Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil trong thực phẩm chức năng bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN VĂN CHÍNH MÃ SINH VIÊN: 1101056 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI SILDENAFIL, TADALAFIL VÀ VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG H

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN CHÍNH

MÃ SINH VIÊN: 1101056

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI SILDENAFIL, TADALAFIL VÀ

VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN CHÍNH

MÃ SINH VIÊN: 1101056

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI SILDENAFIL, TADALAFILVÀ

Nơi thực hiện:

Viện dinh dưỡng Quốc gia

HÀ NỘI - 2016

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN……… 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU……….3

1.1.1 Chất ức chế PDE-5….……… …….3

1.1.2 Sildenafil……… 4

1.1.3 Vardenafil……… ……6

1.1.4 Tadalafil……….………7

1.1.5 Các chất ức chế PDE-5 khác……….9

1.1.6 Một số phương pháp phân tích sildenafil, vardenafil, tadalafil hiện nay 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO … … 13

1.2.1 Khái niệm……… ………… …13

1.2.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao……….….12

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU……… …18

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU……… ……… 18

2.2.1 Chất chuẩn……….18

2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn các chất cấm……… 18

2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo và mẫu trắng…….………… 18

2.2.4 Dung môi, hóa chất……… …19

2.2.5 Thiết bị, dụng cụ……… … ….19

2.2.6 Nội dung nghiên cứu……….……20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….20

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích sildenafil, vardenafil, tadalafil bằng HPLC……….20

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu……… … 21

2.3.3 Thẩm định quy trình……….…….22

2.3.4 Áp dụng phương pháp chạy mẫu thị trường………24

2.4 XỬ LÝ KẾT QUẢ……….….24

CHƯƠNG 3 - THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ……….…….25

3.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu……….…….25

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký ……….….… 27

3.1.3 Quy trình phân tích đồng thời sildenafil, vardenafil và tadalafil trong thực phẩm chức năng……… ………34

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ……….… ……… 35

3.2.1 Độ lặp lại của hệ thống……….……….…35

3.2.2 Tính chọn lọc……….35

3.2.3 Khoảng tuyến tính……… … 38

3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng………40

3.2.5 Độ lặp lại của phương pháp ……… ……… …42

3.2.6 Độ thu hồi……… 44

3.3 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THỰC

TẾ TRÊN THỊ TRƯỜNG……… 50BÀN LUẬN

KẾT LUẬN

ĐỀ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MeOH Methanol

PAD Detector mảng diode(Photodiode array detector)

RSD (%) Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

AcCN Acetonitril

HPLC-

MS/MS

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performance

Liqiud chromatography – Mass spectrometry)

UV Tử ngoại (Ultraviolet)

v/v Thể tích/thể tích (volume/volume)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Một số phương pháp phân tích đồng thời các

chất ức chế PDE-5 11 2.1 Danh mục các pha động HPLC được khảo sát 21

3.1 Nồng độ các chất được tìm thấy với dung môi

3.2 Nồng độ của các chất tìm thấy với thời gian

chiết khác nhau 14 3.3 Chương trình gradient theo pha động 3 18 3.4 Chương trình gradient theo pha động 4 19 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống 23 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của

sildenafil, vardenafil, tadalafil 26

3.7 Giá trị S/N của các pic nạp chuẩn (bước sóng

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

1.1 Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các chất ức chế

phosphodiesterase-5 (PDE5) 3 1.2 Cấu trúc hóa học của sildenafil 5 1.3 Cấu trúc hóa học của vardenafil 6 1.4 Cấu trúc hóa học của tadalafil 7 1.5 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 3.1 Phổ hấp thụ của Sildenafil 15 3.2 Phổ hấp thụ của tadalafil 16 3.3 Phổ hấp thụ của vardenafil 16

3.4 Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 1 tại

3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 290nm,

3.10 Sắc ký đồ mẫu placebo tại bước sóng 290nm, cột HC-C18 24 3.11 Sắc ký đồ mẫu placebo nạp chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 290nm,

3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và

nồng độ của các chất tadalafil, sildenafil và vardenafil 27 3.13 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn nạp vào mẫu placebo 29 3.14 Sắc ký đồ mẫu M3 – Ngọc đế hoàn 40 3.15 Sắc ký đồ mẫu M5 – DHEA 50mg 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sức khỏe là một tài sản vô giá của con người, khi xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu về bảo vệ và nâng cao sức khỏe càng được quan tâm hơn Chính vì thế các thực phẩm chức năng ngày càng có cơ hội để phát triển Ngoài các thực phẩm chức năng có nguồn gốc sinh học và bán tổng hợp thì các thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược có ưu thế phát triển hơn cả Cùng với sự quản lý còn chưa chặt chẽ,

vì lợi nhuận hoặc vì muốn có tác dụng nhanh… các nhà sản xuất đã trộn trái phép thuốc tân dược vào thực phẩm chức năng

Năm 2010 Cục An toàn thực phẩm (ATTP) Bộ Y tế có Quyết định số ATTP thu hồi hiệu lực giấy chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số 16047⁄2010⁄YT⁄CNTC ngày 15.12.2010 cấp cho sản phẩm “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Khải Việt Hương cảng Canh Công Phu” Nguyên nhân là vì sản phẩm này có chứa hoạt chất sildenafil hàm lượng 4 mg/g, dù được quảng cáo trên mạng là “100%

160⁄QĐ-từ thảo dược…” Năm 2014, Cục An toàn thực phẩm cũng có quyết định thu hồi và tiêu hủy toàn bộ sản phẩm thực phẩm chức năng Kim thận bảo 1 New của Công ty TNHH Thương mại Dược phẩm Nam Á do có chứa chất tadalafil (36 mg/viên) và sildenafil (123 mg/viên) Và gần đây nhất là sản phẩm “Thận lực phiến” của công ty

cổ phẩn Dược phẩm Khang Đạt, cục An toàn thực phẩm đã phát hiện trong sản phẩm này chứa sildenafil với hàm lượng 18,18mg/viên

Ở Việt Nam, thì sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để kiểm tra các thực phẩm chức năng nói trên nhưng chỉ có thể triển khai được ở các phòng thí nghiệm tuyến trung ương hay khu vực Tuy nhiên vẫn chưa có phương pháp để áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm Vì vậy, cần thiết phải xây dựng một quy trình phù hợp và được chuẩn hóa để áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm,

kể cả phòng thí nghiệm ở các trung tâm y tế dự phòng phục vụ công tác quản lý an toàn thực phẩm

Xuất phát từ nhu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xây dựng quy trình phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil

trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 3

mục tiêu chính:

1 Khảo sát, xây dựng quy trình chiết xuất và phân tích bằng HPLC-PDA để xác định đồng thời sildernafil, tadalafil và vardenafil trong thực phẩm chức năng có tác dụng cương dương Thẩm định phương pháp đã xây dựng

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra một số mẫu thực phẩm chức năng có tác dụng cương dương trên thị trường

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Chất ức chế PDE-5

Các chất ức chế PDE-5 được khuyến cáo điều trị đầu tay cho rối loạn cương dương Tuy nhiên, không nên sử dụng các chất này ở nam giới có tiền sử đột quỵ, nhồi máu cơ tim hoặc những người có huyết thấp, đau thắt ngực không ổn định, suy tim nặng, suy gan hoặc suy thận giai đoạn cuối cần phải lọc máu

Cơ chế hoạt động của nhóm thuốc ức chế PDE-5:

Kích thích tình dục

Nitric oxid

GTP Guanylyl

cyclase

PDE-5

ức chế PDE-5

cGMP 5’-GMP Protein

là một enzyme phân hủy cGMP, vì vậy các chất ức chế PDE-5 sẽ ngăn cản quá trình

thủy phân cGMP, làm tăng tác dụng giãn mạch của NO, làm tăng cường khả năng cương dương cho các bệnh nhân bị rối loạn cương dương.[8],[ 22]

Sildenafil, tadalafil và vardenafil là 3 hợp chất có khả năng ức chế PDE-5 nên được sử dụng để điều trị rối loạn cương dương Ngoài ra, sildenafil và tadalafil còn được sử dụng để cải thiện khả năng vận động ở người trưởng thành khi có triệu chứng tăng huyết áp động mạch phổi (pulmonary arterial hypertension – PAH: áp lực máu cao trong mạch máu đến phổi là gây ra khó thở, chóng mặt, mệt mỏi) [22] Sildenafil và tadalafil điều trị chứng PAH bằng cách giãn mạch phổi và giúp máu lưu thông dễ dàng hơn.[5],[ 6]

Mặc dù ba chất này có cùng cơ chế hoạt động, tuy nhiên do sự khác biệt về cấu trúc phân tử (sildenafil và vardenafil có cấu hóa học tương đối giống nhau nhưng tadalafil lại rất khác) dẫn đến sự khác nhau về dược động học và hiệu quả lâm sàng [15],[ 22] Tadalafil có thời gian tác dụng kéo dài hơn, ít tác dụng phụ hơn và quá trình hấp thu không bị ảnh hưởng bởi thức ăn

Ba chất này thuộc chung nhóm chất gọi là nhóm chất ức chế phosphodiesterase (PDE), có nhiều tác dụng phụ và là những thuốc phải kê đơn và khi sử dụng phải được sự giám sát chặt chẽ của bác sĩ điều trị

Tên khoa học: 1-[4-ethoxy-3-(6,7

dihydro-1-methyl-7-oxo-3-propyl-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl) phenylsulfonyl]-4-methylpiperazine

pKa = 5,99

Bột kết tinh trắng đến trắng xám nhạt, không mùi, vị đắng, không tan trong nước

và ethanol, tồn tại dưới dạng muối với acid citric

- Tăng huyết áp động mạch phổi: đường uống 20mg x 3 lần/ngày

Tác dụng phụ thường gặp là nhức đầu, đỏ bừng mặt, rối loạn tiêu hóa, đau cơ và rối loạn thị giác tăng lên khi sử dụng liều >100 mg/ngày

- Sử dụng sildenafil và chất ức chế PDE-5 khác đồng thời với các nitrat hữu cơ

và nitrit (nitroglycerin) sẽ làm tăng tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp

- Thức ăn: mức độ và tốc độ hấp thu sildenafil bị giảm khi sử dùng đồng thời với thức ăn giàu chất béo

- Tác dụng của sildenafil tăng lên khi sử dụng đồng thời với thuốc ức chế CYP3A4 như thuốc chống nấm, kháng sinh marcrolid

1.1.3 Vardenafil

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của vardenafil

Công thức: C23H32N6O4S [15],[ 22]

Phân tử lượng: 488,604 g/mol

Tên khoa 7-propyl-3,5,6,8-tetrazabicyclo[4,3,0]nona-3,7,9-trien-2-one

Đường uống 10mg trước khi có nhu cầu quan hệ tình dục từ 25 – 60 phút Liều

có thể dao động từ 5- 20mg tùy thuộc vào hiệu quả lâm sàng

- Vardenafil chuyển hóa qua CYP3A4 và CYP2C9, vì vậy nếu dung chung với các thuốc ức chế hoặc kích thích CYP3A4 hoặc CYP2C9 sẽ làm thay đổi tác dụng của vardenafil như ketoconazol, erythromycin, chất ức chế protease, ritonavir, cimetidin…

- Với thức ăn: Tốc độ và mức độ hấp thu vardenafil giảm khi sử dụng cùng với bữa ăn có nhiều chất béo

1.1.4 Tadalafil

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của tadalafil

Công thức: C22H19N3O4 [15],[ 22]

Phân tử lượng: 389,404 g/mol

Tên khoa học: methyl-pyrazino [1’,2’:1,6] pyridol[3,4-b]indole-1,4-dione

Tăng huyết áp động mạch phổi

- Giống với các PDE-5 khác, khi sử dụng đồng thời tadalafil với các nitrat, nitrit

sẽ làm tăng tác dụng giãn mạch của các thuốc này, gây hạ huyết áp quá mức

- Tadalafil chuyển hóa qua CYP3A4, vì vậy khi sử dụng đồng thời với các thuốc cảm ứng enzym CYP3A4 như Phenobarbital, rifampicin…sẽ làm giảm tác dụng của tadalafil Sử dụng đồng thời với các chất ức chế CYP3A4 như ketoconazol, erythromycin…sẽ làm tăng tác dụng của tadalafil

- Với thức ăn: quá trình hấp thu của tadalail không bị ảnh hưởng bởi thức ăn

1.1.5 Các chất ức chế PDE-5 khác

Hiện nay chỉ có 3 dược chất tổng hợp thuộc nhóm chất ức chế PDE-5 được công nhận làm thuốc điều trị rối loạn cương dương là sildenafil, vardenafil và tadalafil Ngoài ra các chất tương tự chúng như: Homosildenafil, Hydroxyhomosildenafil, Acetildenafil, Nor-acetildenafil, Hydroxyacetildenafil, Piperadino acetildenafil, Piperadino vardenafil, Aminotadalafil, Dimethylsildenafil, Sulfosildenafi… chưa được công nhận làm thuốc

1.1.6 Một số phương pháp phân tích sildenafil, vardenafil và tadalafil hiện nay

Với tình hình phát triển của thực phẩm chức năng, đặc biệt là các thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược, 100% nguồn gốc tự nhiên có khả năng tăng

cường chức năng sinh lý ở nam giới và các báo cáo phát hiện việc trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 Ở Hồng Kông [26], một khảo sát năm 2007 đối với các sản phẩm thực phẩm chức năng không kê đơn liên quan đến cương dương cho thấy trong 26 sản phẩm được nghiên cứu, có một sản phẩm (4%) chứa chất sildenafil và

14 sản phẩm khác (54%) có chứa các chất tương tự như acetildenafil, hydroxyacetildenafil, hydroxyhomosildenafil (các chất tương tự sildenafil) và piperidenafil (chất tương tự vardenafil) Cũng theo Ying-Hoo Lam và cộng sự [26], khi nghiên cứu một sản phẩm thực phẩm chức năng từ thảo dược có tên là Power 58 Platinum, được mua từ một hiệu thuốc ở Hồng Kông, một chất mới tương tự vardenafil cũng đã được phát hiện Đây là một sản phẩm thủy phân của vardenafil,

có tên gọi 4-one

2-(2-ethoxy-phenyl)-5-methyl-7-propyl-3H-imidazo(5,1-f)-(1,2,4)triazin-Ngoài ra, việc sử dụng các chất ức chế PDE-5 mà không có chỉ dẫn của bác sĩ có thể gây ra những tương tác nguy hiểm cho đến người sử dụng Ví dụ, nếu sử dụng chúng cùng với các thuốc giãn mạch nitrat có thể gây hạ huyết áp nghiêm trọng [22]

Vì vậy trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu nhằm phát hiện các chất sildenafil, vardenafl, tadalafil và các chất có cấu trúc tương tự Phương pháp phổ biến nhất để phân tích sildenafil, tadalafil, vardenafil và các hợp chất ức chế PDE tương tự là sắc

ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV/PDA [12],[ 14],[ 17],[ 18],[ 20],[ 24],[ 26] hoặc sử dụng detector khối phổi MS [11],[ 19],[ 21],[ 25] Một số ít nghiên cứu khác sử dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ [11] để xác định các chất này Đối với các chất đồng phân hoặc chất mới, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) hoặc X-ray [16],[ 23],[10] thường được dùng để xác định cấu trúc trong các nền mẫu dược phẩm hay thực phẩm chức năng

Ở Việt Nam, gần đây Cục An toàn thực phẩm đã kiểm tra chất lượng các thực phẩm chức năng có tác dụng cương dương xem có tình trạng trộn trái phép các chất

ức chế PDE-5 hay không Tuy nhiên, phương pháp đã được áp dụng là sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) nên chỉ có thể triển khai được ở các phòng thí nghiệm tuyến trung ương hay khu vực, nơi được trang bị sắc ký lỏng khối phổ rất đắt tiền, vẫn chưa có phương pháp tiêu chuẩn để áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm Vì vậy cần thiết phải xây dựng một quy trình phù hợp và được chuẩn hóa để áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm, kể cả phòng thí nghiệm ở các trung tâm y tế dự phòng phục vụ công tác quản lý an toàn thực phẩm

Tham khảo các nghiên cứu đã công bố trên thế giới và căn cứ các điều kiện trang thiết bị, đề tài này lựa chọn kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA nhằm xây dựng một phương pháp phân tích đồng thời các chất sildenafil, tadalafil

và vardenafil trong một số loại thực phẩm chức năng liên có tác dụng cương dương

ở nam giới, góp phần đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

STT Mẫu

phân tích

Kỹ thuật phân tích

Điều kiện phân tích HPLC Xử lý mẫu TLTK

1

Viên nén Viên nang

DAD LC-ESI-MS/MS

LC-Cột C18 (25 cm x 4.6mm, 5µm)

Pha động: Acetonitril:

ammonium formate 0,01M (38 :62)

Tốc độ dòng 1ml/phút

Thể tích bơm 10µl Bước sóng :230nm

Cân 30mg mẫu dạng bột

Chiết bằng acetonitril, siêu

âm 30 phút, sau

đó lọc qua màng 0,45µm

[19]

2

Viên nén Viên nang (cứng hoặc mềm) Bột

MS/MS

LC-Cột C18 (2.0mm x 100mm, 3µm)

Pha động: Gradient

 kênh A (ammonium formate 2mM)

 kênh B (Acetonitril) Tốc độ dòng 0,3ml/phút

Cân 0,5g mẫu dạng bột

Chiết bằng methanol : nước (70:30)

Siêu âm 30 phút, sau đó lọc qua màng 0,2µm

[13]

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích đồng thời các chất ức chế PDE-5

3

Mẫu dạng lỏng(rượu vang, dung dịch uống, nước uống)

ESI/MS

HPLC-Cột C18 (5µm) Pha động: Gradient

 Kênh A: acetonitril

 Kênh B: ammonium acetate 0,02M/ acid formic (0,2%

v/v) Tốc độ dòng 1ml/phút

Thể tích bơm 5µl Bước sóng 292nm

Mẫu được lọc qua màng 0,45µm Dịch lọc pha loãng với methanol đến nồng độ thích hợp

[25]

4

Viên nén Viên nang

HPLC-UV

Cột C18 (100mm x 4.6mm, 2.6µm)

Tốc độ dòng 0,5ml/phút

Thể tích bơm 5µl Bước sóng phát hiện 290nm

Cân một lượng bột tương đương với một đơn vị liều Chiết bằng acetonil:methanol Vortex 30 phút, sau đó siêu âm 5 phút rồi ly tâm 10 phút ở 2400 vòng/phút

[14]

1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.2.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC)

là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích được hòa tan trong pha động và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào ái lực tương đối của chất phân tích với pha tĩnh và pha động mà các chất sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn đến thứ tự rửa giải của các chất cũng khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1],[ 4]

1.2.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hình 1.5 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao[1]

a Hệ thống cấp pha động

Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp Trước khi sử dụng, cần lọc (màng 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động Có thể loại khí bằng chạy siêu âm, sục khí trơ như heli…

Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh Có hai cách dùng pha động rửa giải:

Hệ thống cấp

Bộ phận tiêm mẫu

Lò cột

Cột sắc ký Detector

Hệ thống thu nhận

và xử lý dữ liệu

- Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi)

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ thường

có chiều 10-30cm, đường kính trong từ 2-5 mm, hạt chất nạp cớ 5-10µm Cột có đường kính trong lớn hơn được dùng cho sắc ký điều chế.Chất nạp thường là silica gel hoặc silicagel có bao phủ một lớp mỏng hữu cơ hoặc liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Bên cạnh silica gel người ta còn dùng các chất liệu khác như: nhôm oxyd, polymer xốp, nhựa trao đổi ion….tùy thuộc vào loại hình sắc ký

Có bốn kỹ thuật HPLC cơ bản: sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký loại cỡ Trong đó sắc ký phân bố là kỹ thuật HPLC được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc Dựa vào pha tĩnh người ta chia sắc ký lỏng phân bố thành sắc

ký lỏng – lỏng (pha tĩnh là lớp chấp lỏng bao quanh các chất nhồi cột) và sắc ký pha liên kết (pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất nhồi cột) Hiện nay, do những ưu điểm của nó, nên sắc ký pha liên kết được sử dụng phổ biến, thay thế cho sắc ký lỏng – lỏng

Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan

Nhóm –OH trên bề mặt hạt silica (chất nhồi cột) phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

Dựa vào gốc R người ta chia pha tĩnh thành hai nhóm:

- Pha tĩnh không phân cực:

- Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như triethylen glycol, nước Còn pha động là dung môi ít phân cục hơn như hexan, isopropyl ether

- Sắc ký phân bố pha đảo: thường dùng pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon, pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ hấp thụ của chất phân tích trong một khoảng bước sóng nhất định (190nm-800nm) ứng dụng để định tính bằng cách so sánh phổ với chất chuẩn tương ứng, có thể xác định được bước sóng hấp thụ cực đại ứng dụng trong định lượng, tín hiệu nhiễu thấp hơn so với detector UV-VIS bình thường

f Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính có khả năng ghi nhận, xử lý, và lưu trữ thông tin

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số sản phẩm chức năng có tác dụng cương dương ở nam giới

2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn các chất

- Dung dịch chuẩn gốc đơn từng chất: Với mỗi chất sildenafil, tadalafil,

vardenafil, tiến hành cân chính xác khoảng 0,01g chất chuẩn, hòa tan bằng acetonitrile và định mức trong bình định mức 10,00 ml được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 ppm Bảo quản ở nhiệt độ 0oC đến khi dùng

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất: từ dung dịch chuẩn gốc, pha dãy chuẩn hỗn

hợp có nồng độ các chất từ khoảng 0,5 ppm đến 350 ppm bằng cách hút chính xác đồng thể tích các chuẩn gốc đơn từng chất sau đó pha loãng trong acetonitrile Dung dịch chuẩn hỗn hợp được bảo quản ở 0oC đến khi dùng

2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo và mẫu trắng

- Mẫu placebo: Do nền mẫu là thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược nên thành phần nền mẫu của các sản phẩm rất đa dạng Vì vậy trong đề tài này

chúng tôi khảo sát thành phần nền mẫu của 10 mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường, sau đó chọn nền mẫu có tính đại diện nhất và không chứa các chất sildenafil, vardenafil và tadalafil làm mẫu placebo Sau đó tiến hành chiết theo quy trình chiết

2.2.4 Dung môi, hóa chất

- Natri hydroxyd, natri dihydrophosphat monohydrate, potassium dihydrogen phosphate đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích (PA) của Merck- Đức

 Đệm phosphat (pH=3,5): Hòa tan 68,0g kali dihydrophosphat (TT) trong nước vừa đủ 1000 ml, điều chỉnh pH bằng acid phosphoric (TT) [2]

 Đệm phosphat (pH=6,5): Hòa tan 13,8 g natri dihydrophosphat monohydrate (TT) trong 900ml Điều chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxyd 40% (TT) và them nước vừa đủ 1000ml [2]

- Acetonitrile, methanol (MeOH) dùng cho HPLC của Merck - Đức

- Nước khử ion 18mΩ

2.2.5 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Waters Alliance gồm bơm Waters 2695 và bộ phận bơm mẫu tự động - Detector Diode Array 2996 (Mỹ) với phần mềm Empower software

- Máy siêu âm Elmasonic S80H (Đức)

- Máy lắc vortex Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600, M37619-26 (Mỹ)

- Máy ly tâm Hettich Rotofix II (Đức)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi; lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm

- Cân phân tích Sartorius BP 121S (d = 0,1 mg; Max 120g) (Đức)

- Ống nghiệm thủy tinh 15ml, ống nghiệm PTFE 15ml, ống falcol 50ml

- Pipetman 100 – 1000 µl, 20 - 200µl, 10 – 100 µl

- Các dụng cụ khác: Bình định mức, pipet thủy tinh, cốc có mỏ

2.2.6 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết sildenafil, vardenafil và tadalafil trong các mẫu thực phẩm chức năng

- Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC để phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil

- Thẩm định quy trình phân tích và xử lý mẫu

- Áp dụng quy trình và xử lý mẫu với một mẫu với một số sản phẩm trên thị trường

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dựa trên các nghiên cứu của Samuel và cộng sự [21], Ida Fej˝os và cộng sự [14] cùng với các nghiên cứu trên thế giới kết hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm, chúng tôi cố định một số thông số chạy sắc ký sau:

- Cột HC-C18.

- Dải bước song quét phổ: 190-800nm

- Nhiệt độ cột: 35o

C

2.3.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của các chất phân tích và các tài liệu tham khảo [14],[ 19],[ 25], chúng tôi khảo sát khả năng chiết các chất ra khỏi nền mẫu với các dung môi chiết CH3CN - CH3OH (1:1), CH3CN - H2O (1:1) và CH3CN 100% với thời gian chiết 20 phút, 30 phút và 40 phút

Quy trình chiết mẫu

Mẫu thực phẩm chức năng



Cân chính xác khoảng 0,5g mẫu vào bình định mức 10ml

Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào HPLC

2.3.2 Khảo sát các điều kiện phân tích sildenafil, vardenafil và tadalafil bằng HPLC

Thành phần pha động ảnh hưởng rất nhiều tới quá trình sắc ký Pha động khác nhau sẽ có độ phân cực khác nhau Dựa vào các bài báo tham khảo [14],[ 21],[ 26] chúng tôi tiến hành khảo sát hai pha động có thành phần như sau:

Bảng 2.1 Danh mục các pha động HPLC khảo sát

Thành phần pha động

Kênh A Kênh B Kênh C

Pha động

1

Đệm phosphate (pH=3,5)

CH3CN CH3OH

Pha động

2

Đệm phosphate (pH=6,5)

CH3CN CH3OH

2.3.3 Thẩm định quy trình

Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích sildenafil, vardenafil và tadalafil bằng HPLC được thẩm định [3],[ 7],[ 9] về các tiêu chí sau:

 Mẫu chuẩn hỗn hợp sildenafil, vardenafil và tadalafil

 Mẫu placebo, mẫu placebo nạp chuẩn

- Tiến hành chạy sắc ký 4 mẫu trên, so sánh các pic trên các sắc ký đồ thu được

- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu được, tại thời điểm xuất hiện pic của các chất ức chế PDE-5 không được xuất hiện pic lạ

b Độ lặp lại của hệ thống

- Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký

- Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,00%

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ tăng dần Giới hạn dưới của đường chuẩn xác định dựa vào giá trị LOQ, giới hạn trên của đường chuẩn căn cứ vào hàm lượng các chất ức chế PDE-5 được trộn vào thực phẩm chức năng từ các nghiên cứu trước đó và liều gây ra tác dụng của

sildenadil, vardenafil và tadalafil Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r

- Yêu cầu: đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và 0,995

≤ r ≤1

d Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lượng được theo phương pháp

đã xây dựng với độ chính xác và độ đúng thích hợp

- Cách xác định: Thêm chuẩn với nồng độ giảm dần vào mẫu placebo

và xác định giá trị S/N tương ứng LOD là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu

đo lớn hơn gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N=3), LOQ là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N=10), thường xác định giá trị LOQ dựa trên giá trị LOD qua công thức

LOQ = 3xLOD

e Độ lặp lại của phương pháp

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả

- Cách xác đinh: Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng) xác định bằng cách tiến hành 10 phép thử song song trên một mẫu placebo nạp chuẩn (mỗi lần bắt đầu từ cân hay đong mẫu) Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD (%)

- Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chẩn tương đối RSD (%) của sildenadil, vardenafil và tadalafil phải không lớn hơn 11,00% tại mức nồng độ 1 ppm và 7,3% tại mức 10 ppm [9]

f Độ thu hồi

- Xác định độ thu hồi của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo Lượng chuẩn thêm vào ở 3 mức nồng độ: nồng độ thấp, nồng độ trung bình, nồng độ cao Tại mỗi mức nồng độ, phân tích lặp lại 10 lần Tính tỷ lệ thu hồi của các chất sildenafil, vardenafil và tadalafil thêm vào mẫu thử

- Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 80% - 110% tại mức nồng độ 100 ppb, 1 ppm, 10 ppm [9]

2.3.4 Áp dụng phương pháp chạy mẫu thị trường

Nhằm bước đầu đánh giá sự có mặt các chất sildenafil, tadalafil, vardenafil trong một số thực phẩm chức năng có tác dụng cương dương, đề tài lựa chọn phương pháp chọn mẫu có chủ đích, khoảng 10 loại thực phẩm chức năng liên quan đến cương dương trên thị trường, mỗi loại một mẫu Phân tích sildenafil, tadatafil và vardenafil trong các mẫu thu thập theo quy trình đã chuẩn hóa để bước đầu kiểm tra

sự có mặt của các chất này trong thực phẩm chức năng trên thị trường

2.4 XỬ LÝ KẾT QUẢ

Kết quả phân tích được xử lý bằng phần mềm Empower 3 (Waters, Mỹ) và tính toán bằng Excel

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Qua tham khảo nhiều bài báo của các tác giả trên thế giới [14],[ 19],[ 25] chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi chiết và thời gian chiết của quy trình chiết sau:

Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào HPLC

3.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Qua tham khảo tài liệu đã công bố về hiệu quả chiết của các dung môi, chúng tôi tiến hành khảo sát chiết trên ba loại dung môi là CH3CN - CH3OH (1:1) hoặc

CH3CN - H2O (1:1) hoặc CH3CN 100% Hỗn hợp chuẩn sildenafil, tadalafil và vardenafil được nạp vào mẫu sau đó tiến hành chiết bằng 3 dung môi khác nhau sử dụng sóng siêu âm, trong thời gian 30 phút

Bảng 3.1 Nồng độ các chất được tìm thấy với dung môi khác nhau

Tên chất

Hàm lượng tìm thấy (µg/g) AcCN -

MeOH AcCN

AcCN -

H2O Tadalafil 64,04 64,53 59,62 Sildenafil 67,05 74,49 63,76 Vardenafi

l 68,57 71,05 52,97 Kết quả trên cho thấy, khi chiết bằng dung môi AcCN - H2O (1:1) và AcCN - MeOH (1:1) lượng chất thu hồi được thấp hơn khi chiết bằng AcCN 100% Mặt khác, AcCN còn có khả năng kết tủa loại một số tạp như protein trong mẫu và acetonitril có khả năng hòa tan tốt cả 3 chất sildenafil, tadalafil và vardenafil Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung môi chiết là acetonitril

b Khảo sát thời gian chiết

Hỗn hợp chuẩn sildenafil, tadalafil và vardenafil (được nạp vào 0,5g mẫu placebo) chiết bằng sóng siêu âm trong các khoảng thời gian 20 phút, 30 phút và 40 phút

Bảng 3.2 Nồng độ của các chất tìm thấy với thời gian chiết khác nhau

Tên mẫu Hàm lượng (µg/g)

Tadalafil Sildenafil Vardenafil

40 phút, vì vậy chúng tôi chọn thời gian chiết bằng siêu âm tối ưu là 30 phút

Từ các kết quả khảo sát trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện xử lý mẫu như sau:

- Sử dụng dung môi chiết là Acetonitril

- Thời gian chiết là 30 phút bằng siêu âm

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Để lựa chọn bước sóng phát hiện đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil, chúng tôi chọn detector PDA để phát hiện Tiến hành quyết phổ trong khoảng 190-400nm, xác định bước sóng hấp thụ cực đại của từng chất

b Khảo sát điều kiện chạy sắc ký

Để xây dựng quy trình phân tích các chất ức chế PDE-5 bằng HPLC, chúng tôi

cố định các thông số dưới đây trong quá trình nghiên cứu:

- Cột C18 (cột Agilent HC-C18 (2) 150 mm x 4,6mm, 5 µm)

- Detector: bước sóng 290nm

- Nhiệt độ cột: 35o

C Qua tham khảo các bài báo nghiên cứu trên thế giới [14],[ 21],[26] chúng tôi tiến hành khảo sát pha động sử dụng đệm phosphat (pH=3,5) và đệm phosphat (pH=6,5) chế độ đẳng dòng hoặc gradient với methanol và acetonitril

Pha động 1: Đệm phosphat (pH=3,5)/ Methanol (60/40)

Hình 3.4 Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 1 tại

Hình 3.5 Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 2 tại 290

nm, cột HC-C18

Nhận xét: với pha động 2, khi sử dụng acetonitrile thay thế cho methanol thì các chất cần phân tích ra rất sớm, rất dễ bị lẫn các tạp trong nền mẫu nên cũng không phù hợp với nền mẫu phức tạp

Pha động 3: Đệm phosphat (pH=6,5)/ Acetonitrile/Methanol (gradient như bảng

dưới)

Bảng 3.3.Chương trình gradient theo pha động 3

Thời gian % đệm phosphat % MeOH % MeCN

Hình 3.6 Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 3 tại 290

nm, cột HC-C18

Nhận xét: khi sử dụng đệm phosphat (pH=6,5), kết quả khảo sát cho thấy khả năng tách các chất là tốt nhất nếu sử dụng acetonitrile và methanol với tỷ lệ 1:1 và chạy gradient với đệm phosphate (pH=6,5) Kết quả khảo sát pha động 3 với chế độ gradient đã cải thiện khả năng tách các chất, tuy nhiên 2 pic sắc ký của sildenafil và vardenafil vẫn còn sát nhau, các chất vẫn ra sớm có khả năng lẫn tạp trong nền mầu

Pha động 4: Sau nhiều giai đoạn khảo sát pha động, đề tài đã lựa chọn được

dung môi và chế độ chạy HPLC tối ưu để tách các chất sildenafil, tadalafil và vardenafil khỏi nhau và tách khỏi các tạp trong nền mẫu, chế độ chạy đó được tổng

hợp như sau: A = Đệm phosphat (pH=6,5); B = Acetonitrile; C = Methanol

Bảng 3.4 Chương trình gradient theo pha động 4

Thời gian

(phút) % A % B % C

Tốc độ dòng (ml/phút) Ghi chú

0 70 15 15 1

3 60 20 20 1 Tăng đều tỷ lệ % B và % C từ

15 – 20%

Hình 3.8 Sắc đồ mẫu placebo nạp chuẩn, pha động 4, cột HC-C18

3.1.3 Quy trình phân tích đồng thời sildenafil, vardenafil và tadalafil trong thực phẩm chức năng

Từ kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi xây dựng quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc sắc có thể tách đồng thời 3 chất sildenafil, vardenafil và tadalafil như sau: