tối ưu)

* Sổ đìa lý thuyết N (Theoretical plates)

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biêu thị hiệu năng của cột trong một điêu kiện sắc

ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiêu cao là H, tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách

mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.

Số đĩa lý thuyết N được tính theo một trong 3 công thức sau:

N = 16 X (7^ Ý hoặc 5,54 X (Z7T Ý hoặc (% )2

W: Độ rộng đáy píc

W0 5: Độ rộng píc ở điêm ứng với 0,5 chiêu cao p íc

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000

* Độ phân giải R (Resolution)

Độ phân giải là đại lượne biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai píc cạnh nhau được tính theo công thức:

R = Ĩ 1 hoặc 1.18x7 t e a z O

( w ,+ w „ ) (W „A+ W „ B)

Trong thực tế nếu các píc cân đối (Gauss) thì độ phân ẹiải để 2 píc tách tối thiếu là R = 1,0 Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp Neu R nhỏ thì các píc chưa tách hẳn, việc tính diện tích píc sẽ không chính xác

* Hệ sô bát đôi xứng T (Tailing, factor)

Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của píc trên sắc đồ thu được

T được tính bằng íỷ so độ rộng của 2 nửa píc tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao píc

Píc dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được, vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T khi T nằm trong khoảng 0,8 — 2,0 thì phép định lượng được chấp nhận

1.3.1.4 ứ ng dụng của HPLC-DAD trong kiếm nghiệm ph át hiện các chất trộn trái phép trong các săn phẩm thuốc [5], [9]

* Định tỉnh:

Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của chuẩn và thử là cơ sở của phép thử định tính Trên máy HPLC với Detector Diod Array ta có thể vẽ phổ UV- VIS của píc chuan và píc thử rồi chồng 2 phố với nhau đế thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số match Khi hệ số match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn.

Hệ so match > 0,900 chỉ ra 2 phổ tương tự nhau Hệ so match càng gần

1 0 0 0 thì sự tươne tự của phổ càng cao

1.3.2 Phương pháp phân tích phổ khối (MS) [1], [3], [8], [11]

1.3.2.1 Nguyên tắc [1]

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ sổ này được biêu thị bằng đơn vị khôi lượng nguyên tử hoặc bang Dalton

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được aia tốc và tách riêng nhờ

bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân khônẹ: áp suất trong hệ dao động lừ 10 ’ Pa đến 10~6 Pa tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cuns cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạns các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

1.3.2.2 Cấu tạo mảy khối ph ổ Ị1], [8], [11]

Máy khối phổ gồm các bộ phận sau:

* Bộ nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy Neu mẫu ở dạns; lỏng hoặc dạne rắn thì cần

phải chuyến sang dạng hơi bằng cách thích hợp

* Bộ n^uồn ion: lon hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.

Có nhiều phương pháp đê ion hóa phân tử và nguyên tử của mầu ở trạníi thái khí hoặc hơi Các phương pháp chủ vếu là:

- Va chạm electoron (Electron Impact - EI):

Va chạm điện tử (Electron Impact EI), dựa vào sự phân mảnh ion dưới tácdụng của chùm điện tử hoặc ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là70eV Trước đây, phổ EI-MS được sử dụng phổ biến, nhưns hiện nay, khi phân mảnh nhẹ nhàne (soft fragmentation) bănạ kỳ thuật ion hóa phun điện tử ESI -

MS, cho phép eiữ được các đặc trim® phân mảnh thì EI-MS ít sử dụng hơn EI-MS

có lợi điẻm là hiện có thư viện phô các hợp chất hữu cơ và dược chất rất phong phú lên tới hàns trăm neàn chất

- lon hóa hóa học (Chemical ionization - CI)

Cỉ là kỳ thuật ion hóa dùng một thuốc Ihử (metan, ammoniac) va chạm với chùm tia electron năng lượng cao đê tạo ra các ion hoặc aôc tự do

- lon hóa bằng phun sươne khử sovat (dissolvation nebulization sources)

Kỹ thuật này tạo ra ion từ phân tử trona duna dịch Dung dịch ở trons cộtmao quản kim loại (tốc độ dòng dao độne từ lml đến 10 ml/phút) Neười ta dặtmột trường điện eiữa đầu mao quản và một điện cực (diện thế có thể đến +4000V) các giọt mịn (hạt sương) mang điện tích được tạo thành và e,ia tốc đến điộn cực Đây là ion hóa bằng tia điện (elcctrospray ionization - ESI) ESI thích hợp dể ion hóa các chất phân cực và các phân tử có khối lượns phàn tử lớn

- Nguồn ion hóa bằng aiải hap (Ionization desorption sources)

Neuyên tắc của kỹ thuật nàv dựa trên quá trình phát thứ cấp, bắn phá mộtmẫu ở dạns lỏne hoặc ran bane một chùm tia sơ cap: electron, ion hoặc photon.Các hạt thứ câp như electron, ion hoặc phân tử trung hòa sỗ được tạo thành Chỉ các hạt này được phân tích bằng khối phổ

* Bộ phân tích khối: Tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách

riêne nhờ tác dụng của từ trườne điện trườne để đi đến detector

- Bơm chân không

Các ion được tạo ra ở mặt phân eiới khi vào trong máy phân tích MS sỗ không thể tồn tại được nếu va đập với các phân tử không khí Vì vậy yêu càu đầu tiên để vận hành máy MS là phải đạt môi trường chân không cao

Có 2 loại bơm tạo chân khỏna:

+ Bơm dầu: tạo áp suất chân khône ban đầu 1,4 torr ở mặt phân giới và

10"4 torr ờ bộ phận dẫn đường ion Trong trường hợp máy đang chạy mà mất điện đột ngột thì dầu có thể tràn vào buồng chân không gây bân, hỏng thiết bị

+ Bơm tua - bin: 2ồm hệ thống nhiều bơm phân tử tua - bin được kết nối

để tạo ra mức chân khônẹ cao hơn 10"6 Các bơm tua - bin có nhiều van dược dặt trôn một trục quay ở tốc độ cao Các van này loại bỏ không khí từ buồn2, chân không và hút không khí ra khỏi bơm Bơm này cỏ ưu điếm là không, làm bẩn máy nhưn£ tuồi thọ kém

* Detector:

Chuyển các ion thành tín hiệu điện Mầu sau khi bị ion hoá dược hirớns, tới máy phân tích MS các kiêu ion tươna: tự nhau được tập trung lại thành dòng (í lình 1.2)

Q uad rt_j pol e rods

các tần số tín hiệu (radio-frequency RF), mồi tần số quét lựa chọn những ion có số khối khác nhau, cho phép chúne đi theo đường ổn định tới detector Các ion ôn định tại mỗi tần số được tống ra để đập vào detector ion ở đây các ion được đếm

về sổ lượne lạo ra tín hiệu rồi chuyển đến máy tính Nhữne ion không được lựa chọn sẽ bị loại bở trong quá trình di chuyên

Khi hạt mang điện đập vào bề mặt m àns detcctor làm cho mặt bên kia của detector giải phóng electron Các electron này tới đập vào thành của detector làm giải phóng nhiều electron hơn sau mồi lần va đập Từng đợt va đập electron làm tăng cường tín hiệu rồi được chuyến về hệ thong dừ liệu (Hình 1.3)

H ình 1.7 Bộ phận phát hiện ion

Máy phân tích MS/MS thường kết hợp 2 máy phân tích MS có tế bào va dập (a collision cell) Ion đích được lựa chọn từ máy phân tích MS đầu tiên dược phép va đập với phân tử khí trơ đè kích thích phân mảnh Sau đó các ion mảnh đi vào trong máy phân tích MS thứ 2 đe phân tách và xác định (Hình 1.4)

no dc

Hình 1.8 Hệ thông M S/M S Triple-quadrupole

* Bộ xử /ý í/ỉ7’ liệu: Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyên

thành tín hiệu sô phục vụ xử lý dữ liệu theo yèu câu khác nhau như: ehi pho khối, định lượna

1.3.2.3 M ột sổ kỹ thuật khối phổ sử dụng để phát hiện sildenafil, tadala/ĩl và vardenafil và các dân chất của chúng Ị4Ị

* K ỹ thuật MS một lần Full scan (Scan toàn thang) :

Giả sử ta có một hồn hợp A, B, c được tách ra sau khi qua cột sắc ký lỏng

và lần lượt đưa vào khôi phô với kỹ thuật APCI (+)

Trong sẳc ký đô toàn ion, mũi A biêu diễn tông cườne độ các ion A + l A l A2

A 3 sinh ra từ A, mũi B biêu diên tôns cường độ các ion B + l B l, B2, B3 sinh

ra từ mũi b và tương tự cho mũi c

Full Scan cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên phươne pháp này không cho độ nhạy cao, nhiễu đường nền có thê lớn

* Kv thuật MS hai lân Full scan

Nẻu chọn ion A] làm ion căn bản và phân đoạn đè cho các mảnh ion A, A] Aị và ghi tất cả các ion sinh ra trone khoảng khối lượnR chứa được tất cảcác ion A| , A| , A, , ví dụ: m/z từ 50 - 200 ta nói đã sứ dụng kỳ thuật Full Scan MS/MS m/z = A] (m/z = 50 - 200) Sac do tirons ứna có mũi cũng xuất hiện ở thời eian lưu tA nhưne shi tone cường độ các ion Aị A| , A] , và có thề phần nhỏ nào của ion A] chưa bị phân đoạn trọn vẹn

Kỹ thuật MS/MS được sử dụne để tăn lí độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đườns nền rất đáng kê Trong một nền phức tạp sử dụna kỹ thuật MS/MS ẹiúp xác nhận câu trúc và định lượns tốt hơn Tất nhiên ion A] phai đu sổ lượng dè cho ra đây đủ ion A| , Ai , Aị , đê có thê phát hiện và dò được

1.3.2.4 ủ n g dụng của M S trong kiêm nghiệm ph át hiện các chất trộn trải phép trong các san phâm thuốc.

* Định tỉnh :

- Phân tích khôi phô cỏ thê cho rất chính xác khối lượng các ion phân tư

M* (M I- 1)+, (M + 2)+ Đây là đặc trưne quan trọng của hợp chất hóa học

- Trone phân tích dược thườne sư dụim kết nối GC/MS hoặc iiPLC/MS Có thế so sánh phô nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với phô chât đối chicu đê khăna định thành phần định tính cua mẫu

* Xác định công thức cấu tạo:

Sau phân tích định tính xác định được công thức na,uyên tử cua chất nohièn cứu, nếu muốn xác định công thức cấu tạo cần nghiên cứu kỹ hơn phổ khối, trong trường hợp này cần dùng kỹ thuật ion hóa thích hợp Phân chất nghiên cứu thành nhiêu mánh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúna; Việc biện giải phổ khối xác

định cấu tạo của chất nghiên cửu dựa trên nhiều qui tắc kinh nghiệm, trong nhiều trường họp thường phối hợp phố khối với phố cộng hưởng từ hạt nhân và phổ IR.

* Định ìượng:

- Phân tích định lượng khối phố tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách

thiết lập đườne; chuẩn hoặc thêm đường chuân cùng với đo cường độ vạch phổ để xác định nồng độ

- Trong phân tích dược thường dùng các kết nối HPLC/MS, GC/MS hoặc CE/MS để có thế tăng đáng kể tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phươna; pháp phân tích mẫu

1.4 Thực trạng trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 trong thuốc đông dược

và thực phấm chức năng

1.4 Tình hình thế giói

Năm 2004, Gratz và cộng sự báo cáo phát hiện 19 sản phẩm thảo dược có trộn trái phép các dẫn chất chốne rối loạn cươn^ dương [16] Năm 2007, hội nạhị khoa học thường niên của hội đồng dược đien Mỹ đã có báo cáo phát hiện nhiều sản pham là thực phấm chức năng và đông dược có chứa các chất ức chế PDE-5

và dẫn chất của chúna ờ Mỹ, Anh, Hà Lan, Singapore, Trung Quốc, Hàn Quốc, Astralia, Nhật Bản Canada, Israel, Đức và Đài Loan Hội đồng dược điển Mỹ cũng công bố bảng đặc trưnơ khối phổ của một số chất chống rối loạn cương dương thuộc nhóm ức chế PDE-5 đế làm cơ sở cho việc định tính phát hiện một số chât ức chế PDE-5 bị trộn trái phép trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năng [26]

1.5 Tình hình trong nưóc

Năm 2008 Viện Kiêm nghiệm thuốc Trung ương đã phát hiện một số thực phẩm chức năng và thuốc đông dược có chứa các chất ức chế PDE-5 chưa được công nhận làm thuốc Năm 2009 Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm đã có quyết định yêu cầu các thuốc đông dược và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu dùng đê điêu trị rôi loạn cương dương phải kiêm tra phát hiện sự có mặt của chất

ức chế PDE-5 Vì vậy, từ năm 2009 đến nay Viện Kiểm nehiêm thuốc Trung ươne

đã tiến hành lấy mầu thuôc và thực phàm chức năng có ehi công dụne điều trị rối loạn cưtmỉỉ dương trên thị trường đê kiêm tra phát hiện các chất ức chế PDE-5 có thê bị trộn trái phép trong đó Đông thời các doanh nghiệp dược trong nước khi nhập khẩu thuốc đông dược và thực phẩm chức năng điều trị rối loạn cương dươne; cũne phải có giấy chứne nhận không bị trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 trons sản phàm của mình Do vậy xuât phát từ nhu câu phục vụ cône tác kiêm nghiệm chất lượng thuôc nhằm đám bảo sức khỏe cộng done chúng tôi tiến hành thực hiện

đê tài này đô xây dựng một phương pháp thống nhất trone, việc kiểm tra phát hiện các chất ức chế PDE-5 bị trộn trái phép trona thuốc và thực phấm chức năng

(a) Viên nang Mãnh Nam (Cty I NI1H

dược phàm Ngọc Khánh)

(b) Spartan (Malaisia)

■ -’ÌỌịệgỹgỊt ■ iị-ỊịẾệ

(c) Supai i on&kat All Plus (Malaisia)

Hình 1.9 Một so thực phâm chức năng đã phát hiện bị trộn ì rái phép chât

ức chế PDE-5

CHƯƠNG II

ĐÓ I T Ư Ợ N G V À P H Ư Ơ N G PH Á P N G H IÊ N c ứ u

2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

- Chất đối chiếu hóa học Sildenafil citrate, vardenafil hydrocỉorid, tadanafil

- Các sản phẩm đône dược và thực phẩm chức năng có ghi cône dụna bổ thận tráne dương, tăne cường khả năns sinh lý nam giới

+ Thuốc đông dược : Khang dược, Cườns, lực bô thận hoàn Mài cau nang Khang Minh, Nam Dươna, thất bảo đơn, Testovim

+ Thực phẩm chức năng : Viên bổ thận Hà Thành, Đại bồ thận Real Men - Wonderherb, Victory wort extract eroticism men's, Cường dược nam Lạng Rocket Alipas, Tantra Virile tablets Genshu, Rượu Vân Sơn tiên tửu

- Chất đối chiếu hóa học

+ Sildenafil citrate: chuân Dược diên Việt Nam hàm lượnẹ 98,38%

C22H3oN604S.C6H807 (nạuyên trạns) SKS: 0110265

+ Vardenafil hydroclorid: Chuẩn phònc thí nghiệm - Viện Kiểm nghiệm thuốc

tru n s ươna, hàm lượng 84,0% C23H32N60 7S (nguyên trạns;)

+ Tadalatìl: Chuẩn phòng thí nghiệm - Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ươn ạ hàm lượn2; 99.2% C22H19N3O4 (khan), ẩm 0,09%

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị dụng cụ tại Viện Kiểm Nehiẹm thuốc Trung ương (được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP) gồm có:

- Máy lăc siêu âm:

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204:

- Dụng cụ thuv tinh các loại

(a) Máy sắc ký siêu hiệu năng Agilent - (h) Máy sắc ký long khối phổ (LC - MS/MS)

Technologies 1200 Thermo Finigan LCQ Advantage Max

detector PDA vá MS/MS

Hình 2.1 Một sô thiết hi sir dụng trong nghiên cửu

2.3.1 Phirong pháp phát hiện các chất ửc chế PDE-5 bằng phưong pháp khối phổ trực tiếp (MS)

2.3.1.1 Nguyên tắc

Dựa vào ban” đặc trưng khỏi phô cua một sỏ chất ức chê PDH-5 dược hội đồng Dược diên Mỹ công bố (Bảng 2.1) đồng thời trên cơ sở tham khảo một sổ

các nghiên cứu đã công bố về quá trình phân mảnh của phân tử của các chất ức chế PDE-5 (Hình 2.2).

Bảng 2.1 Đặc trưng phô khối của các chất ức chế PDE-5[26]

thuốc đông dược và thực phấm chức năng đang lưu hành trên thị trường đề nắm được thành phần của chúng Chuẩn bị các mẫu thử có thành phần tươns tự như của một sô chế phâm đó Sildenafil, vardenafil, tadalafil và một số chất ức chế PDE-5 khác có thê bị trộn trái phép trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năng với mục đích tạo hiệu quả điều trị nhanh trái phép Liều có tác dụng điều trị của sidenafil là 50 meụ vardenafil là 10 mg và tadalafil 10 me, do đó liều lượng mà chúng trộn vào trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năng cũng thường tươne đương.

Như đã nói ở trên, đối với các chất ức chế PDE-5 có thể trộn trái phép trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năns chúng ta chỉ cần lựa chọn một hoặc một

hệ dung môi có khả năng hòa tan hoàn toàn các chất cần quan tâm, sau đó sử dụne;

kỹ thuật chiết thông thường để chiết

Dựa vào các tài liệu tham khảo, chúng tôi thấy tadanaíll khó tan Irong nước

và trong methanol Cả 3 hoạt chất trên đều tan được trong acetonitril Khi tiến hành triển khai phân tích bằng sắc ký lỏne thì với dung môi có pH acid làm cho hình dáng pic đẹp hơn, đồng thời nhiễu đường nền cũng được eiảm bót Do đó, chúng tôi khảo sát hỗn hợp dune môi acetonitril và đệm amoniacetat 0,05 M

pH=4,0 làm dung môi chiết

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện khối ph ổ

- Sử dụng detector khối phổ LCQ Advantage Max với kỹ thuật phun điện tử ion dương (+ESI)

+ ơ chê độ MS 1 lân, mức năng lượng ion hóa 0 V, hoặc mức năng lượng

ion hóa từ 20 V đến 50 V, đế phát hiện sự có mặt các mảnh khối ion phân tử

(mảnh mẹ)

+ Ở chế độ MS 2 lần, mức năng lượng va chạm E = 20% - 50%, để phát

hiện sự có mặt của các mảnh con đặc trưng

2.3.1.3 Đánh giá phương pháp

- Khảo sát độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của phương pháp dựa vào sự xuất hiện của mảnh khôi ion phân

tử [M+H]+ và các mảnh con đặc trưng và sai số của giá trị m/z trong khoảng ± lamu

2.3.2 Xây dựng chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định tính, định lưọng một số chất ức chế PDE-5

2.3.2.1 Nguvên tắc

Trên cơ sở so sánh thời gian lưu và độ lớn của tín hiệu của dung dịch chuân

và dung dịch thử, từ đó có thể định tính và định lượng chất cần kiếm tra Do đó phương pháp này chỉ có thể áp dụng đối với các chất có chuẩn để so sánh (sildenafil, vardenafil và tadalafil)

23.2.2 Khảo sát điểu kiện sắc kỷ

Qua nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các điêu kiện sắc ký trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năne cao (HPLC) AGILENT TECHNOLOGIES

1200 với detector u v -V IS (DAD) sử dụng cột pha đảo C18 (150 X 4,6 mm; 5|.ưn), bước sóng 280 nm, thể tích tiêm mẫu 25 |Lil, pha động là hồn hợp dung môi acetonitril và đệm amoniacetat 0,05 M pH=4,0 với các tỷ lệ khác nhau

2.3.2.3 Đảnh giá phương pháp

♦ Tính đặc hiệu

Trên sắc ký đồ, mẫu trắng phải không cho pic có thời gian lưu tươne ứng với thời gian lưu của mẫu chuấn

♦ Kháo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD) của mỗi chất được xác định dựa vào tỉ lệ đáp

ứng so với nhiễu đường nền: So sánh đáp ứng đo được từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S) Thiết lập tỉ số S/B Neu S/B = 3:1 thì được chấp nhận để thiết lập eiới hạn phát hiện

- Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện

♦ Kháo sát tỉnh tuyến tính

Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ cần đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x).

Xây dựng đường chuẩn 5 điểm (XI đến X5) của dung dịch có chứa chất chuẩn sildenafil, vardenaíìl và tadalafil ở trong khoảng nồng độ 1 |ig/ml - 2 0

|ig/ml

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan r của từng chất

♦ Khảo sát độ đủng

Áp dụng quy trình phân tích trên mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng Sau đó tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn Tính tỷ lệ lượng mẫu thu hồi lại được và lượne mẫu cho vào để có hiệu chuất chiết hay độ đúng của phương pháp

♦ Khảo sát độ ìặp lại

Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ Sử dụn? dune dịch sildenafil 10 ịxe/ml, vardenaíìl 10 |ig/ml xác định độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD % của diện tích pic

2.3.3 Khảo sát một số mẫu thuốc đông dưọc và thực phẩm chức năng điều trị rối loạn cương dương

2.3.3.1 Đ ối tượng phân tích và đối tượng khảo sát

- Đối tượng phân tích: sildenafil, vardenafil, tadalaíll và một số chất tương

tự chúng thuộc nhóm chất ức chế PDE-5 là những chất có thể bị trộn trái phép trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năng điều trị rối loạn cương dương

- Đối tượng khảo sát: Là các mẫu thuốc đông dược và thực phấm chức năng diều trị rối loạn cương dương đang lưu hành trên thị trườn? Hà Nội

2.3.3.2 Phương pháp

- Thu mẫu: Do thực nẹhiệm mang tính nghiên cửu khảo sát, do đó mẫu

thuốc được mua tại các nhà thuốc khác nhau trên thị trường Hà Nội và một số mẫu

được các cơ sở sản xuất và kinh doanh thuốc và thực phẩm chức năna gửi tới để kiểm tra phát hiện chất ức chế PDE-5 có thể bị trộn trái phép.

- Chuân bị mẫu: Cân một lượng bột thuốc tương đương với một viên thuốc sau đó chiết với dung môi chiết đã lựa chọn

- Tiên hành: Phân tích bang phương pháp khối phổ trực tiếp, nếu phát hiện

có chất ức chế PDE-5

+ Neu chất bị trộn trái phép là sidenaíìl hoặc vardenafil hoặc tadalafil thì tiêp tục định tính định lượng hoạt chất bị trộn trái phép xác định bằng phương pháp HPLC với detector DAD

+ Neu chất bị trộn trái phép không phải là sidenafil hoặc vardenafil hoặc tadalafil mà là các chất tương tự chúne, thì chúng tôi sử dung phương pháp LC-

MS đê xác định hàm lượng của chúng (hàm lượng quy theo sildenafil)

2.3.4 Phurong pháp xử lý số liệu

♦ M ột số đặc trưng thống kê

Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào công thức hoặc dựa vào các hàm

số trong Microsoft Excel

(có thể tính toán bằng hàm Stdev trong Microsoft Excel)

- Tính độ lệch chuẩn tươne đối:

RSD = = X 100%

~ X

♦ Tương quan hồi quy tuyến tính

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic săc ký và nồng độ chất phân tích:

Y = ax + b

- Hệ so eóc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel

- Hệ số chắn b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Excel

- Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft Excel

CHƯƠNG III

K ẾT Q U Ả V À B À N LU Ậ N

3.1 XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SÓ CHẤT ú c CHẾ

PDE-5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHÓI PHỎ T R ự C TIẾP (MS)

5 ml hỗn hợp dune môi chiết, thêm hỗn hợp dung môi chiết vừa đủ 50 ml

+ Mầu thử sildenafil : Lấy chính xác 1 ml duns dịch trên cho vào bình định mức dung tích 1 0 0 ml và pha loãng bằng dung môi pha mẫu vừa đủ the tích, lắc đều, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 |il

+ Mầu thử vardenafil : Lấy chính xác 5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức dune tích 1 0 0 ml và pha loãnơ bằng dung môi pha mẫu vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 |il

+ Mau thử tadalafil : Lấy chính xác 5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức dung tích 1 0 0 ml và pha loãng bằng dung môi pha mẫu vừa đủ thể tích, lắc đều lọc qua màng lọc kích thước 0,45 JJ.1

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ

Đe xác định điều kiện khối phô, trước tiên chủng tôi pha dung dịch chuân của từng chất trong pha động đế được các dune dịch sildenafil 1 0 |ig/ml,

vardenafil 1 0 |ig/ml, tadalaíìl 1 0 |ig/ml, sau đó bơm trực tiếp bang syringe và gọi phương pháp Tune plus chọn chế độ Positine ESI

Ket quả chúng tôi lựa chọn được điều kiện khối phố như sau: