PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Hybridization)

Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích

Bộ công thương Trường đại học công nghiệp thực phẩm

tp HCM

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

(Hybridization)

Nhóm 15 GVHD: Hoàng Xuân Thế

NHÓM 15

Tên MSSV

1 Phạm Ngọc Ý Vy 2022150235

2 Nguyễn Thị Hoài Yến 2022150242

3 Phạm Thị Hoài Xinh 2022150117

4 Trần Thị Thúy Vy 2022150175

5 Phạm Thị Hồng Nguyên 2022150150

Nhược điểm của phương pháp phân tích vi sinh vật truyền thống

- Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả

- Mất nhiều công sức, tốn kém

- Không đáp ứng yêu cầu phân tích thực tế hiện nay

Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm áp dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm

Trong đó, phương pháp lai phân tử được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và được thương mại hóa dưới dạng bộ kit để phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

1 Khái niệm

- Mục đích: Phương pháp lai phân tử (hay còn gọi là

phương pháp mẫu dò) dùng để phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn

gen đặc trưng của vi sinh vật

- Cơ sở của lai phân tử: sự biến tính và hồi tính DNA

Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ quá "nhiệt độ nóng chảy Tm" thì 2 mạch đôi sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết Hydro nối liền mạch Sau khi tách mạch, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ

từ cộng với điều kiện thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này được gọi là lai phân tử

1 Khái niệm

- Đặc điểm của lai phân tử: sự tái bắt cặp xảy ra giữa

2 trình tự có trình tự hoàn toàn bổ sung Các trình tự

bổ sung có thể là DNA hoặc RNA dẫn đến hình thành các phân tử lai DNA-DNA, RNA-RNA hay DNA-

RNA

* Quá trình lai phân tử giữa hai mạch RNA

DNA-2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lai

phân tử

* Nồng độ DNA: nghĩa là số lượng các trình tự bổ

sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng dẫn tới làm tăng tốc độ phản ứng lai phân tử

* Thời gian phản ứng: Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp

* Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn

Tm của chính nucleic acid đó độ 25%

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lai phân tử

* Độ dài của các trình tự: Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bậc hai của tốc độ dài các trình tự bổ sung

* Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5-10 lần Nồng độ NaCl >1,2 M lại hoàn toàn không còn tác dụng

3 Phân loại:

- Lai trên pha lỏng

- Lai trên pha rắn

+ Southern blot + Nouthern blot + Western blot

+ Dot (slot) blot

- Lai tại chỗ

+ Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau

do sự chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít hơn vài độ

- Lai trên pha lỏng: 3 phương pháp thường sử dụng

+ Phương pháp dùng quang phổ kế

+ Phương pháp sử dụng nuclease S1

+ Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

Hiệu ứng siêu sắc :

Nhuộm tím phân tử DNA , nếu đem chúng đun nóng lên và làm lạnh từ

từ thì kết quả là các phân

tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm

Đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi

+ Phương pháp sử dụng nuclease S1

• Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm

• Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, đem xử lí với nuclease S1

• Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng

+ Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

• Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci

• Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết.

• Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 60 0 C trong một dung dịch đệm Natri phosphat

• Nhiệt độ này rất quan trọng bởi vì ở nhiệt độ thấp, sự bắt cặp sai lệch sẽ thường xuyên hơn Tại 600C, DNA chỉ bắt cặp với mạch bổ sung của

nó vì đa số các base đủ cho mạch kép bền vững

ở nhiệt độ này

• Kế tiếp, 1 mẫu của mỗi thể lai mạch đôi khác nhau tạo thành sẽ được đặt vào cột của hydroxylapatite đã được dìm trong chậu nước

550C Khi mỗi thể lai tan chảy, nó được rửa sạch cho vào lọ nhỏ và năng lực phóng xạ của mỗi lọ được xác định Cuối cùng, 1 đường cong tan chảy sẽ được vẽ với những kết quả của thí nghiệm này

Ứng dụng:

• Việc lai DNA có thể đo mức độ tương đồng

về DNA của các loài khác nhau Những DNA lai tương đồng nhiều hơn sẽ tan chảy ở nhiệt

độ cao hơn Kỹ thuật này cho thấy rằng người

và tinh tinh mang DNA giống nhau nhiều hơn

so với DNA của đười ươi hay khỉ đột

+ Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài

Ứng dụng

+ Phân tích các trình tự lặp lại :

• Trong một trình tự DNA, một trình tự lặp lại nhiếu lần sẽ có nhiều cơ may gặp

mạch bổ sung hơn so với một trình tự duy nhất

• Bộ gen của Eucaryote có trình tự lặp lại cao hơn ở Procaryote

3 Phân loại:

- Lai trên pha rắn

+ Lai trên pha rắn: Một trong hai trình tự cần lai được

cố định trên giá thể rắn (màng lai) phát hiện phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ

+ Một trong hai trình tự cần lai được cố định trên giá thể rắn (màng lai) phát hiện phân tử lai thông qua mẫu

dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ

Sơ đồ quá trình lai phân tử trên pha rắn

* Lai trên pha rắn có 4 phương pháp cơ bản:

+ Southern blot

+ Northern blot

+ Western blot

+ Dot (slot) blot

* Nổi bật lên 3 phương pháp được sử dụng rộng

rãi nhất là phương pháp Southern, Northern và

Dot blot.

* Southern blot

• Trích DNA từ tế bào

• Cắt DNA với enzyme giới hạn

• Chạy trên gel agarose

• Làm biến tính DNA với alkali

• Chuyển lên màng nitrocellulose

• Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu

Chuyển DNA từ

gel lên màng lai

Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu

* Northern blot

• Trích RNA từ tế bào

• Làm biến tính với formaldehyde

• Chạy trên gel thường dùng agarose

• Chuyển lên màng nitrocellulose

• Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu

Kỹ thuật Northern blot

* Western blot

• Trích protein từ tế bào

• Làm biến tính với SDS

• Chạy trên gel thường dùng là polyacylamide

• Chuyển lên màng nitrocellulose

• Lai với mẫu dò kháng thể được đánh dấu

Kỹ thuật Western blot

Những đặc tính quan trọng của 3 phương pháp :

Southern Northern Western

Cái gì chia

khối lượng

phân tử đích?

DNA bị cắt bởi enzyme cắt

RNA bị làm biến tính với

formaldehyde

Protein bị làm biến tính với SDS

Mẫu dò DNA mang gene

X có tính phóng xạ

DNA mang gene

X có tính phóng xạ

Kháng thể chống lại protein X đã được đánh dấu phóng xạ hay enzyme

Southern Northern Western

Ứng dụng -Bản đồ giới hạn của gene

X trong chromosome.

- Phát hiện các fragment polymorphysm của cùng 1 gen ở các cá thể khác

nhau -Phát hiện đột biến mất đoạn, điểm hay tái tổ hợp trên 1 gen.

- Bao nhiêu mRNA của gene X hiện diện?

- Độ dài mRNA của gene X?

- Bao nhiêu protein

X hiện diện ?

- Độ lớn của protein X?

+ Dot blot:

• Cho phép định lượng tương đối một DNA hay

RNA đặc trưng trong một hỗn hợp mà không cần

Không cần chạy điện di

• Kỹ thuật dot được dùng trong nghiên cứu những

đoạn DNA ngắn

- Lai tại chỗ

Nguyên tắc :

Ứng dụng : định vị gen trên NST, phát hiện

dòng vi khuẩn tái tổ hợp, nghiên cứu một RNA

chuyên biệt trong tế bào và mô

+ Lai tại chỗ được phát triển từ phép lai

+ Lai trên khuẩn lạc

+ Lai trên nhiễm sắc thể

• PP này cung cấp thông tin chính xác về vị trí và

sự phân bố của một trình tự DNA cần tìm trên

NST nhờ mẫu dò chuyên biệt

• Khi nghiên cứu với ARN, NST không được ủ ở

pH cao, do đó, chúng giữ nguyên ở trạng thái sợi kép và không lai được với mồi

• Nhờ phương pháp này mà cơ chế hoạt động của gen có thể quan sát được trong trong tổ

chức mô

• Trong tế bào và mô, các mRNA có sự phân bố không gian xác định Điều này có liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô.

• Nghiên cứu trên RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể → sử

dụng pp lai trên tế bào và mô.

• Mô được xử lí bằng các pp mô học (cố định, khử nước, tẩm parafin, cắt những lát mỏng (7-10µm), trải trên lam) Kết quả đọc trực tiếp trên lam nhờ kính hiển vi

+ Lai trên tế bào và mô

+ Đối tượng có tổ chức phức tạp (não bộ), pp này giúp định vị chính xác vị trí và sự phân bố của một mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức

+ Khi phối hợp pp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, giúp phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó → xác định

được mối tương qua giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen

+ Bằng cách lai nhiều lát cắt có cấu trúc gần như đồng nhất với nhiều mẫu dò khác nhau → xác định vị trí, sự

phân bố và tương tác giữa các mRNA tham gia vào 1 quá trình sống.

Ứng dụng:

Thử nghiệm Staphylococcus aureus PNA FISH

 Đây là phương pháp xác định Staphylococcus

aureus trực tiếp từ nuôi cấy máu bằng phương pháp

lai tại chỗ với mẫu dò Peptide Nucleic Acid (PNA) có gắn chất huỳnh quang

 Thí nghiệm dựa trên một đầu dò PNA có dán nhãn chất phát huỳnh quang gắn vào một chuỗi đặc hiệu

rRNA 16S của S aureus.

• Phương pháp xác định nhanh chóng (2,5h) S aureus

trực tiếp từ các chai chứa máu chứa cầu khuẩn Gram

âm mọc thành chùm (GPCC) cung cấp thông tin quan trọng cho việc điều trị kháng sinh tối ưu

* Các chủng tham khảo và phân lập lâm

sàng

 Mười bảy chủng tham khảo đại diện cho các loài

vi khuẩn và các loài nấm men có liên quan đến sinh học và liên quan đến lâm sàng

 Bốn mươi tám phân lập lâm sàng đại diện cho

các cầu khuẩn gram dương mọc thành chùm (S

aureus, CoNS bao gồm S epidermidis,

Micrococcus, và Stomatococcus) và cụ thể S aureus được xác định trực tiếp trong nuôi cấy máu tích cực đối với GPCC

* Môi trường nuôi cấy máu

Hệ thống BBL Septi-Chek với môi trường

Columbia broth và bổ sung thêm SPS

* Cách pha môi trường

Pha 35 g bột trong 1 L nước tinh khiết Pha

trộn

triệt để.

 Đun nóng thường xuyên và đun sôi trong 1

phút đê bột được hòa tan hoàn toàn

Thêm Sodium polyanetholesulfonate (SPS)

 0,025 - 0,05%

Hấp ở 121 ° C trong 15 phút.

• Vết bôi cuối cùng được gắn kết bằng cách sử

dụng 1 giọt IMAGEN Mounting Fluid.

• Quan sát kính hiển vi huỳnh quang

S aureus được xác định là cầu khuẩn mọc thành chùm và phát quang

Kết quả dương tính cho S aureus phát huỳnh quang màu xanh trên nền vết đỏ

4 Ứng dụng của lai phân tử :

+ Một con thoi sinh học mới

– tRNA

+ Trên tờ Science (1 July

2005), nhóm tác giả Tohru

Yoshihisa đã cho tho thấy các

tRNA trưởng thành trong tế

+ Y học:

• Trong lĩnh vực y học, dùng pp này với những con thú cần để thực thử nghiệm việc trị bệnh cho người Nếu một loài thú được tìm thấy có sự di truyền tương đồng với người qua việc lai DNA, có khả năng rằng những phương pháp chữa bệnh cho người được khám phá bởi việc thực hiện những cuộc phẫu thuật dựa trên kinh nghiệm về những loài thú.

+ Chăn nuôi :

• Trong ngành thủy sản, dùng pp lai tại chỗ (in situ hybridization) để chẩn

đoán bệnh virus đốm trắng

của tôm.

+ Thực phẩm :

• Dùng pp lai phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen.