Báo cáo hoá sinh emzyme

Enzim là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng,sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong cộng nghệ chế biến thực phẩm,trong y học,trong kĩ thuật phân tích,trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường.Có rất nhiều phức hệ enzim.Ta sẽ nghiên cứu 2 phức hệ cellulase và pectinase.

Enzim là chất xúc tác sinh học khơng chỉ cĩ ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng,sinh sản của mọi sinh vật mà nĩ cịn đĩng vai trị rất quan trọng trong cộng nghệ chế biến thực phẩm,trong y học,trong kĩ thuật phân tích,trong cơng nghệ gen và trong bảo vệ mơi trường.Cĩ rất nhiều phức hệ enzim.Ta sẽ nghiên cứu 2 phức hệ cellulase và pectinase.

Pectinase

Pectinase là hệ enzym có tác dụng lên pectin dạng hoà tan, làm giải phóng nhóm metoxy (CH3O-) và phần polysaccarit còn lại được gọi là axit pectic (hay

polygalacturonic)

I-PECTIN: (thuộc nhóm chất xơ hoà tan )

Pectin là polysaccarit có nhiều trong quả ,củ, hoặc thân cây

Ở thực vật ,pectin tồn tại dưới hai dạng :dạng protopectin không tan và dạng pectin hoà tan

+Tên gọi pectin dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic metyl hoá 100%

+Axit pectinic dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic metyl hoáthấp hơn 100% + Axit pectic dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic hoàn toàn không chứa nhóm metyl

Tuy nhiên trong thực tiễn thì pectin đựoc dùng chỉ cả pectin va axit pectinic

Protoprectin không tan: chủ yếu ở thành tế bào, kết hợp với polysaccharide araban

Pectin hoà tan: chủ yếu ở dịch bào Pectin hoà tan là polysaccharide cấu tạo bởi các gốc acid galaturonic, trong đó một số gốc acid có chứa nhóm thế methoxy

Dạng không tan có thể chuyển hoá thành pectin hoà tan trong môi trường acid,

ở nhiệt độ sôi, hay khi có mặt enzim protopectinase

II-HỆ ENZYM PECTINASE:

Pectinase có trong cả thực vật và vi sinh vật.Ở đây ta chỉ xét việc thu nhận và ứng dụng của pectinase từ vi sinh vật

 Đặc điểm của hệ enzym pectinase ở vi sinh vật :

Theo quan điểm hiện đại ,trong phức hệ enzym pectinase có các enzym :pectinesterase;polygalacturonase;protopectinase;transeliminase

1/.Pectinesterase: (pectase-3.1.1.11)

-Enzym này thu đuợc từ canh trường nấm mốc A.niger ở trạng thái đồng thể ,N-axit amin cuối trong phân tử là phenylalanin

-Pectinesterase thuỷ phân liên kết este trong pectin cũng như trong các axít pectic để tạo thành metanol và axít pectinic

pectin + nH2O  CH3OH + axit pectinic

- Pectinesterase của nấm mốc thì tham gia thuỷ phân sâu sắc hơn so với pectinesterase thực vật

- Pectinesterase co ùnguồn gốc khác nhau thì có pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu khác nhau

- Các ion Ca2+ ,Na+ ;các clorua của Na ,Ca,K sẽ hoạt hoá pectinesterase ; còn cation hoá trị 3 và 4 thì kìm hãm tác dụng của nó

2/.Polygalacturonase:(pectinase-3.2.1.15) (tên hệ thống là :

polygalacturonitglucanhdrolase )

Dựa vào cơ chế tác dụng có the åchia ra thành :

-Endopolygalacturonase (còn gọi là polygalacturonase dịch hoá ) : phân cắt liên kết α-1,4 ở phía trong phân tử pectin cũng như phía trong phân tử axit polygalacturonic

-Exopolygalacturonase (còn gọi là polygalacturonase đường hoá ) : phân cắt dần dần từng phân tử acid galacturonic một ,bắt đầ từ đầu không khử của mạch

pH tối ưu phụ thuộc vào nguồn thu va cơ chất ; đa số polygalacturonase bền vững ở pH từ 4,0 đến 6,0 ;nhiệt độ tối ưu khoảng 40-50oC và bị vô hoạt ở 55-65oC

Polygalacturonase cũng được hoạt hoá bởi cation kim loai kiềm và NH4+

3/Protopectinase: tách araban và galactan ra khỏi protopectin để tạo thành dẫn xuất

metyl của axit polygalacturonic (tức là pectin hoà tan )

4/.Transeliminase: phân huỷ pectin bằng con đường phi thuỷ phân tạo ra đơn phân là

galacturonic có chứa nối đôi (4-deoxy-5-xetogalacturonic)

Transeliminase có tính đặc hiệu cao nên ngfưòi ta chia nó thành :

+endopectintranseliminase +exopectintranseliminase +endopectinc-transeliminase +exopectinic-transeliminase

Transeliminase có nguồn gốc khác nhau thì có cơ chế tác dụng và thuộctính khác nhau

III.Ứng dụng:

Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinaza dưới dạng tinh khiết Pectinaza thường được sử dụng trong các ngành cơng nghiệp thực phẩm sau:

- Sản xuất rượu vang

Sản xuất nước quả và nước uống không rượu

- Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt

- Sản xuất nước giải khát

- Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan

Trong sản xuất rượu vang,nước quả và các nước uống không rượu dều có thể sử dụng pectinaza một cách hiệu quà

Có pectinaza các quá trình ép làm trong và lọc d ịch quả rất dễ dàng làm tăng hiệu xuất của sản phẩm

ví dụ dưa pectinaza vào khâu nghiền quả sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép 15-25 Khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo,

do dó khi ép dịch quả không thoát ra dược.

nhừ pectinaza phân giải các chất pectin di mà dịch quả trong suốt không bị vẩn dục và lọc rất dễ dàng.

Pectinaza còn góp phần chiết rút dược các chất màu, tanin và những chất hòa tan, làm tăng thêm chất lượng của sản phẩm

Trong sản xuất các mặt hàng từ quả nhờ pectinaza có thể thu dược dịch quả có nờng dợ dậm dặc

Ví dụ: dịch táo cơ dặc dến 72 dợ Brix, nếu khơng tách các pectin tự nhiên thì sãn phẩm sẽ bị keo tụ mợt cách mạnh mẽ và khơng thể cơ dặc thêm nữa

Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinaza dể tách lớp keo ở trên bề mặt hạt cà phê

CELLULASE

Cellulase là phức hệ enzym có tác dụng rất quan trong trong việc thuỷ phân cellulose.Đây là enzym thuộc nhóm enzym hydrolase thuờng chỉ thấy ở vi sinh vật

I-CELLULOSE: là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật ; trong bông chiếm

khoảng 90% ,còn trong gỗ chiếm hơn 50%.;Hằng năm cellulose do thực vật tởng hợp khoảng 1011 tấn Sự tạo cellulase chủ yếu do thực vật còn phân huỷ nó thì chủ yếu do

vi sinh vật

Cellulose có nhiều hơn tất cả các hợp chất hữu cơ khác của cơ thể sống vì nó là nguyên liệu chính của thành tế bào thực vật, giúp mô thực vật có độ bền

cơ học và tính đàn hồi

Cellulose là chất được trùng hợp từ các đơn phân tử glucose, mạch thẳng được tạo bởi -D- glucose bằng liên kết -1,4 glucoside

Cellulose là chất rắn, trắng , không mùi vị, không tan trong nước ngay cả khi đem đun nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường (rượu, ether, benzen)

Trong tế bào thành cây xanh, các vi sợi cellulose sắp xếp dưới dạng các lớp xen phủ, như thể tạo nên một cấu trúc rất dai, và chắc Đôi khi thành tế bào còn được củng cố bằng một nguyên liệu gọi là lignin, chất này chèn vào khoảng không giữa các vi sợi cellulose

Được ứng dụng trong chất tẩy rửa, chủ yếu đễ làm mềm vải

ình 1 – Liên kết -1,4- glucoside

Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì trong cơ thể người không có enzim phân huỷ được cellulose Động vật nhai lại có thể tiêu hoá dễ dàng cellulose vì trong dạ dày chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzym cellulase có tác dụng thuỷ phân cellulose

Thành tế bào thực vật

Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật Các đơn vị cấu tạo cellulose gắn với nhau nhờ liên kết glucoside

VỊ TRÍ TÁCH NƯỚC CỦA LIÊN KẾT 

LIÊN KẾT -1,4- GLUCOSIDE

Trật tự sắp xếp của Fibril, Microfibril và Cellulose trong tế bào thực vật

Mỗi đơn vị cấu trúc nên cellulose là một anhydride d-glucose Mỗi gốc glucose chứa ba nhóm – OH ở nguyên tử Carbon thứ hai, thứ ba và thứ sáu (trong đó nhóm – OH đính trên C6 là nhóm rượu bậc I, còn lại là nhóm rượu bậc II)

Gốc anhydride d-glucose có vòng 6 cạnh piranose (nhờ 5 nguyên tử C và nguyên tử O) liên kết 1-4 glucoside

Phân tử cellulose chứa từ 1.400 – 10.000 gốc glucose không xoắn mà duỗi thẳng Phân tử lượng của các cellulose thu được từ các nguồn khác nhau xê dịch trong giới hạn khá rộng (từ 5.104 – 106 hoặc cao hơn)

Chuỗi phân tử Cellulose

Dùng phương pháp phân tích tia Rontgen, người ta xác định được phân tử cellulose có dạng sợi

THÀNH TẾ

BÀO

TẾ BÀO THỰC

VẬT

Chuỗi phân tử Cellulose

Các dạng sợi của cellulose lại gắn vào nhau nhờ các liên kết hydro tạo nên cấu trúc mixen của cellulose

Liên kết Hydro giữa các phân tử Cellulose tạo cấu trúc Micelle

các sợi celluose liên kết lại với nhau tạo thành từng bó sợi, các bó sợi lại liên kết với nhau tạo thành đại phân tử cellulose.

II-CELLULASE: là phức hệ hydrolase bao gồm từ C1 đến Cx và β-glucozidase , có vai

trò là thuỷ phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose

Chế phẩm cellulase Mô hình phân tử cellulase

*Cơ chế tác dụng của cellulase như sau:

Ở giai đoạn đầu dưới ảnh hưởng của enzym C1 ,những mảnh

polyanhydroglucose có kích thước lớn được tách ra khỏi cellulose không hoà tan ban đầu ; sau đó dưói tác dụng của enzym Cx mảnh vừa được tạo thành sẽ bị phân ly thành oligosaccarit cho đến cellobiose Như vậy , cellulase C1 tác dụng trên cellulose nguyên thủy ,cellulase C2 tácdụng trên cellulose đã biến hình nhưng vẫn không hoà tan ,cellulase Cx tác dụng trên cellodextrin hoà tan hoặc các dẫn xuất hoà tan ,còn cellobiase thì tác dụng trên các disaccaritcellobiose để tạo ra glucose

Sơ dồ minh hoạ tổng quát cơ chế tácdụng cùa cellulase:

Mô hình cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose

*Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ một số loại nấm Ví dụ :nấm

Morythesium verrucaia tạo cellulase sáu cấu tử ;Polyporus versicolor tạo cellulase 4

cấu tử ;…

*Tính đặc hiệu của cellulase trên các liên kết glucoside rất rộng rãi :chúng có thể thuỷ phân được xilan (β -1,4);glucomanan(β -1,4);lichenin (β -1,3 va β –

1,4);polysaccarit của mật (α-1,2) ;laminarin (β -1,3);lutean(β -1,6)

Các chế phẩm cellulaza thường được dùng để:

 Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc

chúng ta đều biết, celluloza là hợp phần quaon trọng của vỏ tế bào thục vật các nguyên liệu thực phẩm có nguờn gớc thực vật nếu được gia cơng bằng chế phẩm celluloza sẽ được mềm ra, sẽ ăng hệ sớ đờng hóa và nói chung chất lượng được tăng lên O đó rất bổ ích khi chuẩn bị các thức ăn đặc hiệu cho trẻ con, cho người ăn kie6g cũng như khi chế biến thức ăn gia súc

 Tăng hiệu suất trích ly các chất khác nhau từ nguyê liệu thực vật

Protein, acid amin, vitamin từ đậu tương, thạch từ rong, tinh bợt từ bã, chất thơm và chất hòa tan khi sản xuất chè xanh và cà phê hòa tan

Chẳng hạn trong sản xuất bia dưới ảnh hưởng của phức hệ enzym xitaza (chủ yếu gờm 4 ezym cellulaza, hemicellulaza, ezym thủy phân chất gơm và ezymcellobiaza,…) thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy khiến cho các ezym proteaza và amilaza tác dụng dễ dàng với protein và tinh bợt chứa trong hạt đại mạch Khi đó, lượng đường, dextrin và các chất hòa tan khác tăng lên, tạo điều kiện để để khi gia sau này hình thành nên các phẩm vật có màu và có mùi thơm đặc trưng của malt và bia

Rong biển nếu được gia công từ chế phẩm cellulaza thì hiệu suất thạch sẽ được tăng lên Người ta cũng thấy, do ảnh hưởng của ezym hemicellulaza mà các chất mật, gôm,… vốn không bị tác dụng của pectinaza cũng bị phân hủy một cách mạnh mẽ, nên kết quả là ngăn cản được sự gelatin hóa khi chế biến các loại cà phê cô đặc

 Thủy phân gỗ và phế liệu gỗ

Các phế liệu này rẻ tiền và có thể dùng chế phẩm cellulaza để thủy phân thành các đường đơn giản có thể chế biến làm thức ăn gia súc ezym cellulaza phổ biến rộng rãi trong các nấm hiển vi và vi khuẩn

Trong đa số trường hợp, người ta thu chế phẩm cellulaza từ canh trường bề mặt của nấm mốc A oryzae và A awamori

Nấm mốc A.oryzae

Được ứng dụng trong chất tẩy rửa, chủ yếu đễ làm mềm vải

Thu nhận 2 phức hệ enzym pectinaza va cenlulaza:

I/Thu nhận pectinase:

1.Nguồn thu nhận:

Vi sinh vật tổng hợp pectinase:

Nguồn giàu enzym pectinase là nấm mốc nấm men và vi khuẩn

Nấm mốc:penicillium glaucum, P ehrlichii, P chrysogenum, P.expanam, P cilrimim, Aspergillus awamori, A foetidus, A niger, A terrus, A saitoi, Fusarium moniliforme,… Nấm men: Saccharomyces fragilis

Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pentinovorum, Klebsiella aerogenes,… Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật khi quả bị hư hỏng hoặc thực vật chết chúng sẽ cùng các loài VSV khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ phận khác của thực vật

Bên cạnh Pectinesterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzym PE như: cà chua, đậu nành, thịt quả chuối, quả cam, táo…

Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh Ví dụ như: Saccharomyces fragilis, aspergillus niger,…PG còn được tìm thấy ở cà chua

2.Thu nhận:

Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV Có hai phương pháp sản xuất: A/ Thu nhận từ canh trường bề mặt:

môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV thường là cám gạo, cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm nguồn dinh dưỡng bổ sung thường lá các muối ammonium, phosphoric…độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60 độ C nấm mốc A awamori thường được nuôi cấy ở 30 độ C trong thời gian 40 giờ, sau đó giảm xuống 24 độ C và nuô trong 48-52 giờ Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thàng chế phẩm enzym thô và đem tinh chế

Để thu pectinase tinh khiết thì enzym thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ (etanol 72,5-75% hoặc iso-propanol 55-57%) hay muối amoni sunfat có độ bão hòa 0,79% Nếu dùng etanol đô tinh khiết của chế phẩm enzym khoảng 90%, nế dùng muối thì khoảng 75% Nhiệt độ tối ưu của rượu là 2-5 độ C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ít càng tốt sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa ri62i nghiề nhỏ và đem đi bảo quản B/Thu nhận từ canh trường bề sâu:

a/phương pháp hiếu khí

sự tích tụ enzym trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng ohospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn pH thích hợp từ 6-7,2, pH kiềm kìm hãm, pH = 4 ức chế hoàn toàn

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10% Trong quá trình nuôi cấy hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6 xuống còn 1,5-1,8% Để thu chế phẩm khô cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rối sấy khô trên thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 độ C và đi ra đạt 60-70 độ C thời gian lưu của chế phẩm enzym trong thiết bị sấy phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40 độ C chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm

Có thể thu bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với etanol theo tỷ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1, hoặc với muối

ammoniumsulfate(50-80%) Nếu kết tủa bằng etanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu nếu kết tủa bằng muối ammonium silfate, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phương pháp thẩm tích, sau đó sấy khô

b/Phương pháp yếm khí:

Môi trường :bã củ cải 2%, (NH4)2HPO4 0,75%

KH2PO4: 0,1%; CaCO3 0,3%; nước chiết ngô: 0,5%

Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối.sự tích lũy ezym tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 5-60h pH ban dầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0 vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35 độ C

cl.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu được pectinase thành phần môi trường có: lactose 2%, pectin củ cải 1%, (NH4)HPO4 0,4%,K2HPO4 0,7%, KH2PO4 0,3%, NaCl 0,1%, MgSO4 0,025%, FeSO4dạng vết, CaCO4 0,5%, dịch nấm men tự phân, 0,05%, ascorbis acid 0,5%

Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muố amomium sulfat Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, Ph của dung dịch đã xử lý là 6,5- 6,8 nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzim trong kết tủa đạt 93-95 % so với hoạt đọ ban đầu

Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thường theo các bước cơ bản sau;

-khử muối bằng phương pháp lọc gel

-tách protein bằng phương pháp trao đổi ion

_tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang

_Tinh sạch bằng FPLC

II/THU NHẬN CELLULASE TỪ VSV