BÁO CÁO VỀ VIRUS FED Ở HEO

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU2.1 Sơ lược tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh PED trên heo2.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Nghiên cứu về sinh bệnh học PED, Ducatelle et al., 1982 g

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, tình hình dịch bệnh trên heo trở nên phức tạp và nguyhiểm hơn nhiều so với những năm trước đây Các chương trình tiêm phòng bệnh và cácbiện pháp hỗ trợ, trộn kháng sinh vào trong thức ăn… được áp dụng nhưng bệnh vẫn xảy

ra liên tục và gây thiệt hại to lớn cho người chăn nuôi heo Trong đó, bệnh tiêu chảy trênheo con theo mẹ gây tổn thất rất lớn Tỷ lệ heo con tiêu chảy ở các hộ chăn nuôi khoảng30-60% (Trần Thị Dân, 2008)

Bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ và sau cai sữa có thể do nhiều nguyên nhân,

nhưng hầu hết các nghiên cứu thường tập trung trên E coli và Salmonella Gần đây một

số quốc gia công bố bệnh tiêu chảy cấp do virus Porcine Epidemic Diarrhea (PED) gây rarất phổ biến Bệnh tiêu chảy cấp trên heo (PED) là bệnh truyền nhiễm, lây lan rất nhanh,

thiệt hại lớn với đặc điểm gây ói mửa và tiêu chảy trên heo ở mọi lứa tuổi (Pospischil et al., 2002) Ở heo con dưới 1 tuần tuổi thể hiện triệu chứng tiêu chảy rất nặng, heo chết

nhanh và rất khó hồi phục với tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (Pensaert andYeo, 2006)

Ngày 17/5/2013, virus PED đã được xác nhận lần đầu tiên ở Mỹ, dịch bệnh đã lâylan nhanh chóng trên 200 trại nuôi heo trên khắp nước Mỹ, hơn 17 bang có dịch bệnh

trong vòng 3 tháng, với tỷ lệ chết trên heo con từ 50 – 100% (Huang et al., 2013; Stevenson et al., 2013).

Ở Châu Á từ những năm 1990, bệnh do virus PED bắt đầu nổi lên như một tácnhân dịch bệnh quan trọng, đặc biệt là ở Hàn Quốc và Nhật Bản, với tỷ lệ chết lên đến

50-95% ở heo con nhỏ hơn 2-3 tuần tuổi (Chae et al., 2000; Sueyoshi et al., 1995;

Pensaert and Yeo, 2006)

Tại Việt Nam, bệnh PED cũng đã xảy ra từ năm 2008-2010 ở một số tỉnh phía

Nam (Nguyễn Tất Toàn et al., 2012) gây nhiều thiệt hại Bệnh gây thiệt hại nặng nề trên

đàn heo của các tỉnh miền Đông Nam bộ với tỷ lệ bệnh ở các lứa tuổi có thể đến 100%, tỷ

lệ chết khác nhau giữa các lứa tuổi, đặc biệt cao ở heo con theo mẹ từ 50 – 100% Cácdấu hiệu tương tự như bệnh PED đã có xuất hiện trên heo ở một số tỉnh Đồng bằng sôngCửu Long nhưng hiện chưa có thông tin chính xác nào được công bố Để xác định sự

hiện diện của bệnh tại thành phố Cần Thơ, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm bệnh tiêu chảy cấp (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) trên heo con theo mẹ tại thành phố Cần Thơ”

Mục tiêu của đề tài

- Xác định tỷ lệ nhiễm bệnh PED trên đàn heo con theo mẹ trên địa bàn thành phố

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU2.1 Sơ lược tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh PED trên heo

2.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu về sinh bệnh học PED, Ducatelle et al., (1982) gây nhiễm trên heo con

2-3 ngày tuổi không được bú sữa đầu, bằng virus PED chủng CV777 qua đường uống.Sau 22-36 giờ gây nhiễm heo có biểu hiện tiêu chảy và có thể chết trong vòng 12 – 120giờ Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung ruột nhiễm virus bị phá hủy quan sát rõnhất sau 24-36 giờ gây nhiễm, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá hủy tế bào biểu

mô ở kết tràng Vị trí và sự nhân lên của virus được xác định thông qua kỹ thuật miễndịch huỳnh quang và kính hiển vi điện tử Virus PED nhân lên trong bào tương của các tếbào lông nhung ruột, phá hủy các tế bào biểu mô và làm ngắn lông nhung Tác giả cũngcho rằng, đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của heo con rất giống với TGEV.Nhưng so với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của PEDV diễn ra chậm hơn

và thời gian nung bệnh lâu hơn

Hofmann et al., (1988) và Kusanagi et al., (1992) tiến hành nuôi cấy virus PED

trên môi trường tế bào Vero, nhận thấy virus chỉ phát triển được khi môi trường này cóchứa trypsin

Carvajal et al., (1995) sử dụng phản ứng ELISA ức chế kháng thể đơn dòng và

phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFT) để phát hiện kháng thể kháng PEDVtrong huyết thanh heo con được gây nhiễm thực nghiệm với chủng CV777 và heo conphát bệnh PED tự nhiên Kết quả cho thấy, hai phương pháp này đều phát hiện được sự

có mặt của kháng thể kháng PEDV ở ngày thứ 7 và từ ngày 10 đến ngày 13 sau khi gâynhiễm Phương pháp ELISA ức chế phát hiện đáp ứng kháng thể sớm hơn phương phápmiễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Khảo sát trên ổ dịch tiêu chảy cấp-PED xảy ra trên đàn heo con ở Nhật Bản,

Sueyoshie et al (1995) nhận thấy biểu hiện đặc trưng của bệnh là tiêu chảy lỏng, mất

nước và tử vong cao trên heo sơ sinh Sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để quan sátbệnh tích vi thể cho thấy, lông nhung ruột non bị teo lại, hình thành các không bào trong

tế bào lông nhung ruột non Tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung với tuyến ruột giảm rõ, biếnđộng từ 1:1 tới 3:1 Với kỹ thuật Streptavidin-biotin (SAB), phát hiện số lượng lớnCoronavirus có trong tế bào chất của tế bào ruột và trong vi lông nhung của ruột non.Những tế bào nhiễm chủ yếu ở tế bào biểu mô nhung mao của không tràng và hồi tràng,

virus hiện diện ít hơn ở ruột già và các biểu mô tuyến ruột Tác giả cũng cho rằng, kỹthuật SAB là hữu ích trong việc chẩn đoán bệnh PED.

Sức đề kháng tự nhiên của heo đối với virus PED được Shibata et al (2000) khảo

sát trên heo ở 5 độ tuổi: 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần tuổi, tất cả được gâynhiễm với virus PED qua đường uống Virus PED đã được phân lập từ ruột non củanhững heo con bị nhiễm bệnh và được nuôi cấy trên môi trường tế bào Vero, tế bào bàngquang và tế bào thận của heo Kết quả cho thấy sức đề kháng tăng dần theo tuổi và heochỉ bị chết khi trong giai đoạn 2-7 ngày tuổi Năm 2001, Shibata nghiên cứu khả năngmiễn dịch của sữa đầu Sử dụng sữa đầu của bò cái đã được tiêm chủng và không tiêmchủng trên heo con 2-3 ngày tuổi, gây nhiễm với virus PED chủng Z94P5 Cho thấynhững heo con được uống sữa đầu có miễn dịch có tỷ lệ sống sót cao thậm chí 100% ởhiệu giá kháng thể 1:512, ngược lại là 0% đối với những heo con được uống sữa đầukhông có miễn dịch Mổ khám bệnh tích cũng cho thấy kết quả bệnh trầm trọng hơn ởnhững heo con uống sữa đầu không có miễn dịch: teo lông nhung ruột, virus PED hiệndiện ở không tràng và hồi tràng sau 24 giờ gây nhiễm Kết quả cho thấy sữa đầu có miễndịch bảo vệ heo con chống lại virus PED lúc mới sinh

Kim et al., (2002) đã so sánh ba kỹ thuật (phản ứng RT-PCR, hóa mô miễn dịch

và lai tại chỗ) để xác định virus PED Tác giả kết luận rằng RT-PCR xác định sự có mặtcủa virus PED chính xác hơn các phương pháp khác

Jung et al., (2006) nghiên cứu tác động của virus PED lên các enyme tiêu hóa ở

ruột non trên heo Các heo con được gây nhiễm virus PED và được mổ khám tại các thờiđiểm 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau khi gây nhiễm Kết quả cho thấy sự nhân lên của virusPED làm hủy hoại nặng tế bào lông nhung ruột non dẫn đến làm giảm đáng kể bề mặtbiểu mô ruột và khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hóa Lông nhung ruột bị teo nhỏ

và hoạt động của các enzyme tiêu hóa cũng yếu đi là nguyên nhân tiêu chảy do rối loạntiêu hóa và rối loạn hấp thu dinh dưỡng trong sữa

Martelli et al., (2008) nghiên cứu khảo sát dịch tiêu chảy xảy ra trên tất cả các

hạng heo từ tháng 5/2015 đến 6/2006 ở Ý Bằng kỹ thuật kính hiển vi điện tử, kính hiển

vi miễn dịch huỳnh quang, PCR và huyết thanh học, đã xác định nguyên nhân gây ra dịchtiêu chảy này là PEDV Ở chuồng nuôi heo nái sinh sản, heo nái và heo con theo mẹ cóbiểu hiện tiêu chảy, với tỷ lệ chết ở heo con sơ sinh từ 34% trở lên Ở heo sau cai sữa vàheo choai, tỷ lệ mắc bệnh trung bình từ 20-80%, nhưng tỷ lệ chết không có hoặc có thì tỷ

lệ này rất thấp Tác giả cũng cho rằng, tùy vào quy mô đàn và mô hình chăn nuôi màbệnh có thể kéo dài vài tuần hoặc vài tháng

Puranaveja et al., (2009) nghiên cứu khảo sát trên các ổ dịch PED xảy ra trên heo

ở 8 tỉnh (24 trại) tại Thái Lan trong khoảng thời gian từ tháng 12/2007-3/2008 cho thấy tỷ

lệ chết trên heo sơ sinh rất cao 100% ở các ổ dịch xảy ra lần đầu tiên Với 33 chủng virusphân lập được có gene M và gene S tương đồng đến 99,7% và 98,6% với chủng TrungQuốc, JS-2004-2

Tháng 10/2010, dịch tiêu chảy cấp-PED đã xảy ra miền Nam Trung Quốc, đặctrưng bệnh là tỷ lệ chết cao ở heo sơ sinh Dịch bệnh lây lan trên 10 tỉnh và hơn1.000.000 con heo con bị chết Đáng chú ý là trong ổ dịch tiêu chảy này, tất cả các heocon dưới 1 tuần tuổi đều bị mắc bệnh 100% và tỷ lệ chết từ 80 – 100% Mổ khám chothấy bệnh tích điển hình là dạ dày căng phồng, chứa sữa bị vón cục, ruột có xuất huyếtnhẹ, thành ruột mỏng do niêm mạc ruột bị teo, thấy được chất dịch chứa bên trong ruột

màu vàng có bọt (Sun et al., 2012).

Ngày 29/4/2013, lần đầu tiên dịch tiêu chảy và nôn mửa xảy ra trên heo mọi lứatuổi đã bùng phát tại 4 trang trại heo giống ở bang Iowa, Mỹ Với tỷ lệ chết cao từ 90-95% trên heo con sơ sinh Trên heo nái, 10-15% là biểu hiện biếng ăn và nôn mửa

Stevenson et al., (2013) đã xác định nguyên nhân gây bệnh dịch này là virus PED bằng

phương pháp RT-PCR Heo con bị PED phân rất lỏng, màu vàng và dính phủ lên mìnhheo con Heo con chết do bệnh thể hiện sự mất nước rất rõ: xác gầy, mắt trũng sâu, dakhông đàn hồi và dính sát vào mô dưới da Mổ khám bệnh tích cho thấy dạ dày căngphồng, chứa sữa bị vón cục, ruột non và ruột già chứa chất lỏng lợn cợn như sữa khôngtiêu hóa có màu từ trắng đến vàng, thành ruột mỏng, trong suốt Quan sát bệnh tích vi thểthấy các tế bào biểu mô hợp bào, chứa rất nhiều nhân; các lông nhung ruột bị hủy hoạinghiêm trọng, các đỉnh lông nhung bị bào mòn, tỷ lệ chiều cao lông nhung và tuyến ruột

là 1:1 rất rõ Phân tích và giải trình tự gen những chủng PEDV trong ổ dịch này cho thấy

có sự tương đồng cao (99%) với chủng PEDV được phân lập từ các ổ dịch của TrungQuốc năm 2012

Nghiên cứu những chủng virus PED phân lập ở những ổ dịch bệnh ở bang

Minnesota và Iowa, Mỹ, Huang et al., (2013) cho thấy có 3 chủng tương đồng với các

chủng tỉnh An Huy của Trung Quốc Tác giả cũng cho rằng virus có nguồn gốc tiến hóa

từ Coronavirus ở dơi

Năm 2013, xác định khả năng khuếch tán của virus PED trong không khí, có 11mẫu dương tính trong tổng số 64 mẫu không khí được thu thập từ 8 trại heo và 1 trại thựcnghiệm của bang Oklahoma-Mỹ PEDV được phát hiện ở khoảng cách lên đến 16km (10dặm) Các mẫu không khí nhiễm PED được gây nhiễm trên heo 7-8 tuần, kết quả chothấy các heo gây nhiễm đã có biểu hiện lâm sàng của bệnh PED và virus PED đã được

phát hiện có trong phân và các mô Virus PED được tìm thấy trong không khí, các hạt lơlửng trong không khí có thể truyền nhiễm và virus PED có thể được vận chuyển qua một

khoảng cách dài (Goede et al., 2013)

Jung et al., (2014) tiến hành nghiên cứu về các yếu tố liên quan sự nhiễm dai dẳng

virus PED và bùng phát lại dịch bệnh ở Trung Quốc Các mẫu phân, tinh dịch và mẫukhông khí được thu thập từ 3 trại heo đã trải qua dịch bệnh PED, virus PED được pháthiện bằng phương pháp RT-PCR và định lượng virus bằng phương pháp real-time RT-PCR Kết quả cho thấy, tất cả các loại mẫu trên đều phát hiện sự hiện diện virus PED.Virus được bài thải qua phân với nồng độ 1x106,85 copies/ml trở lên và thời gian bài thảivirus qua phân kéo dài ít nhất 56 ngày Những mẫu tinh dịch trên heo đực giống và mẫukhông khí cũng cho kết quả dương tính với RNA của virus PED

Theo Bernasconi et al., (1995) nghiên cứu cho thấy virus dòng CV777 đã thích

ứng trên môi trường tế bào có trình tự gen khác biệt rõ rệt so với chủng CV777 phân lập

từ thực địa, sự khác biệt này liên quan tới việc suy giảm mạnh độc lực của virus cũng nhưviệc giảm nhẹ mức độ thay đổi mô bệnh học ở heo mắc bệnh Tuy nhiên ở Châu Âu,bệnh gây bởi virus PED không quan trọng về mặt kinh tế đủ để người ta tiến hành sảnxuất vaccine Chính vì vậy, thử nghiệm hoàn thiện vaccine chủ yếu được tiến hành ở cácnước Châu Á, nơi PED bùng phát trầm trọng với tỷ lệ tử vong gia tăng ở heo con sơ sinh.Một vaccine khác dùng cho heo con bú mẹ có thể chế từ virus suy giảm độc lực thu đượcqua việc cấy chuyển nhiều đời (93 đời cấy chuyển) của virus PED trên môi trường nuôi

cấy tế bào Vero (Kweon et al., 1999) Ở Nhật Bản, một loại vaccine nhược độc thương

mại sản xuất từ chủng virus PED (P-5V) thích ứng trên tế bào nuôi cấy đã được sử dụngphòng bệnh cho heo nái từ năm 1997 Mặc dù những vaccine này được xem là khá hiệuquả, tuy nhiên không phải tất cả heo nái sử dụng vaccine đều tạo được miễn dịch qua sữa

ổn định (Usami et al., 1998; Pensaert and Yeo, 2006).

De Arribe et al., (2002) đã sử dụng kỹ thuật điểm hấp phụ miễn dịch liên kết

enzyme (ELISPORT) để biệt hóa những tế bào tiết kháng thể (Antibody Secreting Cell)đặc hiệu ở niêm mạc và mô lympho của heo được chủng PEDV Sau khi lây nhiễmPEDV, kết quả cho thấy khả năng sản xuất của tế bào tiết kháng thể (ASC) trong ruộttương tự như khi gây nhiễm TGEV và Rotavirus; trong đó các IgG được các ASC tiết vàlưu hành nhiều hơn Ở heo nhiễm virus PED, có thể xác định được một lượng nhỏ IgM

do ASC tiết ra sau 4 ngày gây nhiễm và tế bào B nhớ xuất hiện lúc 21 ngày sau gâynhiễm trong hạch lympho, lách và máu Cuối cùng, trong thời gian thử nghiệm của heo,các tác giả khẳng định tồn tại mối tương quan giữa khả năng bảo hộ với kháng thể đặchiệu trong huyết thanh và đáp ứng của ASC trong các mô lympho đường ruột và máu

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo Nguyễn Tất Toàn et al., (2012) nghiên cứu sử dụng phương pháp nested

RT-PCR để chẩn đoán phân biệt virus gây viêm dạ dày – ruột truyền nhiễm (TGEV) và virusdịch tiêu chảy cấp trên heo (PEDV) trong các ổ dịch năm 2008-2010 tại các tỉnh miềnĐông Nam bộ Với 284 mẫu ruột và phân thu được từ heo con có biểu hiện bệnh đặctrưng của dịch tiêu chảy, qua chẩn đoán bằng kỹ thuật nested RT-PCR cho kết quả41,90% số mẫu dương tính với PEDV, không phát hiện mẫu dương tính với TGEV Kếtquả chẩn đoán còn cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với PEDV ở ruột (58,14%) cao hơnmẫu phân (16,96%)

Nghiên cứu về một số yếu tố liên quan và đặc điểm bệnh học của bệnh PED tạimột số tỉnh phía Nam của Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy (2012), qua khảo sát 110trại đang xảy ra bệnh tiêu chảy cấp đặc trưng trên heo ở mọi lứa tuổi Kết quả là tỷ lệbệnh và tỷ lệ chết xuất hiện trên heo con theo mẹ là rất cao (tương ứng 93,94% và81,67%) Hai tỷ lệ này giảm dần theo lứa tuổi Các yếu tố liên quan đến việc lan truyềndịch bệnh gồm có khoảng cách đến với trại heo bị bệnh, vệ sinh sát trùng, quy mô chănnuôi và nguồn nước sử dụng Triệu chứng lâm sàng của bệnh PED: 100% tiêu chảy phânlỏng, 90,33% ói mửa Bệnh tích thường gặp: 94,42% có biểu hiện dạ dày căng phồng,chứa nhiều thức ăn không tiêu và 86,33% là thành ruột mỏng, phồng to, chứa nhiều nước

và dịch chất bên trong Cũng trong năm này, hai tác giả tiến hành nghiên cứu xác địnhđặc trưng kiểu gen của virus gây bệnh và sự tương đồng với chủng trên thế giới để dựđoán nguồn gốc virus và định hướng cho công tác phòng chống bệnh Nghiên cứu thựchiện trên 16 chủng virus PED thu thập từ các ổ dịch tiêu chảy cấp trên heo được khuyếchđại bằng kỹ thuật nested RT-PCR và giải trình tự theo phương pháp điện di mao quản.Kết quả cho thấy, các chủng PEDV ở Việt Nam có sự tương đồng gen rất cao với cácchủng phân lập từ các nước láng giềng như Trung Quốc (JS-2004-2) và Thái Lan(07np01, Ku01cb08) với sự khác biệt rất nhỏ, lần lượt là 0,56 – 2,86%, 0,00 – 1,71% Từ

đó có thể thấy rõ nguy cơ lây lan dịch bệnh do vận chuyển, mua bán động vật và sảnphẩm động vật chưa qua kiểm dịch Ngoài ra, sự di chuyển của con người cũng góp phầnquan trọng trong lây lan dịch bệnh giữa vùng này sang vùng khác, quốc gia này qua quốcgia khác Các chủng virus PED ở Việt Nam bắt đầu hình thành sự đa dạng (đột biếnđiểm) ở các địa phương khác nhau: Bình Dương, Đồng Nai và thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch trênheo ở một số tỉnh phía Bắc (như Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Giang, Bắc Ninh và Hà

Nội), Nguyễn Văn Điệp et al., (2013), khảo sát ở 31 trại heo có biểu hiện tiêu chảy ở mọi

lứa tuổi, điều trị bằng kháng sinh không hiệu quả, tỷ lệ chết tập trung ở heo con theo mẹ

Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán virus PED, TGE và Rota Kết quả nghiêncứu cho thấy có tới 83,9% dương tính với virus PED Tỷ lệ bệnh PED cao nhất ở heo contheo mẹ (96%), heo con sau cai sữa (86,2%) và thấp nhất ở heo đực giống Tỷ lệ chết caonhất ở heo con theo mẹ (68,6%) Về bệnh lý: phân có màu vàng, vàng xanh, hoặc phânmàu xám, xám đen Bệnh tích đại thể chủ yếu quan sát thấy ở dạ dày (19,4%), ruột non(61,3%), ruột già (32,2%), hạch bạch huyết (38,7%) và ở một số cơ quan nội tạng khác.Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể cũng thể hiện sự thay đổi ở các cơ quan nội tạng trên.

Năm 2014, Nguyễn Thị Lan et al., nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn

đoán bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra cho heo con theo mẹ tại huyện Văn Lâm, tỉnhHưng Yên Nghiên cứu này đã được tiến hành trên đàn heo con theo mẹ dưới 10 ngàytuổi Những heo con bị mắc PED thường có biểu hiện chán ăn, bỏ ăn, tiêu chảy, phânnhiều nước, màu vàng, có sữa không tiêu, ruột non căng phồng, thành ruột bị bào mỏng,chứa dịch màu vàng, hạch màng treo ruột sưng to Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật RT-PCR đã cho thấy tất cả những con heo có các biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tíchnhư trên đều mắc PED Mẫu bệnh phẩm được lấy từ phân, ruột và hạch ruột có thể dùng

để chẩn đoán PED bằng kỹ thuật RT-PCR cho kết quả tốt

2.2 Đặc điểm của bệnh PED trên heo

2.2.1 Lịch sử

Theo Oldham (1972), một bệnh mới gây tiêu chảy cấp trên heo trong giai đoạntăng trưởng và vỗ béo vào năm 1971, dịch bệnh bùng phát rải rác suốt mùa đông ở Anh,làm tổn thất đến nhiều trang trại chăn nuôi heo Các biểu hiện lâm sàng ở heo bệnh giốnghệt như bị nhiễm virus gây viêm dạ dày-ruột truyền nhiễm (TGEV), ngoại trừ một khácbiệt quan trọng, đó là heo con đang bú mẹ không mắc bệnh TGEV và các tác nhân gâybệnh đường tiêu hóa khác đã được xác định không phải là nguyên nhân gây ra bệnh trên.Bệnh sau đó đã lan sang các nước Châu Âu và được gọi là bệnh “tiêu chảy thành dịch dovirus” (Epidemic viral diarrhea-EVD) Năm 1976, bệnh tiêu chảy cấp tính giống với bệnhTGE lại xuất hiện, nhưng xảy ra trên heo ở tất cả các lứa tuổi, bao gồm cả heo con đangtrong giai đoạn bú sữa mẹ (Wood, 1977), tuy nhiên khả năng TGEV và các tác nhân gâybệnh đường tiêu hóa đã biết là nguyên nhân gây bệnh đã được loại trừ Lúc này, tên EVDloại 2 được đưa ra để phân biệt bệnh gây tiêu chảy ở thời điểm này với EVD loại 1 làbệnh bùng phát năm 1971, sự khác nhau nằm ở chỗ heo con đang bú mẹ mắc bệnh EVDloại 2 mà không mắc EVD loại 1

Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt bùngphát EVD loại 2 (Chasey and Cartwright, 1978; Pensaert and DeBouck, 1978) Kết quả

gây bệnh thực nghiệm cho heo bằng một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấybệnh tích đường tiêu hóa biểu hiện điển hình trên cả heo con và heo vỗ béo (DeBouckand Pensaert, 1980) Loại Coronavirus đã được chứng minh chịu trách nhiệm cho sựbùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ đó tên bệnh đã được đổi thành “tiêu chảy thành dịch

trên heo” viết tắt theo tên tiếng Anh là PED (Pensaert et al., 1982).

2.2.2 Tác nhân gây bệnh

Phân loại

Virus gây bệnh PED (Porcine epidemic diarrhea virus – PEDV) thuộc chi

Alphacoronavirus, họ Coronaviridae, trong bộ Nidovirales (Ủy ban quốc tế về phân loại

virus – ICTV, 2011), cùng với TGEV, coronavirus ở mèo, chó và coronavirus 229E ởngười Phân loại về huyết thanh học, người ta xác định virus PED hiện mới chỉ có 1serotype Các chủng PEDV phân lập từ Châu Âu, Hàn Quốc và Trung Quốc đều tươngđồng về mặt huyết thanh với chủng CV777 phân lập từ thực địa của Bỉ năm 1978(Pensaert and Yeo, 2006; Song and Park, 2012)

Cấu trúc virus

PEDV là virus có vỏ bao bọc, đường kính biến đổi từ 90 đến 190 nm Virus cómột nhân đậm đặc điện tử với quầng sáng ở giữa và những phần tỏa ra từ nhân dạng chùydài xấp xỉ 20nm Virus nhân lên thông qua việc nẩy chồi từ các màng bên trong bàotương tế bào vật chủ Hình thái của PEDV trong tế bào biểu mô đường tiêu hóa tương tự

như các coronavirus khác (Kweon et al., 1993; Pospischil et al., 2002) Bộ gen của virus

PED là sợi RNA đơn dương kích thước khoảng 28kb với mũ 5’ và đuôi là polyA 3’ Bộgen của virus gồm một vùng không dịch mã đầu (UTR) 5’, một UTR đầu 3’, ít nhất 7khung đọc mở (ORF) mã hóa cho 4 protein cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), vànucleocapsid (N) và 3 protein không cấu trúc (enzyme tái bản replicase 1a, 1b và ORF3).Những khung đọc mở này được sắp xếp theo trình tự: 5’-replicase (1a, 1b)-S-ORF3-E-M-N-3’(Hình 2.1) Protein cấu trúc của PEDV tương tự như các coronavirus khác Virus cómột protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein màng (M)27-32 kDa, một protein nucleocapsid gắn với RNA nặng 57-58 kDa

Sức đề kháng

Virus mẫn cảm với ether, chloroform PEDV bền ở khoảng pH 5,0 – 9,0 ở 4°C và

pH từ 6,5 – 7,5 ở 37°C Với các sóng siêu âm, các độ đông lạnh thì virus không bị pháhủy hoặc mất khả năng cảm nhiễm Sự nhân lên của virus bị ức chế bởi 5-iodo-2’-deoxyuridine (Hofmann và Wyler, 1989; Pensaert and Yeo, 2006)

Virus PED mất khả năng cảm nhiễm lên các tế bào nuôi cấy ở nhiệt độ ≥ 60°Ctrong 30 phút, nhưng chúng khá bền ở 50°C (Lee and Yeo, 2003) PEDV bị bất hoạt bởihầu hết các chất sát trùng như: cresol, NaOH 2%, formalin 1%, natri carbonat (4% nước,10% tinh thể, 0,1% chất tẩy rửa), các chất tẩy rửa ion hóa và không ion hóa, iodophor 1%

trong acid phosphoric (Pospischil et al., 2002).

Đặc tính nuôi cấy

Khả năng thích ứng của virus PED với tế bào ruột non trong điều kiện của phòngthí nghiệm rất kém Các thí nghiệm nuôi cấy các chủng virus trên các mô ruột non và khíquản đều không thành công Với các tế bào không được xử lý với trypsin hoặc dịch tụy

thì không thích hợp để virus nhân lên (Callebaut and DeBouck, 1981; Witte et al., 1981).

Sự sinh trưởng của virus phụ thuộc vào sự có mặt của men trypsin trong môi trường nuôicấy Trong môi trường nuôi cấy, virus tác động lên tế bào hình thành các không bào vàthể hợp bào (có thể lên tới 100 nhân) Về khả năng sinh trưởng, hiệu giá nuôi cấy virusđạt cao nhất 105.5 vết tan (plaque forming unit) sau 15 giờ gây nhiễm tế bào (Hofmannand Wyler, 1988, 1989; Lee and Yeo, 2003) Hiện tại, virus PED đã được nhân lên thành

công trên các tế bào thận heo và bàng quang heo ở Nhật Bản (Shibata et al., 2000).

Chủng PEDV phân lập tại Nhật Bản (P-5V) đã được sử dụng làm chủng virus vaccine và

được nuôi cấy trên các dòng tế bào heo KSEK6 và IB-RS2 (Kadoi et al., 2002).

2.2.3 Dịch tễ học

Heo mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh PED Bệnh thể hiện rõ trên heo con theo mẹ

và heo đang tăng trưởng khi virus gây bệnh PED xâm nhập lần đầu, với tỷ lệ bệnh và tỷ

lệ chết rất cao Bệnh PED xảy ra quanh năm nhưng chủ yếu vào các tháng lạnh hay lúc

(Gai S) (Màng vỏ E) (Màng M) (Kháng nguyên bề mặt) (Nucleocapsid N)

(Vật liệu di truyền RNA)

Hình 2.1 Mô phỏng cấu trúc của virus PED

(Hesse et al., 2014)

giao mùa Từ những kết quả nghiên cứu thu được, một số ý kiến cho rằng tình trạng PED

ở Châu Á tiến triển trong thời gian gần đây phản ánh bệnh mang tính địa phương rõ hơnkhi lưu hành trong một quần thể nái đã phần nào có miễn dịch Mức độ lây lan của bệnhPED chậm hơn mức độ lây lan của bệnh viêm dạ dày-ruột truyền nhiễm (TGE) (Pensaertand Yeo, 2006)

Về phương thức truyền lây, đường phân - miệng có thể là phương thức chủ yếu đểvirus truyền sang vật chủ khác PED thể cấp tính thường xảy ra ở thời điểm 4-5 ngày saukhi heo được bán hoặc mua về Virus có thể xâm nhập vào trại thông qua heo nhiễm virusđược chuyển về hoặc các dụng cụ có mang virus như xe tải, ủng… PEDV không khácnhiều với TGEV về đường truyền lây, nhưng virus này có vẻ tồn tại lâu hơn trong cáctrang trại sau khi dịch PED cấp tính đã qua đi Khi dịch xảy ra ở trại heo sinh sản, virus

có thể được bài thải từ đàn mắc bệnh hoặc trở thành dịch địa phương Một chu kỳ dịchđịa phương có thể được hình thành nếu số lứa heo được sinh ra và cai sữa trong trại đủlớn để duy trì sự lưu hành của virus thông qua việc lây nhiễm giữa các lứa kế tiếp nhaukhi heo con mất khả năng miễn dịch lúc cai sữa PEDV có thể gây ra tiêu chảy dai dẳngtrên heo con sau cai sữa ở những trại như vậy (Pensaert and Yeo, 2006)

Khả năng lây sang người

Cho tới nay, chưa có công bố nào về sự lây truyền của virus PED sang người vàcác loài khác

2.2.4 Miễn dịch

Cho tới khi được 4-13 ngày tuổi, heo con sinh ra từ heo mẹ đã có miễn dịch sẽđược bảo vệ khỏi PEDV nhờ kháng thể IgG truyền qua sữa đầu; độ dài miễn dịch phụthuộc vào hiệu giá kháng thể của heo mẹ Sau khi heo mẹ cảm nhiễm với kháng nguyêntrong ruột, các tế bào sinh miễn dịch IgA di chuyển tới tuyến vú để cố định và tiết khángthể IgA vào sữa đầu Do dó, khi chế tạo vaccine, cần lưu ý trục miễn dịch “ruột-tuyến vú”

để tạo ra miễn dịch qua sữa hiệu quả Heo con thường xuyên bú sữa từ heo mẹ đã cómiễn dịch sẽ được bổ sung liên tục vào đường tiêu hóa của nó một lượng kháng thể IgA,đây là quá trình tiếp nhận miễn dịch thụ động Lượng IgG chiếm hơn 60% lượngImmunoglobulin trong sữa đầu Tuy nhiên, IgA hiệu quả hơn trong việc trung hòa mầmbệnh lây nhiễm qua đường miệng hơn là IgG hay IgM bởi nó bền vững hơn trước sự phânhủy protein trong đường ruột và có khả năng trung hòa virus cao hơn IgG và IgM Vì thếviệc truyền IgA thụ động từ những con mẹ có miễn dịch sẽ gây ra khả năng miễn dịch tốt

ở heo con trong giai đoạn bú mẹ Tuy nhiên, những kháng thể này không thể bảo vệchúng khỏi lây nhiễm PEDV qua đường tiêu hóa ( Song and Park, 2012)

2.2.5 Sinh bệnh học

Sinh bệnh học của PED được nghiên cứu trên heo con không được bú sữa đầu.Cho heo con 3 ngày tuổi uống virus PED chủng CV777, sau khoảng 22 đến 36 giờ heobắt đầu ói mửa và tiêu chảy Vị trí và sự nhân lên của virus được xác định thông qua kỹthuật miễn dịch huỳnh quang (IF) và kính hiển vi điện tử truyền PEDV nhân lên trongbào tương của các tế bào lông nhung, bắt đầu với sự bám của protein S của virus lên thụthể aminopeptidase N trên bề mặt lông nhung ruột đẫn đến sự phá hủy các tế bào biểu mô

và làm ngắn lông nhung niêm mạc ruột, tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung và tuyến ruột cóthể giảm từ 7:1 xuống 3:1 Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn cảm vớiPEDV, những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể được quan sát sau 12-18 giờ gây nhiễm,

rõ nhất sau khoảng 24 đến 36 giờ, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá hủy tế bàobiểu mô ở kết tràng Đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của heo con rất giống vớiTGEV So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của virus PED diễn ra chậm

hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn (Shibata et al., 2001; Pospischil et al., 2002, Pensaert

and Yeo, 2006) Cho tới nay, chưa có công bố nào cho thấy nó có sự nhân lên của virus

PED ở tế bào ngoài đường tiêu hóa (Shibata et al., 2000; Pensaert and Yeo, 2006).

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở heo giai đoạn heo lớn hơn vẫn chưa được nghiêncứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt trong tếbào biểu mô kết tràng của heo mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm (DeBouck andPensaert, 1980) Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơnhay không vẫn chưa được rõ Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào được đưa ra để lýgiải hiện tượng heo chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ởheo vỗ béo và heo trưởng thành (Pensaert and Yeo, 2006) Biểu hiện và tiến triển lâmsàng ở heo sạch bệnh (không nhiễm PEDV) bị gây nhiễm chủng PEDV đã thích nghi trênmôi trường nuôi cấy tế bào (ca-PEDV) nhẹ hơn nhiều so với heo nhiễm chủng PEDVchủng hoang dại (wt-PEDV) So với chủng wt-PEDV, độc lực của chủng ca-PEDV yếuhơn nhiều, tốc độ sinh sản virus chậm hơn, và sự biến đổi về mặt vi thể ở các cơ quan của

heo nhiễm virus cũng kém rõ ràng hơn (Pospischil etal., 2002).

2.2.6 Triệu chứng lâm sàng

Theo Pensaert và Yeo (2006), khi heo mắc PED, biểu hiện chủ yếu và thường làduy nhất ở heo đó là tiêu chảy mạnh, phân rất nhiều nước Bệnh xảy ra ở những trạigiống mẫn cảm có tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong rất khác nhau Heo ở tất cả các lứa tuổi đều

có thể mắc với tỷ lệ mắc có thể lên tới 100% Biểu hiện của PED tương tự như TGE,nhưng PED lây lan chậm hơn và có tỷ lệ chết ở heo con thấp hơn

Heo con theo mẹ: Heo con dưới 1 tuần tuổi có thể chết do mất nước sau khi tiêu

chảy 2 đến 4 ngày Tỷ lệ chết ở heo con trung bình khoảng 50%, nhưng có thể cao hơntới 100% Heo con bị tiêu chảy nặng, lười bú, nôn ra sữa Heo rất gầy do mất nước, nằmtụm lại và chồng lên nhau và thích nằm trên bụng mẹ Ruột bị xuất huyết nặng (Nguyễn

Tất Toàn et al., 2012)

Heo ở các lứa tuổi khác: Ở giai đoạn lớn hơn, heo thường tự hồi phục sau khi

quá trình tiêu chảy kéo dài được 1 tuần Khi PED cấp tính ở một trại qua đi, heo con giaiđoạn 2-3 tuần sau cai sữa vẫn có thể có biểu hiện tiêu chảy và heo mới nhập về thườngphát bệnh Vài năm gần đây, những đợt bùng phát cấp tính điển hình với tỷ lệ chết caotrên heo sơ sinh hiếm xảy ra ở Châu Âu, nhưng lại được báo xảy ra nhiều ở Nhật Bản và

Hàn Quốc (Chae et al., 2000; Pensaert and Yeo, 2006) Một trại nuôi heo thịt mới nhập

heo về từ nhiều nguồn khác nhau hoặc trong giai đoạn nuôi vỗ béo, nếu PED bùng phát ởthể cấp tính, trong vòng một tuần, tất cả heo sẽ có biểu hiện tiêu chảy Heo có biểu hiệnchán ăn, mệt mỏi, phân rất loãng, chứa nhiều nước Biểu hiện về mặt lâm sàng ở heo mắcPED đang trong giai đoạn nuôi vỗ béo có thể nặng hơn so với mắc TGE Heo thường cóbiểu hiện đau vùng bụng nhiều hơn Sau khoảng 7-10 ngày, heo sẽ hồi phục Tỷ lệ tửvong ở heo trong giai đoạn vỗ béo thường từ 1-3%, heo chết nhanh, thường ở giai đoạn

mới bắt đầu tiêu chảy hoặc trước khi có biểu hiện tiêu chảy (Pospischil et al., 2002) Tỷ

lệ chết cao nhất được thấy ở những trại có heo giống mẫn cảm và chịu nhiều stress(Pensaert and Yeo, 2006)

Hình 2.3: Heo nái tiêu chảy do PED Hình 2.2 Heo con ói có dịch nhầy

2.2.7 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể và vi thể của heo mắc bệnh PED tương tự như ở bệnh TGE.Pensaert và Yeo (2006), cho rằng bệnh thể hiện chủ yếu ở ruột non, ruột non căng phồngchứa dịch màu vàng Khi quan sát dưới kính hiển vi, có sự tạo không bào và sự tróc vẩycủa các tế bào ruột ở các nhung mao ruột non vào lúc 24 giờ sau khi cảm nhiễm virus,cũng là lúc bắt đầu tiêu chảy Các nhung mao ruột bị teo ngắn lại rất nhanh và sự hoạtđộng của các enzyme giảm xuống đáng kể dẫn đến sự kém hấp thu ở ruột Ngoài cácbệnh tích tương tự như TGE, sự hoại tử cấp ở cơ lưng đôi khi cũng xảy ra Không thấy có

biến đổi bệnh lý tổ chức ở ruột già (Saif et al., 2012).

Dạ dày căng chứa đầy dịch sữa không tiêu màu trắng đục Ruột non màu nhợtnhạt, chứa đầy dịch lỏng màu vàng hoặc sữa không tiêu vón cục Thành ruột heo con

mỏng và có thể nhìn xuyên qua (Nguyễn Tất Toàn et al., 2012; Stevenson et al., 2013; Nguyễn Thị Lan et al., 2014)

Hình 2.4: Heo con tiêu chảy phân vàng

Hình 2.5 Thành ruột heo bị nhiễm bệnh

PED, rất mỏng, có thể nhìn xuyên thấu

(Puranajeva S et al., 2009).

Hình 2.6 Thành ruột rất mỏng, thấy được

dịch chất bên trong trên heo con 4 ngày

tuổi bị PED cấp (Stevenson et al., 2013)

Bệnh tích siêu vi thể cho thấy có sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trongbào tương tế bào và sự thay đổi của các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng Những sựthay đổi cấu trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vinhung và phần nhô ra của tế bào hấp thu trong xoang ruột Sau đó, các tế bào trở nên dẹthơn, liên kết vòng bịt giữa các tế bào biểu mô mất đi và tế bào được phóng thích vào bêntrong lòng ống ruột (Pensaert and Yeo, 2006)

2.2.8 Chẩn đoán

a) Chẩn đoán lâm sàng

Dựa trên đặc điểm dịch tễ: Bệnh thường phát ra vào mùa lạnh, dịch tiêu chảy cấpxuất hiện rất nhanh (2-3 ngày đến 1-2 tuần), trên toàn đàn, kể cả heo nái, không điều trị đượcbằng kháng sinh Heo mọi lứa tuổi đều có thể bị bệnh nhưng nhạy cảm nhất là heo sơ sinh với tỷ

lệ bệnh và tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (Pensaert and Yeo, 2006)

Dựa vào triệu chứng và bệnh tích điển hình

Heo con theo mẹ bị bệnh sẽ bỏ ăn, đói, tiêu chảy (rất lỏng, hơi vàng, mùi hôi, sữakhông tiêu hóa) và heo nằm chồng lên nhau, mình heo dính phân bê bết Heo con theo mẹchết rất nhanh do mất nước, mất chất điện giải, heo bị lạnh… Heo 3 tuần trở đi, heo caisữa… nếu có biện pháp hỗ trợ sẽ vượt qua bệnh và tỷ lệ chết không đáng kể (Nguyễn Tất

Toàn et al., 2012)

Bảng 2.1 Chẩn đoán phân biệt PED với các bệnh gây tiêu chảy khác

Lông nhung ruột bình thường

Lông nhung ruột thoái hóa

Hình 2.7 Lông nhung ruột non bị cùn, ngắn lại trên heo con bị PED cấp

(Puranaveja et al., 2009; Stevenson et al., 2013)

PED

- Mọi loại heo đều nhiễm bệnh

- Tiêu chảy và nôn

- Lạnh, nằm chồng lên nhau và thích nằm trên bụng mẹ

- Phân: Heo con màu vàng lỏng và có chứa sữa chưa tiêu hóa hết, cácloại heo khác phân màu xi măng

- Thành ruột mỏng

TGE - Nôn và tiêu chảy dữ dội cùng lúc.

- Phân: Heo con màu vàng lỏng, tanh, chứa sữa không tiêu hóa hết;

heo mẹ phân màu xanh đen, xanh nâu

Tiêu chảy do

Rotavirus

- Heo nhiễm bệnh chủ yếu ở 7-41 ngày tuổi

- Bệnh diễn ra trong khoảng 7 ngày

- Đầu tiên heo nôn, đầy hơi và sau 1-2 ngày thì tiêu chảy

- Phân loãng trắng như sữaTiêu chảy do

- Sau khi chết heo chướng hơi nhanh

- Thành ruột sưng phồng giống PED nhưng có màu đỏ do có xuấthuyết trong ruột

tác nhân khác như virut TGE, Rotavirus, E.Coli, Coccidia do đó chẩn đoán PED không

thể chỉ dựa trên triệu chứng lâm sàng Kết quả chẩn đoán phân biệt phòng thí nghiệm làtối cần thiết để xác định PEDV

Mẫu bệnh phẩm cần lấy để xét nghiệm: Mẫu phân, mẫu dịch miệng, mẫu ruột non

và mẫu huyết thanh xác định sự hiện diện của kháng thể

Các phương pháp chẩn đoán

- Phương pháp phân lập virus: Đối với Coronavirus việc nuôi cấy phân lập gặp

nhiều khó khăn và mất nhiều thời gian do chúng khó phát triển trên giếng nuôi cấy tế bào.Năm 1988, Hofmann and Wyler đã nghiên cứu thành công môi trường nuôi cấy virusPED, sau đó sử dụng các công cụ như kiểm tra huỳnh quang miễn dịch, hay kính hiển vi

điện tử để quan sát virus Năm 1993, Kweon et al., cũng đã tiến hành nghiên cứu và phân

lập thành công virus PED, tạo tiền đề cho những nghiên cứu liên quan đến PED tiếptheo.

- Phương pháp miễn dịch peroxidase (Immunoperoxidase): Phương pháp này

phát hiện được virus PED dựa trên phản ứng tạo màu khi enzyme gắn với kháng thể hoạt

động (Kodak et al., 1999).

- Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays): Giúp xác định

nhanh tác nhân gây bệnh thông qua việc phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên virushoặc kháng thể sinh ra khi nhiễm virus Kỹ thuật ELISA có thể sử dụng kháng thể đơndòng hoặc sử dụng kháng thể tái tổ hợp Tuy nhiên sử dụng kỹ thuật này khó phân biệt

được kháng nguyên PEDV và TGEV (Knuch et al., 1992; Carvajal et al., 1995; Guescetti

et al., 1998; Carman et al., 2001)

- Phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC_Immunohistochemistry) và phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF_Immunofluorescence) là phương pháp cho kết quả

tương đối nhanh, chính xác Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là mẫu bệnh phẩm

để chẩn đoán phải là ruột non của heo được giết mổ khi mới bị tiêu chảy (tốt nhất là trong

vòng 1 ngày sau khi tiêu chảy) (Sueyoshe et al., 1995; Bernasconi et al., 1995; Guescetti

et al., 1998).

- Phương pháp lai tại chỗ (ISH: In Situ Hybridization): Chưa được sử dụng rộng

để chẩn đoán bệnh trên thú Mục đích của phương pháp này là việc xác định đoạnnucleotide đặc trưng trên bộ gen của tác nhân gây bệnh, dựa vào sự bắt cặp của cácnucleotide của đoạn gen mục tiêu với đoạn nucleotide được đánh dấu Kết quả được đọc

từ phản ứng tạo màu của đoạn gene được đánh dấu (Kim and Chae, 2000)

- Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử (EM: Electron Microscopy): Do sử

dụng mẫu là mẫu phân nên quá trình xử lý rất khó khăn và phức tạp Các mẫu phải trãiqua quá trình xử lý mẫu, rồi nhuộm trước khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử Một sốnghiên cứu đã sử dụng phương pháp EM để quan sát, phát hiện và nghiên cứu các tác

nhân gây bệnh PED trên heo (Pensaert et al., 1981; Hofmann and Wyler, 1988)

- Phản ứng RT-PCR (Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)

PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình saochép DNA với sự tham gia của một đoạn enzyme DNA – polymerase chịu nhiệt, có hai đoạnngắn DNA một sợi làm mồi, và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợimới bổ sung với nó Vì vậy để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồioligonucleotit (có độ dài từ 6 – 30 nucleotit) Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởiđầu sao chép, và được enzyme DNA – polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặcthù Các sợi DNA mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên

90oC (92 – 98oC) mà thường là 94oC cho chuỗi xoắn kép DNA tách ra Cả hai sợi DNA đều được

dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi được cung cấp để bám vào vị trí tươngứng cho cả hai sợi Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở hai đầu đoạn DNA cầnnhân lên, sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phíađoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này Độ dài của sảnphẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn, hàng chục ngàn cặp nucleotit Như vậy sau mỗichu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp Hỗnhợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mớitổng hợp, các sợi này sau đó được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắnmồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn.

Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lýthuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi

Phản ứng RT- PCR: thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNAtheo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai phản ứng kế tiếp nhau

+ Phản ứng thứ nhất (RT) – sao chép ngược từ RNA sang cDNA

+ Phản ứng PCR

Phản ứng này đã được sử dụng phổ biến trong việc xác định tác nhân gây bệnh PED

Ishikawa et al., (1997) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện tác nhân gây bệnh PEDV trên mẫu bệnh đã được thu từ heo bị nhiễm bệnh Năm 1999, Kubota et al., đã sử

dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán tác nhân gây bệnh PED, đoạn mồi được thiết kế trênđoạn gene mã hóa protein nucleocapsid (N) để khuyếch đại đoạn gen có kích thước 540

bp Năm 2001, Kim et al., đã ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định sự khác biệt giữa tác nhân TGEV và PEDV gây bệnh trên heo Năm 2006, Song et al., sử dụng kỹ thuật

multiplex RT-PCR để phát hiện cùng một lúc nhiều tác nhân gây bệnh như PEDV, TGEV

và porcine GAR (porcine group A rotavirus) Song and Park (2012), sử dụng RT-PCR đểxác định cả chủng virus ngoài thực địa lẫn virus nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

- Phương pháp nested-RT PCR

Để tăng độ nhạy cảm của phản ứng RT-PCR cho những mẫu chứa RNA số lượng ítngười ta dùng nested-RT PCR (RT-nPCR) khuếch đại 2 lần giúp phát hiện lượng mẫu rất

nhỏ với độ đặc hiệu cao Jung et al., (2003) sử dụng RT-nPCR xác định sự khác biệt

PEDV và TGEV gây bệnh trên heo, và so sánh kết quả phương pháp này với kết quảphương pháp lai tại chỗ

Việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật xét nghiệm này thường tốn nhiều thời gian và chiphí Trong khi đó bệnh PED thường tiến triển và tốc độ lây lan cho toàn đàn là rất nhanh,làm tổn thất nhiều về mặt kinh tế, nhất là với đối tượng là heo con theo mẹ, có tỷ lệ chết

có thể lên đến 100% Trên thị trường hiện nay có bộ kít Anigen Rapid PED-Ag Test Kit,

có thể chẩn đoán nhanh bệnh PED chỉ trong vòng 10 phút, giúp can thiệp kịp thời, giảmthiểu được chi phí và thiệt hại do bệnh