Hướng dẫn thực hành vi sinh

Cùng với môn Vi sinh – Ký sinh, đây là một phần quan trọng trong toàn bộ khối kiến thức cơ sở ngành, giúp sinh viên có cơ hội thực hành về các quá trình, thao tác làm việc với vi sinh vậ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

VI SINH VẬT HỌC

Biên soạn:

Th.S Huỳnh Nguyễn Anh Khoa

Th.S Vũ Thị Phương Mai

www.hutech.edu.vn

THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC

Ấn bản 2018

Các ý kiến đóng góp về tài liệu học tập này, xin gửi về e-mail của ban biên tập: tailieuhoctap@hutech.edu.vn

Error! No text of specified style in document. I

MỤC LỤC

MỤC LỤC .I

HƯỚNG DẪN IV

BÀI 1: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH VI SINH 6

1.1 SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 6

1.1.1 Các bộ phận của kính hiển vi quang học 6

1.1.2 Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi 9

1.1.3 Nguyên tắc sử dụng và bảo quản kính hiển vi 10

1.1.4 Thao tác sử dụng kính hiển vi 10

1.2 KỸ THUẬT CẤY VÀ PHÂN LẬP 13

1.2.1 Cấy vi khuẩn 13

1.2.2 Phân lập vi khuẩn 13

1.2.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập 14

1.2.4 Kỹ thuật cấy và phân lập 15

1.3 KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG 18

1.3.1 Phương pháp nhiệt ẩm 18

1.3.2 Phương pháp nhiệt khô 19

1.3.3 Phương pháp Tyndall 19

1.3.4 Phương pháp lọc tiệt trùng 19

1.4 THỰC HÀNH 19

BÀI 2: NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN DỰA VÀO KHẢO SÁT HÌNH THÁIError! Bookmark not defined.

2.1 CÁC BƯỚC CHUNG ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN Error! Bookmark not defined.

2.2 LẤY MẪU Error! Bookmark not defined.

2.2.1 Nguồn cung cấp mẫu Error! Bookmark not defined.

2.2.2 Làm phong phú và phân lập Error! Bookmark not defined.

2.2.3 Giữ gốc và di chuyển Error! Bookmark not defined.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN Error! Bookmark not defined.

2.4 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM KHUẨN LẠC (ĐẠI THỂ) Error! Bookmark not defined.

2.4.1 Khảo sát trên môi trường đặc Error! Bookmark not defined.

2.4.2 Khảo sát trong môi trường lỏng Error! Bookmark not defined.

2.5 KHẢO SÁT TẾ BÀO VI KHUẨN (VI THỂ) Error! Bookmark not defined.

2.5.1 Khảo sát tính di động của vi khuẩn sống Error! Bookmark not defined.

2.5.2 Khảo sát hình dạng vi khuẩn sau khi nhuộm Error! Bookmark not defined.

2.6 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined.

BÀI 3: NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN DỰA VÀO KHẢO SÁT TÍNH CHẤT SINH HÓA, SINH LÝ

Error! Bookmark not defined.

3.1 CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA Error! Bookmark not defined.

3.1.1 Khảo sát khả năng dụng carbohydrate Error! Bookmark not defined.

Error! No text of specified style in document. II

3.1.2 Khảo sát khả năng sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh Error! Bookmark not defined.

3.1.3 Môi trường KIA (KLIGLER IRON AGAR) Error! Bookmark not defined.

3.1.4 Khảo sát cơ chế lên men đường Error! Bookmark not defined.

3.1.5 Khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất Error! Bookmark not defined.

3.1.6 Khảo sát khả năng sử dụng acid amin có nhân indol Error! Bookmark not defined.

3.1.7 Khảo sát khả năng sử dụng protein Error! Bookmark not defined.

3.1.8 Khảo sát khả năng sử dụng urea Error! Bookmark not defined.

3.1.9 Khảo sát sự hiện diện catalase Error! Bookmark not defined.

3.1.10 Phản ứng sinh hóa của một số vi khuẩn Error! Bookmark not defined.

3.2 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA YẾU TỐ LÝ-HÓA Error! Bookmark not defined.

3.2.1 Khảo sát các tác động vật lý Error! Bookmark not defined.

3.2.2 Tác động của các yếu tố hóa học Error! Bookmark not defined.

3.3 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined.

BÀI 4: KHẢO SÁT VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT Error! Bookmark not defined.

4.1 CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT Error! Bookmark not defined.

4.2 CÁCH TRÍCH LY BỆNH PHẨM Error! Bookmark not defined.

4.3 MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT Error! Bookmark not defined.

4.3.1 Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar-NA) Error! Bookmark not defined.

4.3.2 Môi trường phong phú Error! Bookmark not defined.

4.3.3 Môi trường phân biệt Error! Bookmark not defined.

4.3.4 Môi trường chọn lọc Error! Bookmark not defined.

4.4 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined.

4.4.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm Error! Bookmark not defined.

4.4.2 Nhận định vi khuẩn gây bệnh Error! Bookmark not defined.

4.4.3 Sơ đồ phân lập vi khuẩn gây bệnh đường ruột Error! Bookmark not defined.

BÀI 5: KHẢO SÁT VI KHUẨN GÂY BỆNH Ở CỔ HỌNG Error! Bookmark not defined.

5.1 ĐẠI CƯƠNG Error! Bookmark not defined.

5.2 MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT VÀ SỰ HUYẾT GIẢI Error! Bookmark not defined.

5.3 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM Error! Bookmark not defined.

5.3.1 Lấy bệnh phẩm Error! Bookmark not defined.

5.3.2 Tìm vi khuẩn gây bệnh ở cổ họng Error! Bookmark not defined.

5.4 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined.

BÀI 6: CÁC THỬ NGHIỆM VỀ KHÁNG SINH Error! Bookmark not defined.

6.1 CÁC KHÁI NIỆM Error! Bookmark not defined.

6.2 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU Error! Bookmark not defined.

6.2.1 Định nghĩa Error! Bookmark not defined.

6.2.2 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined.

6.2.3 Phương pháp Error! Bookmark not defined.

6.2.4 Tiến hành Error! Bookmark not defined.

Error! No text of specified style in document. III

6.3 KHÁNG SINH ĐỒ Error! Bookmark not defined.

6.3.1 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined.

6.3.2 Phương pháp khuếch tán Kirby – Bauer Error! Bookmark not defined.

6.3.3 Phối hợp kháng sinh Error! Bookmark not defined.

6.3.4 Hậu quả của sự phối hợp Error! Bookmark not defined.

6.3.5 Phương pháp thăm dò phối hợp kháng sinh – phương pháp khuếch tán trong môi trường rắn Error! Bookmark not defined.

6.4 BẢNG BIỆN GIẢI KHÁNG SINH ĐỒ Error! Bookmark not defined.

BÀI 7: ĐỊNH LƯỢNG MẬT ĐỘ VI SINH VẬT Error! Bookmark not defined.

7.1 ĐẠI CƯƠNG Error! Bookmark not defined.

7.2 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC Error! Bookmark not defined.

7.2.1 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined.

7.2.2 Cách thực hiện Error! Bookmark not defined.

7.3 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG TỚI HẠN Error! Bookmark not defined.

7.3.1 Nguyên tắc Error! Bookmark not defined.

7.3.2 Cách thực hiện Error! Bookmark not defined.

7.4 THỰC HÀNH Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined.

Error! No text of specified style in document. IV

HƯỚNG DẪN

MÔ TẢ MÔN HỌC

Giáo trình “Thực hành vi sinh vật học” dành cho sinh viên năm thứ nhất ngành Dược, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM Cùng với môn Vi sinh – Ký sinh, đây là một phần quan trọng trong toàn bộ khối kiến thức cơ sở ngành, giúp sinh viên có cơ hội thực hành

về các quá trình, thao tác làm việc với vi sinh vật, ứng dụng vào trong nghiên cứu hoặc kiểm nghiệm vi sinh Qua đó, giúp cho sinh viên hiểu sâu hơn về lý thuyết đã học

NỘI DUNG MÔN HỌC

Bài 1: Các kỹ thuật cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh

Bài 2: Nhận định vi khuẩn dựa vào khảo sát hình thái

Bài 3: Nhận định vi khuẩn dựa vào khảo sát tính chất sinh hóa, sinh lý

Bài 4: Khảo sát vi khuẩn gây bệnh đường ruột

Bài 5: Khảo sát vi khuẩn gây bệnh ở cổ họng

Bài 6: Các thử nghiệm về kháng sinh

Bài 7: Định lượng mật độ vi sinh vật

KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ

Môn học thực hành vi sinh vật học yêu cầu sinh viên đã học môn lý thuyết Vi sinh vật học, đã làm quen với cách sử dụng các dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm

YÊU CẦU MÔN HỌC

Người học phải dự học đầy đủ các buổi lên lớp và làm bài báo cáo thực hành

CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MÔN HỌC

Để học tốt môn này, người học cần đọc trước bài thực hành ở nhà để nắm kỹ phần

lý thuyết và thao tác thực hành Trong khi học, người học phải quan sát, ghi nhận và

mô tả các hiện tượng xảy ra khi tiến hành thí nghiệm Người học cần phải tập tính tỉ

Error! No text of specified style in document. V

mĩ, chu đáo và có khả năng dự trù trước những diễn biến có thể xảy ra đối với mẫu vi sinh vật, cũng như để chuẩn bị cho các thí nghiệm được tiến hành một cách suôn sẻ

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC

Hình thức và nội dung đánh giá môn học do bộ môn quyết định, phù hợp với quy chế đào tạo và tình hình thực tế tại nơi tổ chức học tập

YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN

Để làm thí nghiệm được tốt, sinh viên phải chuẩn bị bài ở nhà: tính toán các số liệu cần thiết khi làm bài thí nghiệm, xem lại phần lý thuyết và các tài liệu tham khảo có liên quan, sắp xếp một cách khoa học kế hoạch tiến hành các thí nghiệm trong mỗi buổi thực hành

Khi làm việc trong phòng thí nghiệm phải tuân thủ nghiêm nội quy phòng thí nghiệm Tuyệt đối không ăn, uống trong phòng thí nghiệm Hạn chế đeo trang sức (đồng hồ, vòng đeo tay…) vì phải thường xuyên sát trùng tay bằng cồn

Trong quá trình làm việc, nếu bị thương thì phải nhanh chóng sát trùng vết thương

và băng bó cẩn thận trước khi tiếp xúc trở lại với vi sinh vật nhằm tránh nhiễm trùng Khi thí nghiệm xong, dọn dẹp các dụng cụ, mẫu vật và xử lý theo đúng quy trình được hướng dẫn Các mẫu có chứa vi sinh vật còn sống phải được hấp bỏ theo đúng quy trình trước khi rửa

Rửa sạch tay bằng xà phòng trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm

Error! No text of specified style in document. VI

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG

THỰC HÀNH VI SINH

Sau khi học xong bài này, sinh viên có thể:

- Biết sử dụng kính hiển vi cho các mục đích khác nhau

- Biết cách chuẩn bị dụng cụ để thực hành vi sinh

Tiến hành được kỹ thuật cấy và phân lập

- Trình bày được nguyên tắc, cách vận hành thiết bị và phạm vi áp dụng của

một số phương pháp tiệt trùng hay dùng

SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

Sử dụng kính hiển vi để:

Khảo sát sự di động của vi khuẩn

Quan sát hình dạng, cách sắp xếp, kích thước của tế bào vi khuẩn

Quan sát các bộ phận của tế bào vi khuẩn: màng, tiêm mao, bào tử…

Các bộ phận của kính hiển vi quang học

1 Phần quang học

a Bộ phận chiếu sáng

Nguồn sáng: Các kính hiển vi quang học hiện đại có nguồn sáng là đèn Halogen hoặc đèn LED Các kính hiển vi loại cũ không có đèn chiếu sáng riêng nên được trang bị 1 gương lấy sáng để đưa nguồn sáng bên ngoài cung cấp cho kính

Error! No text of specified style in document. VII

Tụ quang: Tụ quang là một hệ thấu kính có nhiệm vụ hội tụ các tia sáng từ nguồn sáng vào vị trí tiêu bản cần quan sát Trong tụ quang có 1 màn chắn sáng có thể điều chỉnh mức độ đóng/mở để điều chỉnh lượng ánh sáng chiếu vào tiêu bản

b Vật kính

Vật kính là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi Vật kính được cấu tạo

từ 1 hệ thấu kính, trong đó thấu kính ngoài cùng là quan trọng nhất, quyết định

độ phóng đại của kính, các thấu kính còn lại có nhiệm vụ loại trừ các quang sai giúp cho hình ảnh quan sát được rõ nét Độ phóng đại của vật kính luôn được ghi trên thân của vật kính (Ví dụ: 40X nghĩa là độ phóng đại 40 lần)

Một kính hiển vi quang học thông thường thường có 4 vật kính:

Vật kính 4X, 10X: thường dùng để quan sát tổng thể và định vị vị trí quan sát

Vật kính 40X: thường dùng để quan sát hình dạng vi khuẩn, quan sát sự di động của vi khuẩn

Vật kính 100X: thường dùng để quan sát các bộ phận của tế bào vi khuẩn Để hình ảnh quan sát được rõ, khi sử dụng, vật kính 100X phải được nhúng chìm trong dầu cèdre Dầu cèdre có chiết suất lớn hơn so với không khí, có tác dụng hạn chế các tia sáng bị lạc hướng ra khỏi vật kính

c Thị kính

Thị kính cũng là một hệ thống thấu kính giúp phóng đại một lần nữa các hình ảnh do vật kính cung cấp Thị kính thường có độ phóng đại 5X, 10X, 20X Độ phóng đại cũng được ghi trên thân thị kính Ngoài ra, thị kính còn giúp điều chỉnh tiêu cự phù hợp với những người có tật khúc xạ ở mắt (cận thị, viễn thị)

2 Phần cơ học

Gồm có: Thân kính, đế kính, bàn kính và các ốc điều chỉnh

a Thân kính

Error! No text of specified style in document.

VII I

Thân kính mang toàn bộ hệ thống quang học của kính, cũng là bộ phận giúp cầm nắm khi di chuyển kính Trên thân kính còn có bàn xoay để lắp vật kính, có

vị trí lắp thị kính, vị trí gắn bàn kính và các ốc điều chỉnh

b Bàn kính

Bàn kính là nơi đặt vật cần quan sát Trên bàn kính có bộ phận kẹp giữ tiêu bản Bàn kính có thể di chuyển lên - xuống, qua trái – qua phải và tới – lui để đưa vật vào đúng vị trí quan sát

Ốc điều chỉnh vị trí tụ quang: thường được gắn liền với tụ quang, giúp nâng hoặc

hạ cao độ của tụ quang

Ốc bảo vệ: Gồm có ốc bảo vệ vật kính (giúp giới hạn cao độ của bàn kính để ngăn cản bàn kính làm hỏng vật kính) và ốc bảo vệ thị kính (cố định vị trí thị kính, giúp thị kính không bị xoay khi quan sát)

Error! No text of specified style in document. IX

Các bộ phận của kính hiển vi

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi

Thực chất, kính hiển vi là một hệ thấu kính giúp phóng đại vật quan sát

Độ phóng đại của kính hiển vi là tích số độ phóng đại của vật kính và độ phóng đại của thị kính

Độ rõ nét của ảnh quan sát được quyết định bởi năng suất phân ly Kính có năng suất phân ly càng lớn sẽ phân biệt được 2 điểm có khoảng cách càng gần

Error! No text of specified style in document. X

Nguyên tắc sử dụng và bảo quản kính hiển vi

Cầm và di chuyển kính bằng hai tay Chú ý cầm gọn dây nguồn cấp điện, không

để vướng vật khác khi di chuyển

Đặt kính trên mặt phẳng tĩnh, không bị rung động, không để kính bị ngã

Chú ý không để gần kính các vật dễ gây hư tổn kính như: đèn cồn, hóa chất có tính ăn mòn cao…

Tối thiểu hóa thời gian bật đèn nguồn (tắt đèn nguồn khi không sử dụng)

Chỉnh cao độ bàn kính về mức thấp nhất khi đặt vào hoặc lấy tiêu bản ra khỏi bàn kính (tránh va chạm với vật kính)

Phải luôn thận trọng khi điều chỉnh ốc sơ cấp khi sử dụng vật kính 40X và 100X, không để tiêu bản chạm vào làm hỏng vật kính Khi chuyển từ vật kính 40X sang vật kính 100X, chỉ được chỉnh ốc vi cấp, không được chỉnh ốc sơ cấp

Chỉ dùng vải chuyên dụng để lau vật kính và thị kính (Sinh viên không tự ý lau vật kính và thị kính)

Thao tác sử dụng kính hiển vi

a Sử dụng vật kính X4 hoặc X10

Thực hiện từng bước theo thứ tự sau:

Cắm điện, kiểm tra nguồn sáng

Hạ bàn kính về cao độ thấp nhất

Xoay mâm gắn vật kính về vị trí vật kính 4X hoặc 10X

Đặt tiêu bản vào bàn kính, điều chỉnh kẹp tiêu bản cho chắc chắn

Nhìn vào tiêu bản và điều chỉnh vị trí bàn kính sao cho đốm sáng chiếu vào vị trí

có mẫu vật

Error! No text of specified style in document. XI

Nhìn vào thị kính, điều chỉnh khoảng cách hai ống thị kính sao cho 2 thị trường nhập lại với nhau Chú ý: phải nhìn bằng cả 2 mắt

Vừa nhìn vào thị kính, vừa xoay ốc sơ cấp để điều chỉnh cao độ bàn kính đến khi thị trường thoáng xuất hiện ảnh của mẫu vật thì dừng lại

Điều chỉnh ốc vi cấp để thấy được rõ nét ảnh của mẫu vật

Sau khi quan sát xong, hạ bàn kính xuống vị trí thấp nhất, lấy mẫu vật ra Nếu không còn sử dụng nữa thì tắt nguồn sáng

b Sử dụng vật kính X40

Thực hiện từng bước theo thứ tự sau:

Thực hiện các thao tác để thấy được ảnh rõ nét dưới vật kính 10X

Giữ nguyên vị trí bàn kính, xoay mâm gắn vật kính về vị trí vật kính 40X

Vừa nhìn vào thị kính, dùng 2 tay xoay từ từ ống sơ cấp (xoay từng nấc) sao cho thoáng thấy ảnh của mẫu vật Chú ý: Lúc này bàn kính đã ở rất sát vật kính, nếu không cẩn thận có thể làm cho tiêu bản cấn vào vật kính, làm bể tiêu bản

Thực hiện từng bước theo thứ tự sau:

Thực hiện các thao tác để thấy được ảnh rõ nét dưới vật kính 40X

Giữ nguyên vị trí bàn kính, xoay mâm gắn vật kính đến vị trí giữa vật kính 40X

và vật kính 100X (lúc này phía trên mẫu vật là 1 khoảng trống)

Nhỏ 1 giọt dầu cèdre lên phía trên mẫu vật