kỹ thuật DNA trong công nghệ sinh học

 Kỹ thuật tái tổ hợp DNA: các trình tự nucleotide từ 2 sinh vật khác nhau, thường 2 loài khác nhau, được tổ hợp với nhau trong ống nghiệm in vitro trong cùng 1 phân tử DNA... Genomics

KỸ THUẬT DNA & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1

Các thuật ngữ và khái niệm

Trình tự bộ gene người được hoàn tất vào – 2007

Trình tự bộ gene người được hoàn tất vào 2007

Trình tự bộ gene của hơn 7000 loài đang tiến hành(từ -2010)

Kỹ thuật giải trình tự DNA phụ thuộc vào các tiến

bộ công nghệ, bắt đầu với kỹ thuật tái tổ hợp DNA

 Kỹ thuật tái tổ hợp DNA: các trình tự nucleotide

từ 2 sinh vật khác nhau, thường 2 loài khác nhau,

được tổ hợp với nhau trong ống nghiệm (in vitro)

trong cùng 1 phân tử DNA

Các thuật ngữ và khái niệm

 Công nghệ sinh học: thao tác trên sinh vật hay cácthành phần của chúng để làm nên các sản phẩm hữuích

Ví dụ: kỹ thuật microarray: sự đo mức độ biểu hiệnụ ỹ ậ y ự ộ ệcủa hàng ngàn gene khác nhau

3

Genomics: khoa học về bộ gen, xác định trình tự

nucleotide của DNA bộ gen, và chức năng của chúng, bao gồm giải trình tự, sự tổ chức các gen, các đột

biế ở ứ độ DNA à hiê ứ dò hả thô

biến ở mức độ DNA và nghiên cứu dòng chảy thông tin từ DNA đến protein của 1 tế bào, của 1 mô hay 1

cơ thể

cơ thể.

Proteomics: khoa học nghiên cứu chức năng của tất cả

các protein được biểu hiện, bao gồm: nghiên cứu

cấu hình (conformation), vị trí (localization), các

biến đổi (modification), các tương tác (interaction),

Proteomics is the study of the function of all

expressed proteins

(Tyers, M., & Mann, M (2003) From genomics to

proteomics Nature, 422(6928), 193-197.)Nếu như genomics giúp cho việc chẩn đoán sớm thì

việc ngăn ngừa và chữa trị nhiều bệnh sẽ nhờ

các kết quả của proteomics Các nghiên cứu

proteomics cho thấy ở một số bệnh phân tử

proteomics cho thay ơ một so bệnh, phan tư

protein ở người bình thường và người bệnh

không khác nhau, nhưng protein người bệnh

thiếu biến đổi sau dịch mã

5

5

What is Bioinformatics?

Sử dụng Bioinformatics:

• Lưu trữ/ truy xuất các thông tin sinh học (database)

• Truy xuất/ so sánh các trình tự gen

ế

• Dự đoán chức năng của các gen/protein chưa biết

• Tìm kiếm các chức năng đã được nghiên cứu của mộtg ợ g ộgen

• So sánh dữ liệu với các nghiên cứu khác

• Soạn thảo, đóng góp dữ liệu

7

Chương trình truy xuất trình tự

National Center for Biotechnology Information

GenBank and other genome databases

Tìm kiếm sự tương đồng: BLAST g g (Basic Local Alignmet Search Tool)

Tìm kiếm dữ liệu về trình tự gen/protein quan tâm

Gióng hàng và so sánh giữa trình tự truy vấn và trình

tự trong ngân hàng dữ liệu cho phép tìm kiếm các trình

tự không bắt cặp, các khoảng trống (gap), xác định độ

% identity Amino acids Symbols Amino Symbols

70% Aspartic acid Asp D Proline Pro P

Glutamic acid Glu E Glutamine Gln Q Phenylalanine Phe F Arginine Arg R Glycine Gly G Serine Ser S

MRCGTETGAR

90% Leucine Leu L Tyrosine Tyr Y

DỰ ÁN BỘ GEN NGƯỜI (HUMAN GENOME PROJECT)

bắ đầ à 1990 đ ổ hứ bởi liê hiệ á

-Được bắt đầu vào - 1990, được tổ chức bởi liên hiệp các nhà khoa học trên thế giới: 20 trung tâm giải trình tự ở 6

nước, và một số lượng lớn các phòng thí nghiệm , ộ ợ g p g g ệ

-Mục đích dự án: xác định toàn bộ trình tự của mỗi

chromosome (3,2 tỉ cặp base của bộ gen đơn bội),

2003 hầu như toàn bộ bộ gen người đã được giải trình tự

- 2003, hầu như toàn bộ bộ gen người đã được giải trình tự -2006, phần cuối cùng của chromosome 1 được công bố

- Sự phát triển vượt bậc trong giải trình tự bộ gen ngừơi: Sự p ể vượ bậc o g g ự bộ ge gừơ :

Bộ gen người đầu tiên được công bố: 13 năm; 100 triệu

USD

Bộ gen của James Watson được giải trình tự trong 4 tháng

-Bộ gen của James Watson được giải trình tự trong 4 tháng (2007), ~ 1 triệu USD.

-Hiện tại, bộ gen của 1 người có thể được giải trong thời

i ắ ( í h bằ iờ) 1000 S

11 gian cực ngắn (tính bằng giờ): 1000 USD

Cellular Function

Molecular Interactions

Functional end products

Metabolites (~2500 small molecules)

Genomics Transcriptomics Proteomics Metabolomics

Dòng thông tin trong tế bào và các kỹ thuật -omics

Giải trình tự DNA và nhân dòng DNA - công cụ

t ủ kỹ th ật di t ề

quan trọng của kỹ thuật di truyền

Phương pháp giải trình tự (DNA sequencing) được xây

d t ê ê tắ bắt ặ bổ

dựa trên nguyên tắc bắt cặp bổ sung

Qui trình giải trình tự tự động thế hệ đầu tiên là phươngpháp của Sanger: phương pháp Dideoxy (phương phápgián đoạn chuỗi: chain determination method)

một chuỗi DNA mới được tổng hợp dựa vào thông một chuỗi DNA mới được tổng hợp dựa vào thông tin từ một DNA khuôn thông qua enzyme DNA

polymerase III

polymerase III.

Các nucleotide được biến đổi (dideoxyribonuceotides: ddNTP) nối vào chuỗi DNA đang được tổng hợp với cácchiều dài khác nhau

14

Nếu như một ddNTPs nào đó gắn vào chuỗi đang được tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ bị gián đoạn,

do đó phương pháp này còn được gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi( chain determination method)

Mỗi một ddNTP được đánh dấu hùynh quang nhằmxác định nucleotide tại mỗi điểm cuối của mỗi đọanDNA

DNA

Trình tự của mỗi đoạn DNA sẽ được đọc từ kết quảcủa spectrogram (thanh phổ)

16

Dideoxy Chain y

Termination

Method for

Sequencing DNA

Nhân dòng DNA

Tạo ra nnhiều bản copy của 1 gene đích

-Tạo ra nnhiều bản copy của 1 gene đích

-Đóng vai trò quan trọng trong tạo sản phẩm protein.-Các phương pháp:

Sử dụng vi khuẩn và plasmid

Phản ứng PCR (polymer chain reaction)

21

pháp nhân dòng gene g g

sử dụng

plasmid và

vi khuẩn

Enzyme cắt giới hạn để tạo DNA tái tổ hợp

Enzyme cắt DNA thành các đọan giới hạn (retriction fragment)

Cá ắ iới h đầ dí h ( i k d đầ

Các enzyme cắt giới hạn tạo đầu dính (sticky ends-đầu đính của đọan này bổ sung với đầu dính của DNA khác) hay đẩu bằng (blunt)

Phần lớn các enzyme cắt giới hạn có nguồn gốc tử vi khuẩn.

Enzyme ligase hàn các nối (bond) của các đoạn giới

Kỹ thuật điện di trên gel (Gel Electrophoresis)



Kỹ thuật phân tích và so sánh nhanh chóng bộ gene

Sử dụng gel để tách các đọan acid nucleic hay protein ụ g g ọ y ptheo kích cỡ

Một dòng điện được áp dụng gây ra sự di chuyển củacác đoạn DNA trong gel: DNA/protein có kích thứớc

nhỏ di chuyển trong gel dễ dàng và nhanh hơn các

đọan có kích thước lớn

Southern Blotting (Edwin Southern)

Kỹ thuật nối các đọan DNA với sự lai acid nucleic

Sử dụng mẫu dò (probe) lai với các đọan DNA đã

ểđược phân tách sau khi đã chuyển các đọan này lên

màng (paper –like membrane)

Phản ứng PCR (polymerase chain reaction )

Tạo hàng triệu copy của đọan DNA mục tiêu

Enzyme đóng vai trò quan trọng: Taq polymerase

Enzyme đóng vai trò quan trọng: Taq polymerase (thu từ vi khuẩn chịu nhiệt ở suối nước nóng).

Các mồi trong PCR có thể được thiết kế bao gồm cácg ợ g

vị trí của enzyme cắt giới hạn cho phép sản phẩm đượcnh6an dòng trong plasmid.g g p

Kết quả nhân dòng được giải tình tự và các dòng

mang trình tự đúng được chọn

Các mồi trong PCR có thể được thiết kế bao gồm các

vị trí của enzyme cắt giới hạn cho phép sản phẩm đượcnh6an dòng trong plasmid

Kết quả nhân dòng được giải tình tự và các dòngq g ợ g ự g

mang trình tự đúng được chọn

Sử dụng kỹ thuật DNA để nhân dòng

và biểu hiện gen quan tâm

Các hệ thống biểu hiện gen của eukaryote

Hệ hố biể hiệ là i kh ẩ

Hệ thống biểu hiện là vi khuẩn:

- Sử dụng vector biểu hiện (expression vector):

là ột l i t hâ dò ( l i t ) hứ

là một loại vector nhân dòng (cloning vector) chứa

promoter vi khuẩn hoạt động mạnh

Vi khuẩn không có hệ thống RNA splicing →

- Vi khuẩn không có hệ thống RNA-splicing →

sử dụng cDNA (complementary DNA)

35

(3) mRNA bị phân

cDNA từ gen của eukaryote

(3) mRNA bị phân

hủy

(4) DNA

eukaryote bằng RT- PCR

(4) DNA

polymerase

được thêm vào

(5) cDNA

(3) mRNA bị phân

cDNA từ gen của eukaryote

(3) mRNA bị phân

hủy

(4) DNA

eukaryote bằng RT- PCR

Hệ thống biểu hiện là tế bào eukaryote:

Tế bà hủ Nấ ( t) đ bà dễ

- Tế bào chủ : Nấm men (yeast): đơn bào, dễdàng nuôi cấy như vi khuẩn, có plasmid

Thiết kế plasmid tái tổ hợp: DNA nấm men và

- Thiết kế plasmid tái tổ hợp: DNA nấm men vàDNA vi khuẩn

- Các protein được biến đổi (modified) sau khiCác protein được biến đổi (modified) sau khidịch mã

- Có các protein từ động vật có vú đòi hỏi tiếnCó các protein từ động vật có vú đòi hỏi tiếntrình biến đổi phức tạp hơn: tế bào động vật có vú, tếbào côn trùng được sử dụngg ợ ụ g

Các phương pháp đưa vector vào tế bào chủ:

- Hĩa biến nạp (Chemotransformation) : xử lí

Trữ vector nhân dòng trong thư viện DNA:

- Thư viện bộ gen (genomic library): được làmệ ộ g (g y) ợbởi nhân dòng các đoạn DNA từ toàn thể bộ gen vào 4 loại vector khác nhau tùy theo kích cỡ của đoạn DNA:(i) Plasmid: các plasmid mang các đoạn DNA phát

triển trong vi khuẩn (mỗi dòng tế bào vi khuẩn chứa

các bản sao của một đoạn DNA riêng biệt thuộc bộ

gen)

(ii) Ph (b i h )

(ii) Phage (bacteriophage)

(iii) Bacterial Artificial chromosome (BAC)

(iiii) Yeast artificial chromosome (YAC)

44

Sử dụng kỹ thuật DNA để nghiên cứu

biểu hiện và chức năng của gen

46

Nghiên cứu sự biểu hiện của tương tác của các

Mẫu dò cho mRNA

của gen wg

Mẫu dò cho mRNA của gen en

Xác định sự biểu hiện gen bằng phương pháp lai tại chỗ

(in situ hybridization)

50

Sử dụng microarray và PCR để tìm

dấu ấn di truyền (Genetic markers)

- Dấu ấn di truyền là các trình tự DNA thay đổi trongquần thể

q

- Trong một gen sự biến dị của trình tự là cơ sở của sựhình thành các allele khác nhau

- Các biến dị ở các vùng coding DNA và noncoding

DNA tạo hiện tượng đa hình (polymorphism)

- Hiện tượng đa hình do sự khác biệt 1 cặp base: single nucleotide Polymorphism (đọc là: “snip”)

T bộ ời ó kh ả ài iệ SNP (1/ 100

- Trong bộ gen người có khoảng vài triệu SNP (1/ 100 – 300 cặp base)

58

SNP ở vùng noncoding gen

SNP ở vùng noncoding gen

Vai trò của sinh vật nhân bản và tế bào gốc trong ậ g g

nghiên cứu cơ bản và ứng dụng

xuất ra một hay nhiều cá thể từ một tế bào giống hệt

“cha mẹ”.

không chuyên biệt, có thể sản xuất vô hạn ra các tế bào giống hệt chính nó, và trong điều kiện thích

hợp, nó có thể biệt hóa thành một loại hay nhiều tế bào chuyên biệt

60

Nhân bản thực vật bằng cách nuôi cấy tế bào đơn

- Tính toàn năng (totipotent) của tế bào thực vật

T á đặ điể ư iệt tí h thươ i khá

- Tạo các đặc điểm ưu việt: tính thương mại, kháng bệnh, chống chịu môi trường khắc nghiệt …

Nhâ bả độ ật S h ể hâ

Nhân bản động vật – Sự chuyển nhân

Can the nucleus from a differentiated animal cell direct development of an organism?

64

Reproductive Cloning of a Mammal by Nuclear

Mèo Mẹ cho nhân và con nhân dòng CC (carbon copy) ẹ g ( py)

Màu sắc khác nhau của hai mẹ con là do: random X chromosome inactivation

67

Figure 20 19 How stem cells maintain their own population Figure 20.19 How stem cells maintain their own population

and generate differentiated cells.

Embryonic stem cells

(ES) Adult stem cells

Figure 20 20

Figure 20.20

Working with stem cells

stem cells

ES có tínhpluripotent (tế bàogốc toàn năng)

Sử dụng ES để trịliệu: therapeutic

69

cloning

Tế bào gốc toàn năng được cảm ứng

(induced pluripotentstem cell (iPS cell)

Ứng dụng thực tiễn của CNSH

sử dụng kỹ thuật DNA

71

Trong y học:

Chẩn đoán: dùng RT-PCR chẩn đoán HIV; PCR đểchẩn đoán bệnh hồng cầu hình liềm, máu khó đông, xơệ g , g,nang, Huntington, loãng dưỡng cơ bắp ở các bé trai

(chẩn đoán trươc khi có triệu chứng, hoặc cả trước khisinh); PCR hoặc microarray tìm các SNP; microaray

phân tích sự biểu hiện của các gen ở các bệnh nhân ungthứ vú

Điề trị: Phân tích sự biể hiện gen giúp bác sĩ đưa

Điều trị: Phân tích sự biểu hiện gen giúp bác sĩ đưa

Human Gene Therapy (liệu pháp gen)

Gen được nhân dòng

(allele bình thường không

có ở người bệnh)

1) Chèn RNA của allele bình thường vào retrovirus hay vectro virus khác

có ở người bệnh)

Capsid

RNA của virus

2) Virus nhiễm vào các tế bào tủy

Capsid của virus

73

4) Tiêm tế bào vào bệnh nhân

(khóa) các protein của tế bào ung thư

Ví dụ: imatinib (tên thương mại

chuyên biệt (được biểu hiện vượt

chuyên biệt (được biểu hiện vượt

mức bởi NST chuyển vị)

SẢN XUẤT PROTEIN TỪ NUÔI CẤY TẾ BÀO

Human insulin

Human growth hormone (HGH)

Tissue plasminogen activator (TPA): làm tan cục máu, giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim.

.

77

SẢN XUẤT PROTEIN BởiCÁC ĐỘNG VẬT

BẰNG CHỨNG PHÁP Y & DỮ LIỆU DI TRUYỀN

 Trình tự DNA của mỗi cá thể là duy nhất (trừ

trường hợp sinh đôi) → Độ chính xác trong kiểm tra

dữ liệu DNA rất cao và đáng tin cậy

 Bộ dấu ấn di truyền của mỗi cá thể có thể đượcộ y ợ

phân tích → Dữ liệu di truyền “genetic profile” –

THỰC VẬT CHUYỂN GEN

 Chuyển vào thực vật các gen mong muốn: kháng

thối nhũng chín chậm kháng bệnh chịu đươc khô hạn

thối nhũng, chín chậm, kháng bệnh, chịu đươc khô hạn, tăng sản lượng và chất lượng

 Vector thường được sử dụng: plasmid Ti từ vi khuẩng ợ ụ g p

đất Agrobacterium tumefaciens Plasmid Ti (

DNA của NST tế bào chủ

84

Chính phủ và các tổ chức pháp lý trên khắp thếgiới tìm cách hổ trợ sự áp dụng CNSH trong NNgiới tìm cách hổ trợ sự áp dụng CNSH trong NN,

CN và y học song song với kiểm tra và phê chuẩncác sản phẩm mới và tiến trình SX đảm bảo an toàn

Ví dụ: Mỹ: The Food and Drug Administration theEnvironmental Protection Agency, the NationalInstitutes of Health, and the Department of

A i l

Agriculture