Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý đến khả năng hình thành bào tử của Bacillus clausii

17 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được sinh khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii.. 23 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt

BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

giáo TS Đàm Thanh Xuân, người thầy đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt những kiến

thức quý báu, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh, DS Nguyễn Thị Thu Phương

cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã giúp đỡ, góp ý cho em những ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức nhiệt tình của các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công nghiệp Dược

Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy cô giáo trong trường đã tận tình dạy dỗ và dìu dắt em trong năm năm học tại trường

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ủng hộ, khích lệ và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận còn nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận

được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Phạm Thị Thanh Hiền

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Probiotics 2

1.1.1 Đại cương về probiotics 2

1.1.2 Bào tử 4

1.2 Bacillus clausii 7

1.2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái của Bacillus clausii 7

1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii 9

1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan tới B.clausii 12

1.3 Phương pháp đông khô 13

1.3.1 Khái niệm về phương pháp đông khô 13

1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô 13

1.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 14

1.3.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 15

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 16

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được sinh khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii 17

2.2.2 Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu Bacillus clausii ở dạng bột đông khô 17

2.3.2 Phương pháp xử lý sinh khối thu bào tử trong môi trường lỏng 18

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu bào tử trên môi trường rắn 19

2.3.4 Xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tục 19

2.3.5 Phương pháp cân xác định lượng sinh khối và bào tử thu được 21

2.3.6 Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật 21

2.3.7 Phương pháp nhuộm màu quan sát tế bào sinh dưỡng và bào tử (phương pháp Ogietska) 21

2.3.8 Phương pháp xác định hàm ẩm của bột đông khô 22

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được sinh khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii 23

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành bào tử B clausii 23

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng tạo bào tử của B clausii 28

3.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa Bacillus clausii 34

3.2.1 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa B clausii 34

3.1.2 Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa B clausii………35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

ARN Acid Ribonucleic

ATCC American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật

Hoa Kì) CFU Colony Forming Unit

DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí

hiệu chủng giống thuộc bộ sưu tập vi sinh vật và tế bào của Đức)

ĐK Đông khô

FAO Food and Argiculture Organization

MT1 Môi trường canh thang

OD Optical Density (mật độ quang)

STT TÊN BẢNG Trang

1 Bảng 1.1 Khả năng kháng kháng sinh của chủng Bacillus clausii 10

2 Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii 11

3 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 15

4 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 16

5 Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng và sinh bào tử của B clausii theo

thời gian nuôi cấy

24

6 Bảng 3.2 Số lượng VSV trong các mẫu đông khô sau khi xử lý ở

các nhiệt độ khác nhau

30

7 Bảng 3.3 So sánh khả năng tạo bào tử của Bacillus clausii với

Bacillus subtilis theo phương pháp nuôi cấy trong môi trường rắn và

xử lý sinh khối để thu bào tử

31

8 Bảng 3.4 Gía trị hàm ẩm và số lượng VSV trong thời gian bảo quản

của mẫu đông khô chứa B clausii

36

STT TÊN HÌNH Trang

1 Hình 1.1 Sự hình thành bào tử vi khuẩn 5

2 Hình 1.2 Cấu tạo bào tử vi khuẩn 6

3 Hình 1.3 Vi khuẩn Bacillus clausii 8

4 Hình 1.4 Bào tử vi khuẩn B clausii dưới kính hiển vi (độ phóng đại

6 Hình 3.2 Hình ảnh tế bào và bào tử của B clausii sau thời gian nuôi

cấy 1 ngày và 4 ngày (dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần)

26

7 Hình 3.3 Hình ảnh tế bào và bào tử của B clausii trước và sau khi

xử lý nhiệt (dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần)

29

8 Hình 3.4 Biến thiên số lượng VSV B clausii theo nồng độ Mn2+ và

nhiệt độ xử lý

30

9 Hình 3.5 Biến thiên hàm ẩm và số lượng VSV B clausii trong mẫu

đông khô trong thời gian bảo quản

37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đường ruột con người chứa một lượng rất lớn hệ vi sinh vật với khoảng hơn 100

tỉ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi (như các loài thuộc chi Lactobacillus,

Bifidobacterium) và vi sinh vật có hại (như Clostridium, Staphylococcus…) Hệ vi sinh

vật đường ruột thường xuyên chịu tác động bởi các yếu tố như chế độ ăn, sự lão hóa, dùng kháng sinh,… làm mất cân bằng giữa vi khuẩn có hại và vi khuẩn có lợi, tạo điều kiện cho vi khuẩn có hại lấn át và gây bệnh, điển hình là bệnh tiêu chảy Vì vậy việc duy trì sự cân bằng của hệ vi sinh đường ruột là vô cùng quan trọng trong việc hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa cũng như miễn dịch Sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi probiotic nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột, phòng và trị bệnh được sử dụng khá phổ biến và ngày càng có xu hướng gia tăng cả về số lượng và dạng bào chế Tuy nhiên, theo các báo cáo gần đây, khoảng 50% sản phẩm probiotic trên thị trường Việt Nam không đủ về số lượng vi sinh vật còn sống, thậm chí không có vi sinh vật sống

Sự bất cập này xảy ra có lẽ là do các nghiên cứu trong nước về quy trình nuôi cấy tạo nguyên liệu probiotic cung cấp cho sản xuất thuốc còn hạn chế 5 7

Trong các chế phẩm probiotic, một sản phẩm hiện đang rất được ưa sử dụng là

Enterogermina chứa Bacillus clausii dạng bào tử (đăng ký ở Italy năm 1958) Tuy

nhiên rất khó để tìm thấy các tài liệu công bố về quy trình sản xuất và xử lý sinh khối

để thu được bào tử Bacillus clausii độ tinh sạch cao Để giải quyết vấn đề này chúng

tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý

đến khả năng hình thành bào tử của Bacillus clausii ”, với các mục tiêu sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được sinh

khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii

2 Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu ở dạng bột đông khô

vi khuẩn sống mà khi cung cấp cho cơ thể vật chủ sẽ đem lại hiệu quả có lợi thông qua

sự cân bằng hệ vi sinh đường tiêu hóa‟‟ 37

Probiotics từ lâu đã được phát hiện và sử dụng làm thực phẩm cho con người Nhóm các vi khuẩn sinh lactic được Elie Metchnikoff (1845 – 1916) phát hiện khi ông nghiên cứu mối liên quan giữa chế độ ăn có sử dụng sữa lên men với sự khỏe mạnh và kéo dài tuổi thọ của người dân Bulgary 37 Cùng thời gian đó, lần đầu tiên

Bifidobacterium cũng được tìm thấy trong phân của những trẻ sơ sinh bú mẹ bởi bác sỹ

người Pháp Henry Tissier 37

Theo WHO và FAO, để có được hiệu quả thực sự thì VSV trong các chế phẩm probiotic cần phải đi qua được môi trường dạ dày và đến được vị trí tác dụng trên đường tiêu hóa Chính vì thế, các probiotic luôn phải có ít nhất 108 – 109

cfu/ml tế bào VSV sống 35 36

Ngày nay, probiotics được đưa vào rất nhiều các chế phẩm khác nhau từ thuốc

cho tới thực phẩm chức năng Ngoài các chi quen thuộc như Lactobacillus,

Bifidobacterium, Bacillus,… còn rất nhiều chi cũng đang được nghiên cứu và ứng dụng

rộng rãi Enterogermina (chế phẩm đăng ký tại Italy năm 1958) chứa probiotic Bacillus

clausii cũng là một chế phẩm hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường

1.1.1.2 Probiotics đối với sức khỏe

Theo các nghiên cứu đã công bố về lợi ích của probiotics, probiotics có các tác dụng sau:

 Tác dụng dinh dưỡng

Một số vi khuẩn probiotic có khả năng sinh các enzym ngoại bào như amylase,

protease (B clausii), lipase (Bifidobacteria)… giúp tiêu hóa thức ăn hay các vi khuẩn

thuộc nhóm lactic có khả năng phân giải chất xơ tạo ra các chất mà cơ thể có thể tiêu hóa được 16 1754

Sản phẩm sữa chua chứa vi khuẩn probiotic có hoạt tính beta-galactosidase, giúp cải thiện tiêu hóa lactose và loại trừ các triệu chứng không dung nạp ở những người kém hấp thu lactose 47

 Khả năng phòng và trị bệnh

- Sử dụng các VSV probiotic có tác dụng làm giảm tiêu chảy do rotavirus, giảm tiêu chảy do kháng sinh và do thuốc nói chung Chế phẩm chứa các loại VSV như

Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, nấm men làm giảm đáng kể

sự phát triển của bệnh tiêu chảy liên quan kháng sinh Một số nghiên cứu cho rằng chi

nấm men Saccharomyces boulardii được sử dụng hiệu quả cho bệnh do Clostridium

difficile gây ra 44

- Bệnh không dung nạp lactose: Người thiếu men lactase nếu tiêu thụ một lượng lactose lớn sẽ gây ra các triệu chứng đầy hơi, buồn nôn, tiêu chảy Tuy nhiên tình trạng này sẽ được cải thiện đáng kể nếu họ sử dụng sữa lên men, do trong sữa lên men lượng lactose đã giảm đi đáng kể, ngoài ra sữa lên men còn chứa một lượng lactase có nguồn gốc từ vi sinh vật giúp tiêu hóa đường lactose 47

- Viêm đại tràng giả (do Clostridium difficile) : khi dùng Lactobacillus sẽ ngăn

ngừa tái phát cho bệnh nhân viêm đại tràng giả đã được điều trị Sử dụng probiotics không thay thế được thuốc kháng sinh nhưng có thể xem như là một phương tiện để sửa chữa những thiếu sót trong cơ thể vật chủ bởi chế độ ăn uống và môi trường, stress;

làm cho vật chủ đề kháng hơn với bệnh tật và làm giảm tần suất sử dụng kháng sinh

44

- Tác dụng lên bệnh viêm ruột hoại tử ở trẻ nhẹ cân non tháng, một nghiên cứu cho

thấy : chế độ ăn probiotics Infloran - sản phẩm chứa Lactobacillus acidophilus và

Bifidobacterium infantis kết hợp cùng sữa mẹ giúp giảm tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm

trọng của viêm ruột hoại tử so với trẻ chỉ dùng sữa mẹ đơn thuần 40

- Phòng dị ứng: Lactobacillus GG đã có hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh dị

ứng sớm, chàm dị ứng ở trẻ em có nguy cơ cao 3145

- Bệnh lý về gan: Các vi khuẩn đường ruột gây ra các tín hiệu nội sinh làm giảm tình trạng gan nhiễm mỡ do làm giảm tổng lượng axit béo tại gan và giảm alanine aminotransferase huyết thanh Vi khuẩn probiotic có thể lên men carbohydrat không thể tiêu hóa và tạo các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những chất này ức chế sự tổng hợp cholesterol trong gan, hoặc điều hòa lượng cholesterol trong huyết tương, vì vậy làm giảm lượng cholesterol trong máu Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và cản trở sự hấp thu cholesterol từ đường ruột 57

- Vi khuẩn có lợi làm tăng đáp ứng miễn dịch cả miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch không đặc hiệu Tăng cường chức năng đại thực bào, tăng số lượng và tăng hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên, tăng sản xuất kháng thể, tăng sinh tế bào lympho [31]57

1.1.2 Bào tử

1.1.2.1 Sự hình thành bào tử

Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn nhóm Bacillus có khả năng hình thành nội bào

tử Qúa trình bào tử hóa bắt đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức ăn

cạn kiệt hoặc có tích lũy sản phẩm có hại Ở các loài thuộc chi Bacillus quá trình hình

thành bào tử tương tự nhau [3]

Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất Vỏ bào tử được hình thành

Áo bào tử được hình thành Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử

Ba enzyme được biết đến đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành bào

tử là glutamine synthetase, RNA polymerase, và pyruvate kinase Pyruvate kinase là enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa phosphoenolpyruvate có vai trò trong cả tăng trưởng (glycolysis) và hình thành bào tử Glutamine synthetase là enzyme lớn chịu trách nhiệm cho amoniac để hợp thành axit amin tham gia vào tạo thành bào tử bằng các sản phẩm catabolic chứa nitơ 33

Hầu hết vi khuẩn Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể cảm ứng tạo bào

tử Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn carbon, nito, hoặc phospho 3

Với Bacillus subtilis, một số nghiên cứu chỉ ra pH thích hợp để tạo lượng bào tử

nhiều nhất là từ khoảng 6 – 8 26 Mangan được cho là yếu tố kích thích quá trình tạo bào tử ở một số vi khuẩn Trong quá trình hình thành bào tử, ion mangan trong môi trường sẽ bị oxy hóa thành mangan oxyd bám trên bề mặt bào tử tạo cho bào tử khả năng kháng nhiệt 27 Theo N Vasantha và Ernst Freese, Mn2+ là yếu tố cần thiết để hình thành bào tử, chúng tham gia kích hoạt PGA-Mutase do đó ngăn cản sự tích tụ của các ức chế 3-PGA và đảm bảo việc cung cấp các hợp chất carbon trong cả hai phần của con đường chuyển hóa kết nối bởi PGA-Mutase 41 50 Quá trình hình thành bào tử này thường mất khoảng 6 – 8 tiếng, tạo ra bào tử tự do có cấu trúc vững bền, chịu được các điều kiện khắc nghiệt Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử lại nảy mầm tạo tế bào sinh dưỡng 32

1.1.2.2 Cấu tạo của bào tử

Bào tử gồm nhiều lớp bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN Lớp áo ngoài, lớp áo trong, vỏ bào tử, lõi

Hình 1.2: Cấu tạo bào tử vi khuẩn

Bào tử có các lớp bao bọc, bề mặt các lớp này xù xì với thành phần hóa học chủ yếu là protein có nhiều glycin, tyrocin và cystein… Có chức năng bảo vệ lớp peptidoglycan của bào tử khỏi tác nhân bên ngoài như enzym, UV, chất oxy hóa… Lớp peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong giúp bào tử không bị khử nước, tạo sự bền vững của dạng sống tiềm sinh Lớp này tích điện âm, trong quá trình nảy mầm, lớp này sẽ bị phân giải do enzym trong bào tử

Lõi bào tử gồm các thành phần như protein bào tương, ribosom, thể nhân chứa ADN 18

Bào tử vi khuẩn có sức chịu đựng cao với môi trường xung quanh Đó là do :

 Nước trong bào tử ở trạng thái liên kết, ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ hơn

 Bào tử có một lượng calci dipicolinat liên kết với protein tạo thành phức chất

có tính ổn định cao hơn với nhiệt độ và sự thay đổi của môi trường Bào tử còn chứa protein acid hòa tan phân tử nhỏ (SASPs) Những protein này liên kết chặt chẽ và ngưng tụ các ADN, có khả năng chống tia UV và các hóa chất gây tổn hại ADN

 Cấu trúc màng nhiều lớp, vỏ bào tử dày, làm giảm tính thẩm thấu của môi trường tới bào tử, bào tử hạn chế sự trao đổi chất với bên ngoài 3

Bào tử vi khuẩn gặp điều kiện thuận lợi về độ ẩm nhiệt độ, dinh dưỡng… sẽ nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng Sự nảy mầm theo ba giai đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng 13

1.2 Bacillus clausii

1.2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái của Bacillus clausii

 Phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey (1994) Bacillus clausii thuộc:

 Phân bố: Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất vườn hoặc đất sét (Bacillus clausii ATCC 31084, Bacillus clausii DSM 8716…) 27

Ngoài ra có thể tìm thấy Bacillus clausii ở trong nước, trong bùn (Bacillus clausii MB9

được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ) 27

 Hình thái: Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành

chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục

Bacillus clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm

Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus clausii Hình 1.4: Bào tử vi khuẩn Bacillus

clausii độ phóng đại 1000 lần

 Sinh hóa: Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein,

gelatin và tinh bột nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60 Cho phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat thành nitrit 10 53

 Điều kiện nuôi cấy: Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình

nuôi cấy cần cấp khí

Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50ºC Mỗi chủng sẽ có nhiệt độ thích hợp

khác nhau, ví dụ: chủng Bacillus clausii DSM 8716 có nhiệt độ thích hợp là 30ºC,

chủng Bacillus clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40ºC… Khoảng pH nuôi cấy thích hợp từ 7-10 Chủng Bacillus clausii KSM-K16 có pH thích hợp là 9,0

Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon bao gồm: Glucose,

L-aribose, xylitol, galactose, dulcitol, sorbitol, meth1yl AD-mannoside, mannose, acetylglucosamine, D-tagose, 2-ketogluconate 105355

N-1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii

Bacillus clausii là vi khuẩn an toàn, có ứng dụng chủ yếu trong chế phẩm

probiotic và sản xuất enzym đặc biệt là protease 2839

 Chế phẩm probiotic

Bacillus clausii là loài vi khuẩn hiếu khí, có khả năng tạo bào tử và bền vững

trong môi trường acid của dịch vị dạ dày Bacillus clausii trên thị trường có bốn loài,

mỗi loài kháng một loài kháng một số kháng sinh nhất định Enterogermina® là chế

phẩm chứa Bacillus clausii của Ý Nó là hỗn vi sinh vật bao gồm bốn chủng kháng

thuốc kháng sinh OC, NR, T và SIN 22 46 52 49 Sự phân biệt bốn chủng

Bacillus clausii dựa trên protein 2-DE (proteomics) Proteomics là thành phần protein

ngoại bào (secretome) của bốn probiotic OC, SIN, NR, và T 19 20]

Báng 1.1 Khả năng kháng kháng sinh của chủng Bacillus clausii

Nhạy cảm với carbapenem, co- trimoxazole, fluoroquinolon, gentamicin,

glycopeptid, oxazolidinon, streptogramin

Bacillus clausii thường được dùng trong các chế phẩm dược phẩm và một số thực

phẩm chức năng để bổ sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột, giúp phòng ngừa và phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em, đặc biệt là sau khi dùng kháng sinh kéo dài 46

Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii

STT Tên thương

mại Thành phần

Dạng bào chế Nhà sản xuất

1 Enterogermina Bào tử B clausii Hỗn dịch,

viên nang

Sanofi-Synthelabo S.P.A

2 Ginkid Bào tử B clausii Hỗn dịch

Công ty CP Dược phẩm Quốc tế

4 Spobio Cl Bào tử B clausii Hỗn dịch Công ty cổ phần

ANABIO

5 Bioimucan

Bào tử Bacillus subtilis, Bào tử Bacillus clausii, Bào tử Bacillus

coagulans, beta-glucan,

taurin, lycin, cholin, kem, B1, B2, B5, B6, B9, Canxi

Thuốc cốm Công ty CP Dược phẩm INFO Việt

Nam

6 Insotac L sporogenes,

CT TNHH Dược Phẩm

Mê Linh

 Sản xuất enzym

+ Một số chủng Bacillus clausii ví dụ: Bacills clausii KSM-K16 được sử dụng

trong sản xuất protease Đây là một enzym quan trọng chiếm trên 65% thị trường các enzym công nghiệp 38 Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như chất

tẩy rửa, công nghiệp thuộc da… Cũng giống như các sinh vật Bacillus khác, Bacillus

clausii KSM-K16 tiết ra protease trực tiếp vào môi trường, đặc biệt là trong thời kỳ

dinh dưỡng thấp, cùng với quá trình hình thành bào tử Hoạt tính enzym protease đạt được ở 55ºC và pH là 12,3 2839

 Sản xuất surfactants

Vi sinh vật Bacillus clausii 5B còn được nghiên cứu sinh tổng hợp biosurfactants

hiện đang được ứng dụng rộng lớn trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, nông nghiệp và các ngành công nghiệp hóa dầu Ưu điểm của biosurfactants là thân thiện môi trường, độc tính thấp, phân hủy sinh học, khả năng tương thích môi trường tốt hơn, tạo bọt nhiều hơn, tính chọn lọc cao, hoạt động cụ thể tại nhiệt độ khắc nghiệt, độ pH

+ B clausii còn được chứng minh có tác dụng tích cực, giúp điều hòa miễn dịch với trẻ

em bị dị ứng và nhiễm trùng đường hô hấp tái phát [23][24]

+ Nghiên cứu của Kobayashi cho kết quả enzyme M-protease sinh ra từ B clausii

KSM-K16 có khả năng chịu nhiệt và tồn tại được pH cao [42]

Tại Việt Nam:

+ Trong Tạp chí khoa học của đại học Huế năm 2010 đã công bố thông tin B clausii B2/2 có khả năng bám dính đồng thời với vi khuẩn B cereus và B clausii B1 không bám dính với B cereus nhưng lại bám dính với Escherichia coli [2]

+ Tác giả Nguyễn Thị Bích Ngọc đã tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn vi

khuẩn B clausii cho kết quả nguồn hydrat carbon thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn là

glucose 2% trong điều kiện hô hấp hiếu khí, thời điểm thích hợp thu sinh khối là sau 24 giờ nuôi cấy [9]

+ Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hiền cho kết quả 4 ngày là thời điểm B clausii

hình thành bào tử nhiều nhất [4]

+ Nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Ngọc Bích cho thấy xử lý sinh khối B clausii bằng

lysozym thu được bào tử tinh khiết và lớn [1]

+ Nghiên cứu của tác giả Phùng Thị Ngọc Huyền cho thấy tính ưu việt của mẫu

nguyên liệu bào tử B clausii trong dung dịch NaCl 0,9% [8]

1.3 Phương pháp đông khô

1.3.1 Khái niệm về phương pháp đông khô

Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua trạng thái lỏng Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu Như vậy, đông khô được thực hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp (thường là âm) Chế độ làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước Ở áp suất nhất định, nhiệt độ thăng hoa của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [14][43]

1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô

 Giai đoạn lạnh đông

Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm [14][43]

 Giai đoạn thăng hoa

Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng [14][43]

 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại

Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị sấy chân không bình thường Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [14][43]

1.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô

 Ưu điểm

Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu [43]

 Nhược điểm

- Giá thành thiết bị cao

- Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao

- Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao

Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản phẩm phải có chất lượng cao [43]

1.3.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô

Đông khô được ứng dụng trong ngành dược: trong sản xuất các thuốc kháng sinh (penicillin, cephalexin ); làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh vật Ngoài ra, đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, vi sinh, thú y để bảo quản một số sản phẩm khác [43]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất

 Nguyên liệu: Chế phẩm Enterogermina chứa Bacillus clausii

 Hóa chất

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất pha môi trường Hóa chất sử dụng thu bào tử Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ

Pepton Ấn Độ Lysozym Viện kiểm nghiệm Cao thịt Merck – Đức KH2PO4 Trung Quốc

NaCl Trung Quốc NaOH Trung Quốc

Thạch bột Việt Nam KCl Trung Quốc

Glucose Trung Quốc NaCl Trung Quốc

 Các dung dịch sử dụng trong đề tài: Pha theo DĐVN IV

- Dung dịch KCl 1M: Hòa tan 7,45g KCl trong vừa đủ 100ml nước cất

- Dung dịch NaCl 1M: Hòa tan 5,84g NaCl trong vừa đủ 100ml nước cất

- Dung dịch lysozym 1mg/ml: Hòa tan 0,100g lysozym trong vừa đủ 100ml nước cất tiệt trùng

- Dung dịch NaCl 0,9%: Hòa tan 9,0g NaCl trong vừa đủ 1000ml nước

- Ngoài ra còn 1 số dung dịch: dung dịch đỏ Fuchsin, dung dịch Xanh

methylen, dung dịch HCl 0,5%, dung dịch H2SO4 1%

2.2.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

 Môi trường canh thang (MT1)

Pepton 1.0 g

Cao thịt 0.5 g

NaCl 0.5 g

Nước máy vừa đủ 100 ml

 Môi trường thạch thường (MT2) = MT1 + 1,8g thạch

 Môi trường sản xuất bào tử (MT3) theo Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương Pepton 10.0 g

Bảng 2.2: Các thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Tủ cấy vô trùng Bioair (Italy)

Tủ ấm Memmert (Đức)

Tủ lạnh sâu Đức

Tủ lạnh Toshiba (Nhật)

Tủ sấy Memmert (Đức)

Tủ lắc Bioshake (Đức)

Máy ly tâm Rotofix (Đức)

Nồi hấp tiệt khuẩn ALP – Nhật

Máy vortex IKA (Đức)

Lò vi sóng Daewoo (Hàn Quốc) Cân kĩ thuật Đức

Bình nón, đĩa petri, ống nghiệm, đầu côn, pipet,

cốc có mỏ, ống ly tâm, giấy lọc…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được

sinh khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii

2.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành bào tử B

clausii

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng hình thành

bào tử của B clausii

2.2.2 Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu

Bacillus clausii ở dạng bột đông khô

2.2.2.1 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa

B clausii

2.2.2.2 Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa B clausii

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Hoạt hóa và nhân giống

 Hoạt hóa giống từ ống giống

Pha 100ml môi trường canh thang (MT1) (theo mục 2.2.2) trong bình nón dung tích 250ml, đậy bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút,

để nguội Tiến hành cấy giống B clausii từ ống giống vào bình nón trong tủ cấy vô

trùng Nuôi cấy trong máy lắc ở 37ºC, với tốc độ 110v/p trong 24 giờ Sau 24 giờ, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường

 Nuôi cấy trong môi trường lỏng

Chuẩn bị 100ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml Hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút Cấy 10ml dung dịch giống đã được hoạt hóa vào Ủ trong máy lắc 37ºC với tốc độ 110v/p trong các thời gian xác định Sau đó tiến hành xử lý dịch nuôi cấy theo phương pháp thích hợp

2.3.2 Phương pháp xử lý sinh khối thu bào tử trong môi trường lỏng

2.3.2.1 Phương pháp xử lý sinh khối bằng lysozym

+ Ly tâm dịch sinh khối sau nuôi cấy (4000 v/p trong 15 phút) , thu cắn

+ Cắn được hòa trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm khoảng 20ml dung dịch lysozym (1mg/ml), ủ 37ºC trong 120 phút để phá vỡ vỏ bọc tế bào, giải phóng bào tử

15-+ Ly tâm dịch thu cắn (4000 v/p trong 15 phút)

+ Hòa cắn trong 30ml dung dịch KCl 1M để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn (4000 v/p trong 15 phút)

+ Tiếp tục hòa cắn trong 30ml dung dịch NaCl 1M để loại hoàn toàn vỏ tế bào,

ly tâm dịch thu cắn (4000 v/p trong 15 phút)

+ Thu cắn và rửa bằng nước cất 3 lần thu được bào tử

2.3.2.2 Phương pháp xử lý nhiệt và đông khô

Nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.1 Đem xử lý nhiệt dịch nuôi cấy bằng cách đun cách thủy ở nhiệt độ nghiên cứu trong 1h Ly tâm thu sinh khối (4000v/p) trong 15 phút, rửa sinh khối nhiều lần bằng nước cất đã hấp tiệt trùng Sinh khối thu được phối hợp với sữa gầy 20% với tỷ lệ 100ml dịch sinh khối /10ml sữa gầy

và phân tán đều trên máy Vortex Đổ hỗn dịch này ra các lọ thủy tinh đã được làm sạch

và hấp tiệt trùng từ trước, đậy kín bằng giấy nhôm, rồi tiến hành đông khô theo các bước sau:

- Tiền đông: Cho mẫu vào trong tủ lạnh sâu -80ºC cho tới khi mẫu đông rắn hoàn toàn

- Làm khô: Các mẫu sau khi tiền đông được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô nhiệt độ khoảng -50ºC, 0,055 mbar trong 24 giờ

Sau khi đông khô mẫu được bảo quản trong lọ thủy tinh có nút cao su đựng trong túi polymer kín

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu bào tử trên môi trường rắn

Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường sản xuất bào tử đã vô khuẩn (MT3), cấy chuyển 2ml chủng giống đã được hoạt hóa ở trên vào bề mặt môi trường trong mỗi đĩa petri và ủ ở 370

C ±10C trong 10 – 14 ngày Trong quá trình cấy chuyển có thể thêm một vài viên bi thủy tinh vô khuẩn lên bề mặt môi trường khi cấy chuyển hoặc dùng que chang đều để vi khuẩn có thể dễ dàng trải đều trên bề mặt môi trường cấy Sau thời gian ủ, kiểm tra tỷ lệ bào tử tạo thành bằng phương pháp nhuộm bào tử và soi dưới kính hiển vi để chắc chắn tỷ lệ bào tử đã tạo thành từ 70 – 80% Gạt bào tử vào nước muối sinh lý vô khuẩn Để lắng trong tủ lạnh 2-80C trong 24h Tiếp tục rửa vào lần đến khi thu được hỗn dịch có màu trắng đục Đun nóng hỗn dịch bào tử ở 70- 800

C trong

30 phút để diệt dạng thực thể Đếm số lượng vi khuẩn trong 1ml hỗn dịch thu được bằng phương pháp đĩa thạch

2.3.4 Xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tục

Chuẩn bị bình nón dung tích 250ml chứa chính xác 100ml nước muối sinh lí Các ống nghiệm mỗi ống chứa chính xác 9ml nước muối sinh lí Các bình nón chứa môi trường thạch thường (MT2) Hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút

 Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy: