phương pháp lai phân tử

Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy” của DNA:Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” Tm thì 2 mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hi

Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy” của DNA:

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì 2 mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền 2 mạch

Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của phản ứng Hiện tượng “cộng hưởng” này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng nhất định thì hoàn toàn không có tác dụng Nhưng nếu lực kéo đủ mạnh để làm bật chỉ một nút nhỏ thì toàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào

Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này

có tên gọi là “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect) Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base (thành phần hấp thu ánh sáng ở bước sóng 260nm) nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song; cấu trúc đó che lấp 1 phần các base khiến chúng không hấp thu ánh sáng như những đơn vị toàn vẹn, khác với ở DNA mạch đơn

Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” của DNA:

Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các liên kết hidro Sự tách rời 2 mạch tương ứng với sự phá vỡ các liên kết ấy Do đó, số lượng các liên kết và yếu tố làm thay đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của phân tử DNA

a Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA:

Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau (A=T; G C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là tỷ lệ các base G,C Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng công thức sau:

Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C)

b Ảnh hưởng của độ dài DNA:

Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2 mạch càng lớn bấy nhiêu

và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau:

∆Tm = -500/số lượng cặp base Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với những đoạn DNA ngắn Điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở phần trên

c Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch): Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính ổn định của 1 phân tử lai Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho mỗi 1% phần trăm bắt cặp sai lệch Nhưng cũng như thành phần các base, các mismatch chỉ có

ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn

d Ảnh hưởng của môi trường phản ứng:

- Ảnh hưởng của nồng độ muối:

Sự giảm lực ion ( nồng độ muồi) của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh: nhiệt độ nóng chảy” Tm sẽ giảm khỏang 150C cho mỗi logarithm nồng độ đối với các ion hóa trị I Các cation hóa trị II còn có tác động mạnh hơn Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA

- Ảnh hưởng của Formamide:

Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều Đối với những đoạn dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo công thức sau:

∆Tm = - 0,6 x (% formamide) Formamide được sử dụng trong các phương pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai Nồng độ thong dụng là 50% tương ứng với việc hạ Tm xuống 300C

Trong thực tế, cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán Tm Công thức thực nghiệm sau cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm:

Tm = 16,6 log [M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - %mismatch

- 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide)

Công thức này đúng cho những đọan DNA ngắn hơn 100 cặp nucleotide; trrong đó [M] biểu thị nồng độ ion Na+

Khái niệm về lai phân tử

- Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp

sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột

- Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được giảm từ

từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại

-> Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization)

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử

a Nồng độ DNA và thời gian phản ứng:

- Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng ;

 tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên

- Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp

b Nhiệt độ:

Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại ở nhiệt

đố thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%

c Độ dài của các trình tự : Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của độ dài các trình tự bổ sung

d Lực ion:

Nồng độ NACl 1M làm tằng tốc độ phản ứng lên từ 5 đến 10 lần Nồng độ NaCl vượt quá 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng

Lai trong pha lỏng

a) Nguyên tắc:

- Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là 1 dung dịch đệm

- Sự lai phân tử này chỉ xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ

b) Phân tích định lượng các phân tử lai: có 3 phương pháp thường dùng

 Phương pháp dùng quang phổ kế

DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn

Sự chuyển từ DNA mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định thông qua giá trị mật độ quang (OD) ở bước song 260nm

Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn – hiện tượng này gọi

là “hiệu ứng siêu sắc”.

“Hiệu ứng siêu sắc”: nhuộm tím phân tử DNA, nếu đem chúng đun nóng lên và làm lạnh từ từ

thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia

UV mạnh hơn DNA mạch đôi (phần này ko chèn vào powerpoint nha, chỉ để ảnh rồi mình tự nói)

 Phương pháp dung Nuclease S1

Nuclease S1 là một enzyme có khả năng thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể DNA hay RNA

Dung dịch phản ứng lai được trích ra 1 phần, đem xử lý với Nuclease S1

Các mạch đơn đều sẽ bị thủy giải, sản phẩm của pứ là oligonucleotides hoặc nhóm nucleotide 5’ phosphoryl

Các nuleic còn lại được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng

 Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

Hydroxylapatite là những tinh thể phosphate calci

Kĩ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong tế bào

mà không cần tách chiết

Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 60oC trong một dung dịch đệm Natri phosphate

Nhiệt độ này rất quan trọng bởi vì ở nhiệt độ thấp, sự bắt cặp sai lệch sẽ thường xuyên hơn Tại

60oC, DNA chỉ bắt cặp với mạch bổ sung của nó vì đa số các base đủ cho mạch kép bền vững ở nhiệt độ này (phần này cũng vậy)

Kế tiếp, 1 mẫu của mỗi thể lai mạch đôi khác nhau tạo thành sẽ được đặt vào cột của

hydroxylapatite đã được dìm trong chậu nước 55oC Khi mỗi thể lai tan chảy, nó được rửa sạch cho vào lọ được xác định Cuối cùng, 1 đường cong tan chảy sẽ được vẽ với những kết quả của thí nghiệm này

d) Các ứng dụng của phương pháp lai trong dung dịch:

 Tính được tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở 2 loài gần nhau

Việc lai DNA có thể đo mức độ tương đồng về DNA của các loài khác nhau Những DNA lai tương đồng nhiều hơn sẽ tan chảy ở nhiệt độ cao hơn Kĩ thuật này cho thấy rằng người và tinh tinh mang DNA giống nhau nhiều hơn so với DNA của đười ươi hay khỉ đột

 Phân tích các trình tự lặp lại

Trong một trình tự DNA, một trình tự lặp lại nhiều lần sẽ có nhiều cơ may gặp mạch bổ sung hơn

so với một trình tự duy nhất

Bộ gene của Eukaryote có trình tự lặp lại cao hơn Prokaryote

 So sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại

Ở Prokaryote, bộ gene không chứa các trình tự lặp lại nên động học lai của tất cả các trình tự là như nhau Tính chất này được sử dụng để so sánh kích thước bộ gene ở các loài sinh vật

Prokaryote

 Ưu điểm: hiệu quả của quá trình lai cao, quá trình phân tích và định lượng các phân tử lai chính xác

 Nhược điểm: quy trình làm phức tạp, khó thực hiện; khó tách các phân tử lai ra khỏi quá trình; có thể xảy ra sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng một phân tử

Lai trên pha rắn :

2-1 Nguyên tắc

- Cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng

- Điểm khác biệt là 1 trong 2 trình tự bổ sung (trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định

trên một giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon).

Ưu điểm

+ Thao tác dễ dàng

+ Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở dung dịch thuốc thử

+ Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng một phân tử

Khuyết điểm

+ Phân tích định lượng các phân tử lai kém chính xác

+ Hiệu quả thấp

+ Vận tốc lai trên pha rắn <10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung

2-2 Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn:

- Lai trên pha rắn có rất nhiều ứng dụng, hiện nay có 4 phương pháp cơ bản đó là:

Southern blot

 Northern blot

 Western blot

 Dot (slot) blot

- Nổi bật lên 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp Southern, Northern và Dot blot

1 SOUTHERN BLOT :

- Mục đích : Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage,…

- Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975

Sơ đồ lai Southern blot.

Các ứng dụng quan trọng của Southern blot :

- Lập bản đồ giới hạn của một gen

- Phát hiện các đa dạng trình tự (fragment polymorphism) của cùng một gen ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng

- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn

Các bước thực hiện Sounthern blot.

1) hỗn hợp các đoạn DNA mạch đôi tạo bởi

xử lý DNA bằng enzyme cắt đặc hiệu được

tách ra theo độ dài bằng điện di trên gel

2) Một bản nitrocellulose hoặc nylon được

đặt lên trên gel, các tờ giấy thấm được đặt

lên trên Toàn bộ sẽ được đặt lên một lớp

bọt biển trong dd alkali Các đoạn DNA đã

được tách rời sẽ được chuyển lên bản

nitrocellulose (hoặc nylon) bằng blotting: dd

đệm sẽ được hút lên qua gel → bản nitrocellulose → giấy thấm, mang theo các đoạn DNA Khi di qua bản nitrocellulose, các đoạn DNA này sẽ được giữ lại và bám chặt trên đó

3) bản nitrocellulose được gỡ cẩn thận ra khỏi lớp gel

4) bản này được đặt vào trong một túi nhựa dán kín chứa dd đệm cùng với các đoạn đầu dò phóng xạ DNA có trình tự đặc hiệu mong muốn Túi sau đó được để trong điều kiện thích hợp cho sự lai

5) Bản được lấy khỏi túi và rửa sạch, để cho chỉ có những đầu dò đã lai với DNA trên bản được giữ lại Sau khi chiếu tia X, các DNA đã lai với đầu dò sẽ cho một băng trên ảnh

Ứng dụng của Southern blotting:

1 Kỹ thuật Southern blotting được sử dụng để phát hiện DNA trong mẫu nhất định.

2 Dấu tay DNA là một ví dụ về phương pháp thấm nước phía nam

3 Được sử dụng để kiểm tra quan hệ cha con, xác định tội phạm, xác định nạn nhân

4 Để phân lập và xác định gen mong muốn quan tâm.

5 Được sử dụng trong đa hình độ dài đoạn giới hạn

6 Để xác định đột biến hoặc sắp xếp lại gen trong trình tự DNA

7 Được sử dụng trong chẩn đoán bệnh do khiếm khuyết di truyền

8 Được sử dụng để xác định các tác nhân lây nhiễm

2 NORTNERN BLOT :

- Mục đích : nhằm xác định kích thước và hàm lượng của 1 mRNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp RNA

Bước 1: tách chiết và biến tính

 Tách chiết RNA ra khỏi tế bào

 Tiến hành điện di hỗn hợp RNA vừa tách trên gel agarose

 Làm biến tính các dải băng RNA trên gel nhờ dd formaldehyde

Bước 2: thẩm tích

Chuyển mRNA lên màng lai nitrocellulo hoặc nilon filte Dựa trên nguyên tắc mao dẫn: Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên chuyển các mạch DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng.

Kỹ thuật chuyển RNA từ gel agarose lên màng lai

Bước 3: lai với mẫu dò (probe) có đánh dấu phóng xạ

- Ủ màng lai với mẫu dò ( probe) có gắn đồng vị phóng xạ, hoặc chất phát huỳnh quang.

- DNA cố định trên màng lai kết hợp Probe theo nguyên tắc bổ sung.

Bước 4: phóng xạ tự chụp

 Rửa trôi các probe không được gắn

 Làm khô

 Cho chụp phóng xạ tự động

 Phát hiện số lượng và vị trí nhờ phim

phóng xạ tự ghi hoặc hiển thị huỳnh

quang

3 PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT :

- Mục đích : dùng để phát hiện

protein

- Protein sau khi được chiết tách

và điện di trên polyacrylamide gel

sẽ được chuyển lân màng

nitrocellulose

- Protein cố định trên màng tạo ra

những vệt (blot) có thể thăm dò

(probe) được nhờ sử dụng kháng

thể

- Trước khi thăm dò, các vị trí còn trống trên màng được trám bằng protein để ngăn cản hiện tượng gắn không đặc hiệu của kháng thể lên màng

- Sau đó 1 loại kháng thể (primary antibody) có kháng nguyên chính là protein được xác định được thêm vào và kháng thể này sẽ gắn lên các vệt protein trên màng

- Một kháng thể khác (secondary antibody) có mang một lọai enzyme sẽ bắt cặp với khácg thể ban đầu, enzyme trên phản ứng với cơ chế đặc hiệu tạo ra sản phẩm kết tủa

có màu tại vị trí của phức hợp kháng nguyên_kháng thể

1.Chuẩn bị mẫu protein: protein có thể được tách chiết từ mẫu tế bào, mẫu mô và được định lượng

2.Điện di trên Gel bản mỏng SDS-PAGE (Electrophoresis)

Các phân tử protein sẽ được phân tách bởi quá trình điện di trên gel polyacrylamide với

sự có mặt của sodium dodecyl sulfate (SDS) SDS có thể biến protein từ cấu trúc bậc 3 hoặc 2 thành cấu trúc bậc 1 đồng thời giúp protein mang điện tích âm Do đó, điện cực dương sẽ kéo protein mang điện tích âm di chuyển trên gel, protein có trọng lượng phân tử thấp sẽ di chuyển nhanh hơn và ngược lại protein có trọng lượng phân tử cao

sẽ di chuyển chậm hơn

3.Di chuyển lên màng Sinh học (Blotting)

Protein sẽ di chuyển từ gel sang màng sinh học có cấu tạo từ nitrocellulose (NC) hoặc

từ polyvinylidene difluoride (PVDF) Protein có thể bám trên màng nitrocellulose nhờ tương tác kỵ nước Còn màng PVDF cần phải được ngâm với methanol trước khi sử dụng để hoạt hóa các nhóm điện tích dương trên màng, nhờ đó protein mang điện tích

âm có thể bám vào mang sau quá trình thẩm tách

4.Phát hiện protein đích (Detection)

Tín hiệu của phân tử protein đích có thể được xác định thông qua phương pháp trực tiếp bằng việc sử dụng một kháng thể sơ cấp duy nhất có tích hợp với chất xúc tác sinh học (enzyme)

5.Tín hiệu của phân tử protein đích sẽ được biểu hiện như những vạch tín hiệu, thông qua tấm phim X-quang (X-ray film) hoặc hệ thống cảm biến của máy tính

6.Cường độ của các vạch tín hiệu của phân tử protein đích được biểu hiện trên tấm film X-quang hoặc được xử lý thông qua hệ thống máy tính sẽ cung cấp các thông tin về sự

có mặt có phân tử protein đích trong hỗn hợp hay không, lượng protein đích trong hỗn hợp ít hay nhiều Ngoài ra, để đảm bảo độ chính xác trong so sánh cường độ tín hiệu của protein đích với các protein khác, một số loại protein đối chứng được dùng phổ biến như là Actin, GAPDH, Tubulin, Porin, Histone 2B, PCNA

Ứng dụng của Kỹ thuật Western Blot:

4 DOT VÀ SLOT BLOT :

- Mục đích : định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra Phương phá này có thể sử dụng cho RNA

Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Dot hay 1 khe_Slot) Quá trình lai và phân tách phâan tử lai giống như đề cập ở phần trên Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươ 5c phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thục nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai