kỹ thuật phân tách .công nghệ sinh học

TIỂU LUẬN MÔN HỌC KỸ THUẬT PHÂN TÁCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC Đề Tài: Phương Pháp Thử Hoạt Tính Chống Ung Thư... TỔNG QUAN• Ung thư là tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh trên

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

KỸ THUẬT PHÂN TÁCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC

Đề Tài: Phương Pháp Thử Hoạt Tính Chống Ung Thư

1 TỔNG QUAN

2 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ

3 ỨNG DỤNG

4 TÀI LIỆU THAM KHẢO

NỘI DUNG

1 TỔNG QUAN

• Ung thư là tên chung dùng để gọi

một nhóm bệnh trên 200 loại khác

nhau gây ra bởi sự phân chia

không kiểm soát được của tế bào

• Ung thư rất khó phát hiện cho tới

khi nó phát bệnh ra ngoài

• Ung thư lành tính là chỉ việc các

khối u không lan rộng trong cơ

thể Ung thư ác tính lây lan (di

căn) ra khắp cơ thể và dẫn tới

việc chữa trị trở nên cực kỳ khó

khăn

1.1 Ung thư

1.2 Cơ sở phân tử của bệnh ung thư

• Một gen mã hóa protein kích

thích sinh sản bị đột biến và trở

nên hoạt động bất thường, dẫn

đến tế bào có thể sinh sản vô hạn

(bất tử) Một gen mã hóa sản

phẩm ức chế sinh sản bị đột biến

bất hoạt, dẫn đến không còn sự

kiểm soát sinh sản của tế bào

khối u.

Các gốc tự do trong ung thư:

Các tác nhân gây ung thư rất đa dạng: các hợp chất amino, hydrocacbon đa vòng; thực phẩm

Tuy bản chất rất khác nhau, nhưng các tác nhân kể trên có bản chất chung là sinh gốc tự do R* theo các cơ chế khác nhau Đám gốc tự do R* tấn công chuỗi DNA tạo các chất hư hỏng của DNA, tạo NST sai lệch, ghép nhầm các base khi sao chép gây nên đột biến gen.

- Nhiều hợp chất thiên nhiên đã được sử dụng một cách hiệu quả trong việc điều trị, phòng ngừa trong ung thư bằng cách làm tế bào ung thư phát triển kém, hay yểm trợ tối đa để mạng lưới tế bào phòng vệ ( các loại thực bào) có thể truy lùng và huỷ diệt tế bào ung thư ngay từ đầu.

- Các hợp chất có hoạt tính trong việc chống ung thư: Curcumin, Catechin, Allicin, Sulforaphane , Selen, β- Glucan…

Sulforaphanechống ung thư gan, dạ dày

Lycopenechống ung thư tuyến tiền liệt

Catechin

2.2 Phương pháp:

> > Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư (phương pháp sinh học và phương pháp

dược học) Tế bào ung thư in vitro được nuôi cấy theo phương pháp của Skehan et al (1991) [1]

Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư được xác định theo phương pháp SRB Likhiwitayawuid et al [2] Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với các phận tích điện dương của protein tế bào Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein của tổng số tế bào

Nguyên tắc: Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ Kết quả so sánh với chất đối chứng có hoạt tính gây độc đối

với dòng tế bào ung thư thử nghiệm và nếu Giá trị IC50 < 20μg/ml được coi là đạt chuẩn với

chất chưa tinh khiết, Giá trị IC50 < 4μg/ml được coi là đạt chuẩn với chất tinh khiết,

- ODcontrol(-) là giá trị thu được ở giếng thử chỉ có môi trường nuôi cấy mà không có tế bào

- ODcontrol(+) là giá trị thu được ở giếng thử có môi trường nuôi cấy chứa tế bào nhưng không xử lý với mẫu cặn dịch chiết

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

Vật liệu:

- Phân đoạn dịch chiết chứa hoạt chất (mẫu thử)

- Các dòng tế bào ung thư

- Môi trường nuôi cấy tế bào

- Hoạt tính gây độc tế bào được tính bằng phần trăm ức chế khi so sánh mật độ quang học của giếng được xử lý với mẫu nghiên cứu với giếng không được xử lý với mẫu thử Nồng độ ức chế 50% (IC50) được suy ra từ đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử (phần trăm sống sót so với nồng độ chất thử)

3.Ứng dụng

VÍ DỤ 1 : THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ CÂY

MẴNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICA L.) HỌ ANNONACEAE

Cây mãng cầu xiêm thuộc chi Na (Annona), Họ Na

(Annonaceae) Ở nước ta cây Mãng cầu xiêm thường

được trồng để lấy quả, cây Mãng cầu xiêm đã được

dùng để chữa bệnh ngoài da, giun, thấp khớp, Lá còn

được sử dụng với một số công dụng như làm thuốc

lợi tiểu mạnh khi bị phù chân (Amazonia)

Thành phần hóa học:

- Các hợp chất acetogenin:Acetogenin là nhóm chất

chỉ đƯợc tìm thấy ở họ Annonaceae, do vậy đây là

nhóm chất đặc trưng của họ thực vật này

Dịch chiết n-hexan

Thử tác dụng gây độc tế bào

Các dòng tế bào :Các dòng tế bào cung cấp bởi ATCC gồm: tế bào ung thư biểu mô

KB, tế bào ung thư phổi LU, tế bào ung thư vú MCF7.

Tiến hành:

• 200μl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3x10^4 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa

96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1

• Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 /ml, 32 /ml, 8 /ml, 2 /ml, 0,5 /ml, 0,125 /ml, 0,03125 /ml, 0,0078 /ml Ủ ở 370C, 5% CO2 rong 3 ngày.

• Giếng “điều khiển (-)” gồm môi trường không có tế bào, giếng “điều khiển (+)

“200μl dung dịch tế bào 3x10^4 tế bào/ml không xử lý với diachj chiết hecxan, ử 37oC trong 4h, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy

n-Nhận xét:

Chất đối chứng dương Ellipticin thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả 3 dòng tế

bào ung thư KB, LU, MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,31; 0,45 và 0,53 μg/ml Cặn dịch n-hexan của mãng cầu xiêm có tác dụng gây độc tế bào trên cả 3 dòng

tế bào thử nghiệm KB, LU và MCF7 với các giá trị IC50 lần lượt tương ứng là 0,08

μg/ml, 0,7 μg/ml và 6,9 μg/ml đều < 20 μg/ml ( theo tiêu chuẩn Mỹ với chất

chưa tinh khiết) Tác dụng của cặn dịch chiết n-hexan trên dòng tế bào KB là

mạnh nhất thể hiện ở giá trị IC50 nhỏ nhất là 0,08 μg/ml đều < 20 μg/ml , tốt

hơn chất đối chứng Ellipticine với giá trị IC50 lớn hơn; trong khi đó cặn chiết này

có hiệu lực trung bình trên dòng tế bào MCF7

Ví dụ 2: thử hoạt tính tác dụng trên tế bào ung thư của

nụ vối Việt Nam

1 Cây vối có tên khoa học là

Cleistocalyx operculatus (Roxb.)

Phân bố

Cây vối mọc hoang và được trồng hầu

hết ở khắp các tỉnh miền bắc nước ta

Ngoài ra còn gặp ở một số nước châu Á

nhiệt đới như Lào, Campuchia, Trung

Quốc.

Thành phần hóa học

• Lá vối chứa rất ít tanin, alcaloit và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành

phần trong đó có thành phần chính là (Z) β-ocimen,myrcen, (E) β-ocimen

• Vỏ cây chứa triterpen nhóm olean là acid arjunolic

3 Nội dung nghiên cứu

4 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

– Dòng tế bào ung thư phổi: A549

– Dòng tế bào ung thư vú đã kháng adriamicin : MCF7IADR

– Dòng tế bào ung thư vú đã kháng tamoxifen: MCF7/TamR

– Dòng tế bào ung thư dạ dày: NCI-N87

– Dòng tế bào ung thư buồng trứng: OVCAR-8

• Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp Skehan SRB

Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng Sau khi ủ, tế bào được cố định bằng acid tricloacetic, sau đó được nhuộm bằng SRB 0,4%, rửa thuốc nhuộm dư bằng acid acetic 1 % Thôi thuốc nhuộm bằng Triz base, SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan hết, đem mẫu đi đo mật độ quang tại bước sóng 540nm Mật độ quan của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Cao ethnol lỏng

Dịch chiết ethanol

Ethanol 960, chiết ở nhiệt độ thường x3 lần

Cao đặc nụ vối

+ 2l ethanol 960

+ nước (1,5l)

Hình 2 Sơ đồ thu dịch chiêt từ nụ vối

THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 Chuẩn bị mẫu

Mẫu 1: Cao phân đoạn EtOAc

Mẫu 2: Hợp chất 1 phân lập được

dung môi DMSO (dimethyl sufloxide) ở nồng độ

10mg/ml (với nồng độ ban đầu).

DMEM, pha thành 5 nồng độ để thử sao cho nồng

độ cuối cùng của mẫu thử trong giếng lần lượt là

100,50,25,12.5,6.25 µg/ml với mẫu 1 và

20,10,5,2.5,1.25 với mẫu 2 một cách tương ứng.

tế bào ung thư được sử dụng làm thuốc đối chứng

dương trong thí nghiệm, với 5 liều tác dụng trực

tiếp lên tế bào là 20,4,0.8,0.16 và 0.032 µg/ml

o Các đĩa được ủ trong tủ ấm 370 , 5% CO2 trong 24h cho tế bào ổn định, bám lên bề mặt đáy giếng.

o Sau 24h nuôi cấy, thêm 20µl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng Mỗi nồng độ được lặp lại ở 3 giếng, lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc tan hoàn toàn trong môi trường

o Ủ đĩa nuôi cấy trong 48h cho thuốc phát huy tác dụng Sau đó, đĩa tế bào được cố định bằng cách nhỏ thêm 50µl dung dịch acid tricloacetic 50% vào mỗi giếng ở 40c trong thời gian 1h rồi rửa nhẹ bằng nước cất và hong khô (nhiệt độ phòng)

o Nhuộm SRB: Thêm 50µl SRB 0,4% vào mỗi giếng, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng

o Rửa thuốc nhuộm SRB dư thừa bằng acid acetic 1% 3 lần sau đó để khô ở nhiệt độ phòng

o Thôi thuốc nhuộm SRB trong mẫu bằng 100µl dung dịch triz –base 10mM/giếng, để thuốc nhuộm tan hết thì đem mẫu đo mật độ quang ở bước sóng 540nm

o % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng (tế bào không được xử ký bằng thuốc) được tính theo công thức sau:

Mẫu thử Nồng độ µg/ml

Tác dụng ức chế ( % )

A549 OVCAR-8 NCI-N87 MCF7-ADR

Mẫu 2: hợp chất 1

- Thử kết quả độc tính của mẫu 1 và mẫu 2

Ghi chú /: tế bào trong đĩa nuôi không bị ức chế

Nhận xét: cả 2 mẫu nghiên cứu đều có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư rõ rệt với 2 nồng độ cao nhất là 100 và 50 µg/ml với mẫu 1 20 và 10 µg/ml với mẫu 2

Tác dụng ức chế (IC50, ug/ml)"

A549 OVCAR-8 NCI- N87 MCF7- ADR MCF7- TamR

Nhận xét:

- Mẫu cao phân đoạn EtOAc từ dịch chiết nụ vối có tác dụng độc trên cả 5 dòng tế bào ung thư nghiên cứu với IC50 thấp nhất là 42.41 µg/ml trên dòng MCF7-tamR và IC50 cao nhất là 84,4 µg/ml trên dòng A549

- Mẫu hợp chất 1: có tác dụng độc trên cả 5 dòng tế bào ung thư nghiên cứu với IC50 thấp nhất là 10,95 µg/ml trên dòng tế bào MCF7-ADR và IC50 cao nhất là 20,11 µg/ml trên dòng A549

- Hợp chất 1(mẫu 2) phân lập được và mẫu cao phân đoạn EtOAc đều có tác dụng trên các dòng tế bào ung thư trong nghiên cứu, đặc biệt là tác dụng trên các dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc điều trị Adriamicinb

- So sáng với mẫu chứng dương Adriamicin ở dòng tế bào MCF7-ADR, IC50 của hợp chất 1 chỉ bằng một nửa, từ đó cho thấy tác dụng rõ rệt của hợp chất 1 trên dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc

Ảnh hưởng của mẫu thử lên sự phát triển tế bào ung thư

Ảnh minh hoạ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• [1] Nguyễn Tiến Bân (2000), Thực vật chí Việt Nam - Họ Na (Annonaceae), Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, tr 8, tr 316-321

• [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội,

• [3] Bộ y tế (2009), ung thư đại cương, Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội

• [4] Adeyemi, David Olawale, Komolafe, Omobola Aderibigbe, Adewole, Olarinde Stephen, Obuotor Efere Martins, Adenowo Thomas Kehinde

(2009), ―Anti hyperpglycemic activities of Annona muricata (Linn)‖, Afr J Trad., CAM 6 (1): 62 – 69

• [5] Anon., Purdue News September 1997; Purdue University, West Lafayette, IN http://www.purdue.edu/UNS/newsandphotos.html

• [6] Berlowski A., Katarzyna Zawada, Iwona Wawer, Katarzyna Paradowska (2013), ―Antioxidant Properties of Medicinal Plants from Peru―, Food and Nutrition Sciences, 4, 71-77

• [7]Almudena Bermejo, Bruno Figadère, Maria-Carmen Zafra-Polo, Isabel Barrachina, Ernesto Estornell and Diego Cortes (2005), “Acetogenins from Annonaceae: recent progress in isolation, synthesis and mechanisms of action‖, Nat Prod Rep., 22, 269-303

• [8] Nguyen Thi Dung,Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and

the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr and Perry buds”, Food and Chemical Toxicology

Xin chân thành cảm ơn !