SẢN XUẤT NƯỚC MẮM TỪ CÁ NƯỚC NGỌT

Quá trình hình thành nước mắm làquá trình phức tạp gồm quá trình đạm hóa, quá trình phân giải đường trong cáthành acid, quá trình phân hủy một phần amino acid dưới tác dụng của vikhuẩn c

-TRẦN THỊ THU HẰNG

SẢN XUẤT NƯỚC MẮM TỪ CÁ NƯỚC NGỌT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành: Sư phạm Hóa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-cám ơn đến Ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, Lãnh đạo khoa Khoahọc tự nhiên, các thầy giáo, cô giáo trong khoa đã giúp em trang bị kiến thức

và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiệnkhóa luận

Đặc biệt em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo, ThS PhạmThị Thanh Huyền – người đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em từng bướctrong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự quantâm, động viên, hỗ trợ về cả vật chất lẫn tinh thần của gia đình, bạn bè Quađây, em cũng gửi lời cảm ơn đến tất cả những tấm lòng và sự giúp đỡ đángquý ấy

Em xin chân thành cám ơn!

Phú Thọ, ngày 10 tháng 05 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thu Hằng

Lời cảm ơn………ii

Mục lục……… .……….iii

Danh mục bảng………iv

Danh mục biểu đồ……….v

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1

1.3 Mục tiêu của đề tài 2

PHẦN II PHẦN NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Nước mắm 3

1.2 Tổng quan về enzyme bromelain 14

1.3 Tổng quan về hương và cải thiện hương nước mắm ngắn ngày 17

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp cảm quan 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1.Tỉ lệ phối trộn nước dứa xay trong các mẫu cá 34

3.2 Xác định các chỉ tiêu hóa lý của nước mắm 36

3.3 Đánh giá sự phân hủy của mẫu số 4 qua các chỉ tiêu hóa - lý 38

3.4 Quy trình sản xuất nước mắm từ cá mương 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 45

Bảng 1.1 Tên các loại nước mắm và tỉ lệ trộn tạo sản phẩm ở các

nước khác nhau

3

Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl–L–Arginine amide (BAA)

của bromelain

16

Bảng 2.1 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan bằng phương pháp

cho điểm theo TCVN 3215 – 79

Bảng 3.4 Các chỉ tiêu hóa học và chất lượng nước mắm đạt được

theo TCVN 5107: 2003

37

STT Tên biểu đồ Trang

Hình 3.1 Biểu đồ đánh giá điểm cảm quan các mẫu nước mắm sau 9 tháng kiểm chứng 35

Hình 3.3 Kết quả phân tích hàm lượng nitơ acid amin 39

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Giới thiệu một số hình ảnh về cấu tạo của dứa 15

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Nước mắm là sản phẩm được lên men từ các loại cá, là sản phẩmtruyền thống của dân tộc Việt Nam Nước mắm được chế biến theo phươngpháp cổ truyền ở Việt Nam có mùi vị thơm đặc trưng, tuy nhiên có nhượcđiểm độ đạm không cao, chu kỳ sản xuất quá dài (từ 1 đến 2 năm hoặc có thểlâu hơn), năng xuất không cao, giá thành sản phẩm không cao vì vậy khôngkinh tế

Tuy nhiên nhờ sự phát triển của công nghệ vi sinh mà quy trình sảnxuất nước mắm đã được rút ngắn Ở Việt Nam có nhiều loại nước mắm đi từcác loại cá khác nhau được sản xuất tại nhiều nơi trong nước như nước mắmPhan Thiết, nước mắm Phú Quốc, nước mắm Nha Trang, nước mắm Cát Hải,quy trình sản xuất cũng không hoàn toàn giống nhau đã tạo nên đặc trưng vềhương vị cho từng loại nước mắm, đa dạng hóa về sản phẩm nhằm đáp ứngnhu cầu người tiêu dùng

Tuy nhiên chưa có đề tài khoa học nghiên cứu sản xuất nước mắm từ cánước ngọt Do đó tôi lựa chọn đề tài : ‘‘Sản xuất nước mắm từ cá nước ngọt’’

1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.2.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp các thông tin khoa học về sản xuất nước mắm từ cá nước ngọt

có sử dụng enzyme nhằm rút ngắn thời gian trong quy trình sản xuất

1.3 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng được quy trình sản xuất nước mắm từ cá mương

Sản xuất nước mắm từ cá nước ngọt có bổ sung enzyme bromelain cótrong dứa nhằm rút ngắn thời gian lên men

Thu hồi được 4 lít nước mắm

PHẦN II PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Nước mắm

1.1.1 Tổng quan về nước mắm

Nước mắm là một sản phẩm do thịt cá ngâm dầm trong nước muốimặn, phân giải từ protein phức tạp đến protein đơn giản và cuối cùng là cácacid amin nhờ tác dụng của enzyme có sẵn trong thịt và hệ tiêu hóa của cá,làm cho nước mắm có mùi vị đặc trưng Quá trình hình thành nước mắm làquá trình phức tạp gồm quá trình đạm hóa, quá trình phân giải đường trong cáthành acid, quá trình phân hủy một phần amino acid dưới tác dụng của vikhuẩn có hại, tiếp tục phân hủy thành các hợp chất đơn giản như amin,amoniac, cacbonic hyđrosunfua Nước mắm được sản xuất từ cá và muốikhông chỉ được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam mà còn được ưu chuộng tạinhiều nước trên thế giới Đặc biệt, nước mắm được sản xuất ở hầu hết cácnước Châu Á Mỗi nước có điều kiện sản xuất khác nhau tạo ra sản phẩm cógiá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau mang hương vị riêng đặctrưng cho từng quốc gia, dân tộc [1]

Bảng 1.1: Tên các loại nước mắm và tỉ lệ trộn tạo sản phẩm ở các nước khác nhau:

Việt Nam

Nước mắm Tỷ lệ 3 : 1 – 3 : 2 = Cá : Muối (4 – 12

tháng)Thái Lan Nam – pla Tỷ lệ 5 : 1 = Cá : Muối (5 – 12 tháng)

me (3 – 12 tháng)Philippine Patis 3 :1 – 4 : 1 = Cá : Muối (3 – 12

1.1.2 Tổng quan về giá trị dinh dưỡng

Nước mắm hấp dẫn mọi người bởi hương vị đậm đà và giá trị dinhdưỡng cao (chứa 13 loại acid amin, vitamin B)

- Đạm amin: là tổng lượng đạm hữu ích nằm dưới dạng acid amin (g/l), quyếtđịng giá trị dinh dưỡng của nước mắm

- Đạm ammoniac: càng nhiều nước mắm càng kém chất lượng

Ngoài ra, trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là cácacid amin không thay thế: valin, leucine, methionine, isoleucine,

phenylalanine, alanine… tuy nhiên thành phần, hàm lượng, tỷ lệ các chất dinhdưỡng của nước mắm còn phụ thuộc vào nguyên liệu cũng như quá trình chếbiến

Các chất bay hơi.

Đóng góp chính vào việc hình thành nên hương vị đặc trưng của nướcmắm là các chất bay hơi, hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắmmg/100g nước mắm như sau:

- Các chất cacbonyl bay hơi: 407 – 512 (formaldehyde)

- Các acid bay hơi: 404 – 533 (propionic)

- Các amin bay hơi: 9,5 – 11,3 (izopropylamin)

- Các chất trung tính bay hơi : 5,1 – 13,2 (acetaldehyde)

Các chất khác

- Các chất vô cơ : NaCl chiếm 250 – 280 g/l và một số chất khoáng như :

Nước mắm chủ yếu được sản xuất từ các loại cá biển nhỏ như : cá nục, cátráp, cá liệt, cá tạp… là những loại cá có giá trị kinh tế thấp Tuy nhiên việc sửdụng loại cá gì cho sản xuất còn phụ thuộc vào từng khu vực, từng mùa vụkhác nhau Những cơ sở sản xuất có nguồn nguyên liệu truyền thống là cácơm cho hương vị thơm ngon hơn, còn các cơ sở sản xuất Nước mắm đa sốsản xuất từ nguyên liệu cá tạp thì nước mắm thành phần có hương vị kém đặctrưng, do đó phải kéo rút qua chượp gây hương để bổ sung hương vị Sở dĩnước mắm được làm từ cá cơm cho hương vị thơm ngon hơn cả là do một sốnguyên nhân sau :

- Cá cơm là loài cá ăn nổi, hoạt động mạnh nên thành phần của cá ít mỡ.Trong sản xuất không tạo lớp máng mỡ dày do đó mùi vị ôi khét ít xảy ra

- Cá cơm nói riêng và các tầng nổi nói chung có hoạt tính enzyme proteasetrong thịt và ruột cá cao hơn các loại cá khác nên quá trình thủy phân xảy ranhanh hơn Vì vậy, cùng một thời gian sản xuất (6-12 tháng) thì ở các bềchượp có nguyên liệu là cá cơm, việc thủy phân diễn ra triệt để hơn khôngcòn mùi vị tanh ngái của cá

- Cá cơm có kích thước nhỏ hơn các loại cá khác nên dễ thủy phân

Vì cá là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất ra nước mắm nên ảnhhưởng trực tiếp tới chất lượng nước mắm, do đó khi lựa chọn cá làm nướcmắm, cần phải đạt các yêu cầu sau :

- Nên sử dụng loại cá gầy có hàm lượng lipit thấp (nên < 0.1%)

- Nên sử dụng các loại cá có kích thước nhỏ vì như vậy sẽ không tốn côngtrong việc xử lí nguyên liệu, đông thời kích thước nhỏ diện tích bề mặt tiếpxúc giữa muối sẽ tăng lên làm cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh chóng

- Không sử dụng các loại cá có chứa tỉ lệ cơ thịt đỏ cao như cá ngừ, cá thu,

cá sòng… Vì trong thành phần của cơ thịt đỏ có chứa nhiều acidamin histidin,đây là tiền chất của amin histamin, một amin có khả năng gây ngộ độc cao.Hàm lượng histamin > 20mg/100g thì gây ngộ độc, hàm lượng nhỏ hơn thìgây đau đầu chóng mặt, nếu bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 5oC thì chỉ mộtlượng ít histamin được hình thành, nhưng nếu trong điều kiện nhiệt độ 15-

20oC thì một lượng lớn histamin được tạo thành Trong quá trình thủy phânptotein thịt cá, có một số loài vi sinh vật cũng có khả năng chuyển hóahistidin thành histamin

Muối :

Muối là nguyên liệu quan trọng thứ 2 sau cá, nếu không có muối thì cũngkhông tạo thành nước mắm, do đó nguyên liệu muối cũng được lựa chọn phùhợp Muối có rất nhiều loại, dựa vào nguồn gốc có thể chia ra các loại : Muối

mỏ, muối biển, muối giếng Do đặc điểm nước ta có bờ biển dài, khí hậu nhiệtđới gió mùa nên muối được sản xuất từ biển là phương pháp phổ biến nhất vàthu được năng suất cao Thành phần hóa học của muối sẽ ảnh hưởng tới chấtlượng mùi vị nước mắm

Thành phần của muối ăn :

Thành phần của muối chủ yếu NaCl, ngoài ra ít nhiều còn có tạp chất.Những tạp chất này có thể chia ra làm 2 loại :

- Những chất không có hoạt tính hóa học như nước và các chất không hòatan như sỏi, cát,…

- Những chất có hoạt tính hóa học như : hợp chất Clor của Ca2+, Mg2+,

Fe2+, Fe3+, và muối có gốc sunfat,… các chất này có vị đắng và chát, chúnglàm giảm độ thẩm thấu của muối vào cá

Muối ăn tinh khiết là chất kết tinh, không màu Khối lượng riêng d =2,161, điểm nóng chảy 803 oC, điểm sôi 1439oC

Vị chát của muối là do trong muối có MgCl2, CaCl2 Trong muối thườngtồn tại K+, nếu ăn phải lượng ít thì bị đau cuống họng, nếu ăn phải lượngnhiều thì gây đau đầu, nôn mửa

Tính chất của muối ăn

sử dụng sẽ hạn chế vị chát, đắng và nóng cổ do các ion này gây nên Ngoài ralượng nước trong muối còn phụ thuộc vào độ to nhỏ của hạt, hạt muối to cóhàm lượng nước ít hơn hạt muối có tinh thể nhỏ

Muối ăn ít có tác dụng giết chết vi khuẩn, nó chủ yếu chỉ có khả năng phòngthối [1]

- Tính thẩm thấu và khuyếch tán:

Do tính chất hút nước của muối nên khi ướt cá với muối, nước ở trong cáthoáng ra làm tan muối (đây được gọi là quá trình khuyếch tán), song songvới đó là quá trình thẩm thấu (muối thấm vào cá) Sau cùng nước từ cá không

thoát ra nữa nhưng muối trong dung dịch muối cá (nước bổi) vẫn tiếp tụcngấm vào cơ thể cá cho đến khi bão hòa muối Độ bão hòa muối ở cá thườngthấp hơn trong nước bổi.

Cá càng tươi thì độ thấm muối càng nhanh và nhiều so với cá bị ươn

Vai trò của muối trong quá trình chế biến nước mắm:

Nồng độ muối dùng để ướp cá trong quá trình chế biến ảnh hưởng lớnđến chất lượng sản phẩm thu được

- Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân proteinnhanh hơn, chượp mau chín

- Nồng độ muối quá cao có tác dụng ức chế, làm giảm hoạt tính củaenzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài

Vì vậy, để chế biến chượp nhanh cần xác định lượng muối cho vào trongchượp là bao nhiêu và lượng muối này vừa đủ ức chế sự phát triển của vikhuẩn gây thối, vừa kìm hãm hoạt động của enzyme Thông thường ở nước ta,lượng muối cho vào khoảng 20 – 30 % so với khối lượng cá Vì thế, tôi lựachọn tỷ lệ muối và cá sao cho kết quả đạt được là cao nhất

Enzyme:

Enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành nước mắm Nhờ

hệ enzyme có sắn do hệ vi sinh vật sống trong ruột cá, các protide của cáđược thủy phân thành acid amin, peptide Việc bổ sung enzyme từ ngoài vàogiúp đẩy nhanh quá trình thủy phân protein cá Enzyme sử dụng trong sảnxuất nước mắm đều có tác dụng thủy phân protein Tuy nhiên, mỗi loạienzyme tách chiết từ các nguồn khác nhau có hoạt tính thủy phân (phân cắt)protein khác nhau, điều kiện phản ứng khác nhau (pH tối ưu, nhiệt độ tốiưu…), tính chịu mặn khác nhau,… Mặc khác, mối loại cá có hàm lượngprotein, lipit, nước… khác nhau do vậy, tác dụng của từng enzyme lên quátrình thủy phân protein từng loại cá là khác nhau, thời gian thủy phân khácnhau, lượng acid amin thu được cũng khác nhau, điều này ảnh hưởng đến thờigian sản xuất và chất lượng nước mắm thành phẩm thu được

1.1.4 Quá trình hình thành nước mắm

Cơ chế của quá trình hình thành nước mắm

Trong quá trình ướp muối cá, các thành phần của muối cá bị biến đổi

mà chủ yếu là protein bị thủy phân dưới tác dụng của protease có sẵn trongbản thân cá thành các sản phẩm trung gian và cuối cùng là các acid amin Protease E E

Protein polipetide peptide acid amin

Và quá trình này là một quá trình phức tạp Vì tính đặc hiệu củaenzyme chỉ tác dụng lên một vài chất đặc hiệu nào đó và một vài kiểu lên kếtnhất định

- Nhóm protease có tác dụng thủy phân protein, ví dụ : pepsin, trypsin,chimotrypsin, papain, bromelin

- Nhóm peptitdase có tác dụng thủy phân các polypeptide, nhóm nàygồm các enzyme như carboxypeptitdase, aminopeptitdase, dipeptitdase

Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác

Sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES qua 3 bước

Bước 1: Ezyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme

protein, bước này xảy ra khá nhanh, liên tiếp, không bền

Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm

phá vỡ các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng Khi đó phức chất

ES đồng thời xảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thanh đổi electron, dẫnđến cực hóa các mối liên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng mối hìnhhọc của nối liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng như trong trungtâm hoạt động của enzyme, làm cho quá trình thủy phân diễn ra dễ dàng hơn

Bước 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin, peptide cấp thấp, giải

phóng enzyme [6]

Các hệ enzyme tham gia vào quá trình

Trong quá trình chế biến nước mắm có rất nhiều hệ enzyme tham gianhưng trong đó chủ yếu là hệ enzyme protease tham gia vào quá trình thủyphân protein, gồm có: metaloprptease và serin – protease, acid protease.

Hệ enzyme Metalo – protease (Aminnodipeptidase)

Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng cá và chịu nồng độ muối cao nênngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng 3 trở về sau Loạiezyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với cácloại pepide Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích từ 5 – 7,

ổn định với ion Mg2+, Ca2+ và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+…

Hệ enzyme serin – protease

Tồn tại nhiều trong nội tạng của cá, điển hình là enzyme trypsin Ở giaiđoạn đầu của quá trình sản xuất nước mắm, hoạt động của nó yếu, sau pháttriển dần và đạt giá trị cực đại ở tháng từ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín(protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng pepton) Hệ enzymenày luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme Để tháo gỡchuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng

độ muối cao Vì vậy, để men cathepsin B hoạt động được người ta thực hiệnphương pháp cho muối nhiều lần Enzyme serin – protease hoạt động mạnh ở

pH từ 5 – 10, mạnh nhất ở pH = 9

Hệ enzyme acid – protease:

Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D Hệenzyme này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉtồn tại một thời gian ngắn ở thời kỳ đầu của quá trình thủy phân Loại enzymenày đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm

Vai trò của vi sinh vật (VSV).

VSV có mặt ngay từ đầu của quá trình chế biến nước mắm do nguyênliệu, dụng cụ và môi trường nhiễm vào, nhưng do nồng độ muối cao nênchúng không hoạt động được Ngay trong giai đoạn ngắn đầu tiên khi muốichưa kịp tác dụng, có một số ít VSV gây thối hoạt động Với sự hình thànhcủa nước bồi, độ mặn tăng dần lên, khi đạt từ 12% trở lên thì VSV gây thốihầu như nhừng hoạt động và các vi khuẩn hầu như cũng bị ức chế Như vậy,trong quá trình chế biến nước mắm sự tham gia của VSV trong quá trình thủyphân tương đối yếu, nhưng về sự hình thành mùi vị của nước mắm trong quátrình chế biến thì vi khuẩn gây hương đã tham gia khá tích cực [5]

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước mắm

pH:

Mỗi hệ enzyme có pH tối thích khác nhau, vì vậy phải xem loại enzymenào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nướcmắm để tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động Qua thực nghiệm chothấy: Ở pH môi trường tự nhiên từ 5,5 – 6,5, enzyme tripsin và pepsin hoạtđộng được Vì vậy, pH môi trường tự nhiên là pH thích hợp cho quá trình sảnxuất nước mắm hơn Mặt khác, enzyme được lựa chọn trong đề tài có vùng

pH tối ưu tương đương Chính vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu không xétđến yếu tố này

Nhiệt độ:

Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó vận tốcphản ứng sẽ không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệenzyme serin – protease mất hoạt tính, quá trình thủy phân kém

- Nhiệt độ 30 – 47oC thích hợp nhất cho quá trình chế biến chượp

- Nhiệt độ từ 47oC đến 70oC, một số enzyme bị giảm hoạt tính

- Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các enzyme trong cá mất hoạt tính

Nâng nhiệt độ của chượp lên bằng cách phơi nắng, nấu hoặc sử dụng tônnóng để che [1]

Lượng muối:

Như đã cập nhật ở trên, nồng độ muối tối thiểu để ngăn cản sự phát triểncủa các vi khuẩn có hại là khoảng 15% Protease trong cá đóng một vai tròquan trọng trong quá trình thủy phân protein Tuy nhiên, ở nồng độ muối caohoạt tính của protease bị giảm Như vậy, lượng muối cho vào phải đảm bảo 2yêu cầu cơ bản (vừa đủ ức chế hoạt động của vi khuẩn gây thối, vừa tranh kìmhãm hoạt động của protease) Vì thế, ở các nước khác nhau có một phươngpháp sản xuất nước mắm khác nhau, tỷ lệ muối/ cá cũng khác nhau [6]

Tại bang California – Mỹ, S TungKaWachara and J W Park năm 2001 đãnghiên cứu ảnh hưởng thương tác của muối và pH lên hoạt động của enzymetrong nước mắm Hai ông sử dụng loại cá đáy để làm nước mắm ở nồng độmuối 15% và 25% tại các pH khác nhau (2, 3, 5, 5.5, 6.5, 7.5, and 8.5), hoạttính của enzyme (cathepsin L, cathepsin B, chymotrypsin, and trypsin), mức

độ thủy phân, protein tổng số, protein hòa tan và hàm lượng Nitơ amin trongnước mắm được các ông theo dõi, phân tích Kết quả cho thấy hoạt tính củaenzyme cathepsin B và trypsin lớn hơn ở nồng độ muối 15% Hoạt tính củaenzyme cathepsin L cũng cao hơn khi nồng độ muối là 15% so với 25% tại

pH 5.5, 6.5 và 8.5 Nồng độ protein hòa tan và Nitơ amin cũng tăng dần khinồng độ muối giảm và tăng theo thời gian lên men [5]

Tại Thái Lan, năm 2001, Asbjorn Gildberg và Chaufah Thongthai đãnghiên cứu ảnh hưởng của việc giảm nồng độ muối và bổ sung vi khuẩn ưu

muối (Tetragenococcus halophilus) đến chất lượng và thành phần của nước

mắm cá Trích Hai ông tiến hành làm 6 mẫu nước mắm ở 2 nồng độ muối

khác nhau (23 và 20%) Những ảnh hưởng từ các nồng độ muối khác nhau và

sự bổ sung vi khuẩn Tetragenococcus halophilus lên quá trình thủy phân,

thành phần hóa học và giá trị cảm quan đều được nghiên cứu Kết quả, cả quátrình thủy phân và hoạt tính của vi sinh vật đạt cao nhất ở nồng độ muối thấpnhất [5]

Diện tích tiếp xúc

Muốn phản ứng xảy ra nhanh phải có diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơchất Các enzyme trong cá tập trung nhiều ở nội tạng, nên để tăng tốc độ thủyphân người ta tìm cách tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và thịt cá Có thểdùng biện pháp:

- Phương pháp đập dập: Cá đập dập sẽ giữ hình dạng ban đầu, cơ thịt bêntrong bị mềm ra, tổ chức cơ thịt bị lỏng lẻo giúp enzyme dễ ngấm vào trongthịt Cá đập dập xương cá không bị vỡ vụn, khi chượp chín kéo rút dễ dàng

- Phương pháp cắt khúc: Thịt cá vẫn chắc nên enzyme khó ngấm vào hơn sovới phương pháp đập dập, protein ở mặt ngoài dễ bị biến tính do tiếp xúc vớidung dịch có nồng độ muối cao

Bản thân nguyên liệu

Những loại cá khác nhau, thành phần hóa học và cấu trúc cũng khác nhau,nhất là loại enzyme trong cá vì vậy tạo ra nước mắm có chất lượng khác nhau

- Cá tươi chế biến có chất lượng tốt hơn cá ươn

- Loại cá có kết cấu cơ thịt lỏng lẻo, mềm mại, ít vảy dễ chế biến hơn loại cácứng, chắc, nhiều vẩy

- Nếu cá có nhiều mỡ thì nước mắm có mùi ôi khét khó chịu, mùi chua (do sựthủy phân chất béo thành acid béo và glycerid) hoặc khét do oxi hóa chất béo

- Cá sống ở tầng nước mặt và giữa như cá thu, cá nục, cá mòi… cho chấtlượng nước mắm tốt nhất vì nó ăn được thức ăn ngon nên dinh dưỡng vàthành phần đạm cao

- Cá sống ở tầng dưới và tầng đáy như cá phèn, cá mối cho nước mắm có chấtlượng kém vì thiếu thức ăn (ăn rong, rêu, bùn hoặc thực vật dưới đáy) làm chothịt cá thiếu dinh dưỡng và bụng cá có bùn đất ảnh hưởng đến màu sắc củachượp

1.2 Tổng quan về enzyme bromelain

Enzyme bromelain là protein- enzyme có nhiều trong quả dứa, được

phát hiện từ giữa thế kỷ XX Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu

từ những năm 1968- 1970

Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm Sulfurhyđryl thủyphân protein Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm Sulthyđrylcủa bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro.[4]

Bromelain là một loại enzyme có trong toàn bộ cây dứa (thân, quả,lá…) nhưng tập chung nhiều nhất trong lõi quả dứa Bromelain là một loạienzyme thuộc nhóm protease, nó dễ dành thủy phân hầu hết các loại protinnhư casein, galatin, đậu nành, cá… để tạo thành các peptide, poli peptide vàcác acid amin Bromelain không giống như loại enzyme khác, nó hoạt độngrất rộng rãi cả trong môi trường acid lẫn kiềm.[4]

Hình 1.1: Giới thiệu một số hình ảnh về cấu tạo của dứa

- Tên gọi khác: Thơm, khóm.

- Tên tiếng Anh: Pineapple

- Tên khoa học: Ananas comosus (L.) Merr

- Tên đồng nghĩa: Ananas sativus

Hình 1.2: Tỷ lệ enzyme bromelain có trong dứa

1.2.1 Cấu trúc không gian của Enzyme bromelain

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấycách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:

─ Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp ─

─ Gly – Cys – Lys ─

Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và haisợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối – S – S - Phân tử có dạng hìnhcầu do đó có cách sắp xếp phức tạp

Trong phân tử bromrlain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủyếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite

Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấutrúc không gian.

1.2.3 Hoạt tính của bromelain

Hoạt tính phân giải

Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và asterase, hoạt tínhesterase ở bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ sung

Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain

Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain.

Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg)

Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín

Đối với casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao trong quảxanh và quả chín

Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain

Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl–L–Arginine amide (BAA) của bromelain.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain.

Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain có bị ảnh hưởng bởicác yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất , nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ionkim loại, một số nhóm chức, phương pháp lý trích, phương pháp tinh sạch,phương pháp tinh khiết

Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho các hoạt động của các phảnứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụthuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độenzyme, sự có mặt của các chất hoạt hóa…

Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính

xúc tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tùy thuộcvào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạchenzyme… Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng xúc tác nhân kết tủa

là (NH4)2SO4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4,8, ổn định ở pH = 4,6– 5,4 Bromelain đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6,0

và pH = 8 Ổn định ở pH = 3,5 – 5,6 với nhiệt độ 63oC Bromelain có biên độ

pH rộng (3 – 10), tốt nhất pH = 5 – 8 tùy thuộc vào cơ chất

Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên các cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính

khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelainmạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelaintương tự như papain Đối với cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl–L–Arginine amide) BAEE (Benzoyl–L–Arginine ethyl ester) thì khả năng củabromelain yếu hơn papain

1.3 Tổng quan về hương và cải thiện hương nước mắm ngắn ngày

Nước mắm ngắn ngày được sản xuất bằng phương pháp bổ sungenzyme cho hàm lượng đạm thu hồi, hàm lượng nitơ tổng số và nitơ acidamin cao hơn với nước mắm được sản xuất theo phương pháp truyền thống.Tuy nhiên, do thời gian ngắn nên mùi hương kém hơn nước mắm truyềnthống Giải quyết tận gốc vấn đề hương thơm của nước mắm công nghệ mới

là hết sức cần thiết Để khắc phục điều này, nhiều tác giả đã phân lập vi sinhvật gây hương trong nước mắm, nghiên cứu các hợp chất bay hơi từ đó cónhững phương pháp làm tăng hương vị cho nước mắm ngắn ngày Đã cónhiều công trình khoa học của các tác giả nước ngoài công bố về mối liênquan của một số thành phần hóa học trong nước mắm đến mùi hương củachúng Các công trình đều chỉ ra rằng, các hợp chất bay hơi có vai trò quantrọng trong việc tạo nên mùi hương đặc trưng của nước mắm Các hợp chấtnày được hình thành bởi các phản ứng không enzyme của nhiều thành phầnkhác nhau và các phản ứng enzyme trong bản thân nguyên liệu và từ sự hoạt

động của các vi sinh vật yếm khí tồn tại trong quá trình lên men nước mắm(Fukami et al., 2004)

Kết quả nghiên cứu Dougan và Howard năm 1975 về các thành phầntạo hương nước mắm đã được nhiều nhà khoa học khác đánh giá cao Theoông, hương nước mắm được tạo nên bởi 3 loại hương vị đặc biệt được hìnhthành từ sự thủy phân protein, oxi hóa các chất béo hoặc từ sự hoạt động củacác vi sinh vật [5]

- Hương thối của ammoniac được hình thành từ sự tổng hợp củaammoniac, các amin và các hợp chất chứa nito

- Hương phomat được hình thành từ các acid béo bay hơi có khối lượngphân tử thấp và ketone methyl

- Hương thịt thì phức tạp hơn, được hình thành từ sự oxi hóa các cơ chấtnguyên liệu cá trong nước mắm và các ketone acid

Rossana R Peralta et al, 1996 đã nghiên cứu xác định các chất bay hơitrong nước mắm Ông sử dụng phương pháp sắc ký cột bằng gel silica.Khoảng 155 chất bay hơi được xác định, trong đó gồm 14 acid, 36 hợp chấtcarbonyl, 17 hợp chất chứa nito, 10 hợp chất chứa lưu huỳnh… Trong đó sốlượng lớn các acid, số lượng lớn carbonyl và các hợp chất chứa lưu huỳnhnhư dimethyl sulfide, dimethyl trisulfide và 3-(methylthio) propanal cũng nhưnhiều hợp chất chứa nitơ là những thành phần chính tạo nên mùi hương đặctrưng của nước mắm.[5]

Từ những kết quả nghiên cứu về các hợp chất bay hơi trong nước mắmgiúp các nhà khoa học có những nghiên cứu, bổ sung các hợp chất gây hươngtrong quá trình lên men nước mắm Từ đó ứng dụng vào nâng cao hươngnước mắm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Tại Việt Nam, Phạm Thị ThuThủy và Trần Thu Hương, 2005, cũng đã nghiên cứu nâng cao thành phần cáchợp chất bay hơi trong sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng cách bổ sung chếphẩm enzyme Neutrase, 3 chủng vi khuẩn thuộc nhóm clostridium Kết quảcho thấy hương nước mắm được cải thiện rõ rệt, cả 3 chủng vi khuẩn này hoạtđộng hình thành nên 6 cấu tử bay hơi chính có vai trò quan trọng và chiếm tỉ

lệ lớn trong các hợp chất bay hơi của nước mắm [7]

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá nước ngọt: cá mè, cá thiểu, cá mương,

Các quy trình sản xuất nước mắm, enzyem bromelain trong sản xuấtnước mắm

2.1.2 Nguyên liệu, dụng cụ

Nguyên liệu: Cá mè, cá thiểu và cá mương

Hình 2.1.Cá mè

Hình 2.2 Cá thiểu

- Pipet 1,5, 10, 20, 50ml;

- Bình nón, dung tích 100, 250ml, bình nón có nút mài, dung tích 250ml;

- Phễu thủy tinh;

- Cốc thủy tinh, dung tích 100ml;

- Cối chày sứ hay chén sứ;

Hóa chất:

- Axit sunfuric (H2SO4) đậm đặc và dung dịch 0,1N;

- Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 33% và dung dịch 0,1N;

- Hỗn hợp xúc tác: đồng sunfat (CuSO4) + Kali sunfat (K2SO4), tỷ lệ 1/10(theo khối lượng);

- Chỉ thị hỗn hợp: 200mg đỏ metyl và 100mg xanh metylen hòa tan trong200ml etanol (C2H5OH) 96%;

- Phenolphtalein, dung dịch 1% trong etanol 60%

- Dung dịch đồng clorua (A): 27,3g CuCl2 (hoặc 35,4 g CuCl2 12H2O) trong

- Axit axetic (CH3COOH) đậm đặc và dung dịch 0,01 N

- Kali iodua (KI) tinh thể;

- Tinh bột, dung dịch 1% trong NaCl bão hòa