công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI 10 TIẾT  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Các phương pháp lai phâ

Trang 1

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Trang 2

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen

 Các phương pháp lai phân tử

 Phương pháp PCR, ứng dụng

 Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

Trang 3

 Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế

CƠ SỞ KHOA HỌC

Lai giữa các nucleic acid

Trang 4

Lai phân tử là quá trình kết hợp lại

của hai mạch đơn DNA hoặc

DNA-RNA.

Cơ sở của việc lai phân tử là các

mối liên kết hydro giữa các base

trên hai mạch Giữa một base A và

một base T (hoặc U) hình thành

hai liên kết hydro còn giữa G và C

hình thành ba liên kết.

LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID

(DNA – DNA hoặc DNA – RNA)

Lai giữa các nucleic acid

Trang 5

LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID

(DNA – DNA hoặc DNA – RNA)

Trang 6

• LAI SOUTHERN ( DNA – DNA )

• LAI NORTHERN ( DNA – RNA )

• LAI WESTERN ( PROTEIN – PROTEIN )

MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ

Trang 7

So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai

Southern, Northern và Western

Trang 8

• Lịch sử

– Do Edwin Southern đề xuất

năm 1975 và sau đó được tiếp

tục hoàn thiện.

– Với sự phát triển của kỹ thuật

này, Southern đã nhận được

giải thưởng Lancaster trong

lĩnh vực Y học vào năm 2005.

LAI SOUTHERN

Edwin Southern

Trang 9

• Kỹ thuật lai Southern cho biết

– Sự có mặt của đoạn ADN (gen)

– Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen)

– Độ lớn của đoạn AND

– Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò

Trang 10

Các bước tiến hành

(giai đoạn này gồm nhiều bước)

Trang 13

Mẫu dò được phủ trên toàn bộ màng lai nhưng chỉ liên kết với các DNA bổ sung

Bổ sung mẫu dò

Màng lai sau khi rửa

Mẫu dò chỉ còn có mặt ở trạng thái liên kết bổ sung với DNA

Bước 3: Lai phân tử

Trang 14

Các đoạn bổ sung với mẫu dò xuất hiện như các vạch

Màng mang phân

tử lai giữa mẫu dò

đặt trên màng lai cho đến khi sự phát

xạ từ mẫu dò được ghi lên phim

Bước 4: Thu kết quả

Trang 15

Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi

Bước 4: Thu kết quả

Trang 17

• MOVIE_Southern Blot

Trang 18

LAI NORTHERN

• Lịch sử

− Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine

và George Stark tại Stanford University.

− Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng dụng cho phân tích RNA

Trang 19

LAI NORTHERN

• Nguyên lý

– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA

– Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA Các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot.

• Phương pháp này cho biết

– Sự có mặt của mRNA trong mô

– Mức độ thể hiện của gen

– Độ lớn của mRNA

– Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò

Trang 20

Vị trí xảy ra lai RNA-DNA

Phân tách RNA theo kích

thước nhờ chạy điện di

Mẫu RNA

Khay chứadungdịch đệm

Bổ sung mẫu

dò phóng xạmạch đơn

Túi lai

Ghi nhận kết quả bằng phóng xạ tự ghi

Vị trí không lai

Bước1 : chuẩn bị RNA mẫu.

Bước 2 : Chuyển RNA lên màng lai

- Chạy điện di

- Chuyển RNA lên màng lai

Bước 3 : Lai RNA với mẫu dò

Bước 4 : Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai.

Trang 21

LAI WESTERN

• Lịch sử

− Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng thí nghiệm của George Stark ở Stanford Kỹ thuật này đã được W Neal Burnette đặt tên là Western blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot.

Trang 22

LAI WESTERN

• Nguyên lý

– Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể

• Phương pháp này cho biết

– Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô

– Mức độ thể hiện của gen

– Độ lớn của protein

Trang 23

1 Chuẩn bị mẫu protein

2 Chạy điện di SDS-PAGE

3 Chuyển protein lên màng

4 Cố định màng

5 Ủ với kháng thể và phát hiện

Trang 24

Chuẩn bị mẫu

Trang 25

Chuẩn bị mẫu

Tách chiết protein

Hòa tan và biến tính protein

Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích âm

Trang 26

Chạy điện di SDS-PAGE

Cực âm

Cực dương

Trang 27

Chuyển protein lên màng

Gel

Bọt biển Giấy thấm

Màng Giấy thấm Bọt biển

Cực âm Cực dương

Trang 28

Cố định màng

Sau khi sử dụng hệ thống chuyển

protein lên màng, màng sẽ chứa

các protein ở vị trí giống như vị trí

của chúng ở trên gel

Màng được ủ với các protein “khóa” (thường sử dụngBSA hoặc sữa bột) để “khóa” những khoảng trống trênmàng

 tránh kháng thể bám vào khoảng trống của màng

Trang 29

Ủ với kháng thể và phát hiện

Trang 30

Ủ với kháng thể 1: trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4 o C.

Kháng thể 1 gắn với kháng nguyênđặc hiệu Các kháng thể không liênkết với kháng nguyên thì được rửa đi

Màng được ủ với kháng thể thứ 2,kháng thể này nhận biết và chỉ bámvào kháng thể 1 Kháng thể này liênkết với một phân tử cho phép chúng

ta phát hiện được vị trí liên kết đặchiệu giữa kháng nguyên – kháng thểtrên màng

Ủ với kháng thể 2: trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng.

Trang 31

Một số phương pháp phát hiện khác

• Phát hiện nhờ tạo màu

• Phát hiện nhờ quang hóa học

• Phát hiện nhờ phóng xạ

• Phát hiện nhờ phát huznh quang

Trang 32

Kháng thể 2

Sự phát hiện nhờ phát quang hóa học

Trang 33

Tóm tắt quy trình thực hiện

Western blot

Chuẩn bịmẫu protein Chạy điện di SDS-PAGE

phân tách các phân tửprotein theo kíchthước

Chuyển proteinlên màng lai

Màng lai mang cácphân tử protein có vị trígiống như trên bản gel

Xử lý BSA hoặc sữabột để “khóa” chỗtrống trên màng lai

Màng lai được xử lý vớikháng thể 1, kháng thểnày bám đặc hiệu vàokháng nguyên (protein)mục tiêu

Trang 34

So sánh 3 phương pháp lai

Kỹ thuật Gel Phân tử Phát hiện Southern agarose DNA nucleic acid Northern agarose RNA nucleic acid Western polyacrylamide Protein Kháng thể

Định dạng
Số trang	34
Dung lượng	1,24 MB