đồ án sản xuất rượu vang từ ca cao bằng chủng leuconostoc oenos

Rượu vang là một loại thức uống có cồn thu được từ quá trình lên men nước ép nho hoặc một số loại trái cây khác. Lên men rượu là một hình thức rất cổ xưa trong công nghệ thực phẩm trên thế giới, nó đã có cách đây hàng ngàn năm. Việc sản xuất rượu vang đã trở thành một hình thức kinh doanh toàn cầu, nó đã và đang ảnh hưởng đáng kể đến nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới (Walker, 2000). Việc lên men rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men vào nước trái cây. Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình này là Saccharomyces cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ đường trong nước ép trái cây (Klingshirn, 2002) 9. Một nhóm vi sinh vật khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đó chính là vi khuẩn lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần hai hay còn gọi là lên men malolactic. Hiệu suất của quá trình lên men malolactic phụ thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000), đặc biệt là lượng acid malic có trong quả. Nếu hàm lượng acid malic quá cao thì việc lên men malolactic là cần thiết để chuyển acid Lmalic thành acid Llactic, kết quả là làm giảm lượng acid trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện được hương vị của rượu vang (Steinkraus, 1992) 9. Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay ít nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát mẻ. Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu vang nhờ sự hoạt động của vi khuẩn và ổn định hệ vi sinh vật có trong rượu vang (Bozoğlu vàYurdugül, 2000). Vi khuẩn acid lactic tham gia vào quá trình lên men malolactic được gọi là vi khuẩn malolactic, thuộc chi Leuconostoc, Pediococcus và Lactobacillus (LonvaudFunel, 2000; Văn Vuuren và Dicks, 1993; Versari, Parpinello, và Cattaneo, 1999), chúng có khả năng chuyển hóa trực tiếp acid malic thành acid lactic và CO2 nhờ malate carboxylase hay còn gọi là enzyme malolactic (MLE) (Bozoğlu and Yurdugül, 2000; Fugelsang, 1997; Renault et al., 1988;

dẫn là Th.S Chu Thị Hà Các số liệu và kết quả trong đề tài này là trung thực vàchưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây Cácthông tin, tài liệu trích dẫn trong tài liệu tham khảo.

TP Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014.

Ngô Tiến Việt Anh

kĩ thuật Hóa học, Công nghệ Thực phẩm nói riêng và các thầy cô trong khoa Hóahọc và Công nghệ Thực phẩm nói chung đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiệnthuận lợi giúp em hoàn thành tốt đồ án này.

Em xin cảm ơn cô Chu Thị Hà – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ,tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu

Con xin cám ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trongsuốt quãng đường mà con đã đi

Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sátcánh cùng tôi trong thời gian qua

TP Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014.

Ngô Tiến Việt Anh

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH v

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây cacao 3

1.1.1 Đặc điểm của cây cacao 3

1.1.2 Các giống cây cacao 3

1.1.3 Cấu tạo quả cacao 5

1.1.4 Thành phần hóa học của nước cacao 6

1.2 Giới thiệu quá trình lên men malolactic 6

1.2.1 Khái niệm lên men malolactic 6

1.2.2 Vị trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang cacao .7

1.2.3 Mục đích và ứng dụng của quá trình lên men malolactic 7

1.2.4 Các kiểu lên men malolactic 9

1.2.5 Giới thiệu một số loại vi khuẩn lên men malolactic 12

1.2.6 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 16

1.3 Giới thiệu quá trình làm trong rượu vang 29

1.3.1 Mục đích của quá trình làm trong rượu vang 29

1.3.2 Một số tác nhân làm trong 30

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Vật liệu nghiên cứu 34

2.1.1 Dịch quả cacao 34

2.1.2 Rượu vang non 34

2.1.3 Giống vi sinh vật 34

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Phương pháp lên men malolactic 36

2.2.2 Phương pháp làm trong rượu 36

2.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 38

2.2.5 Các phương pháp phân tích 41

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45

3.1. Các yếu tố ảnh hướng đến sinh triển và phát triển của chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos 45

3.1.2 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos 46

3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến sự sinh trưởng của Leuconostoc oenos. 48

3.1.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến sự sinh trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos 49

3.1.5 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos 51

3.1.6 Ảnh hưởng của thành phần đường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos 53

3.2 Tỉ lệ giống thích hợp bổ sung vào dịch vang non 55

3.2.1 Sự thay đổi pH 56

3.2.2 Sự thay đổi độ acid tổng 57

3.2.3 Sự thay đổi độ cồn và hàm lượng chất khô 57

3.3 Thời điểm bổ sung giống vi khuẩn 58

3.3.1 Sự thay đổi pH 59

3.3.2 Sự thay đổi hàm lượng chất khô 60

3.3.3 Sự thay đổi độ acid tổng 61

3.3.4 Sự thay đổi độ cồn 61

3.4 Tỉ lệ chất làm trong bentonite 61

3.5 Lên men malolactic với các điều kiện nghiên cứu 63

3.6 Đánh giá cảm quan 64

4.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 70

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nước cacao 6

Bảng 1.2 Phân loại các vi khuẩn Lactobacillus 13

Bảng 1.3 Tốc độ phát triển vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ 26

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu của rượu vang non 34

Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS 35

Bảng 3.1 Định lượng vi khuẩn Leuconostoc oenos 47

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 48

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 50

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 52

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thành phần đường đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 54

Bảng 3.6 Quá trình lên men malolactic với các nồng độ vi khuẩn bổ sung khác nhau 56

Bảng 3.7 Sự thay đổi độ cồn và hàm lượng chất khô sau quá trình lên men malolactic ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 58

Bảng 3.8 Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men theo các thời điểm bổ sung giống khác nhau 59

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng bentobite tới hiệu quả lắng trong của rượu vang 62

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng bentonite tới chất lượng cảm quan của rượu vang 63

Bảng 3.11 Kết quả các chỉ tiêu của rượu vang cao cao khi lên men ở điều kiện tối ưu 64

Hình 1.1 Giống Criollo 4

Hình 1.2 Giống Forastero 5

Hình 1.3 Giống Trinitario 5

Hình 1.4 Cấu tạo quả cacao 6

Hình 1.5 Các loại vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc 12

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 37

Hình 3.1 Hình ảnh của vi khuẩn Leuconostoc oenos dưới kính hiển vi 45

Hình 3.2 Khuẩn lạc của vi khuẩn Leuconostoc oenos trên môi trường MRS – Agar có bổ sung dịch vang cacao non 46

Đồ thị 1.6 Đường cong sinh trưởng của các vi khuẩn chính trong lên men rượu 17

Đồ thị 1.7 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic 19

Đồ thị 1.8 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống trước khi lên men rượu 19 Đồ thị 1.9 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống sau khi lên men rượu 20

Đồ thị 1.10 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic 27

Đồ thị 3.3 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos 47

Đồ thị 3.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cồn đến OD vi khuẩn Leuconostoc oenos 49

Đồ thị 3.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến OD vi khuẩn Leuconostoc oenos 50

Đồ thị 3.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH đến OD của vi khuẩn Leuconostoc oenos 52

Đồ thị 3.7 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thành phần đường đến OD của vi khuẩn Leuconostoc oenos 54

Đồ thị 3.8 Sự thay đổi pH của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau theo thời gian trong quá trình lên men malolactic 56

Đồ thị 3.9 Sự thay đổi nồng độ acid tổng của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau theo thời gian trong quá trình lên men malolactic 57

sung giống khác nhau 59

LỜI MỞ ĐẦU

Rượu vang là một loại thức uống có cồn thu được từ quá trình lên men nước

ép nho hoặc một số loại trái cây khác Lên men rượu là một hình thức rất cổ xưatrong công nghệ thực phẩm trên thế giới, nó đã có cách đây hàng ngàn năm Việcsản xuất rượu vang đã trở thành một hình thức kinh doanh toàn cầu, nó đã và đangảnh hưởng đáng kể đến nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới (Walker, 2000).Việc lên men rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêmgiống nấm men vào nước trái cây Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình này

là Saccharomyces cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ

đường trong nước ép trái cây (Klingshirn, 2002) [9]

Một nhóm vi sinh vật khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đóchính là vi khuẩn lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượulần hai hay còn gọi là lên men malolactic Hiệu suất của quá trình lên menmalolactic phụ thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000),đặc biệt là lượng acid malic có trong quả Nếu hàm lượng acid malic quá cao thìviệc lên men malolactic là cần thiết để chuyển acid L-malic thành acid L-lactic, kếtquả là làm giảm lượng acid trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện đượchương vị của rượu vang (Steinkraus, 1992) [9]

Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay

ít nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát

mẻ Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trongnhững loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượuvang nhờ sự hoạt động của vi khuẩn và ổn định hệ vi sinh vật có trong rượu vang(Bozoğlu vàYurdugül, 2000) Vi khuẩn acid lactic tham gia vào quá trình lên men

malolactic được gọi là vi khuẩn malolactic, thuộc chi Leuconostoc, Pediococcus và

Lactobacillus (Lonvaud-Funel, 2000; Văn Vuuren và Dicks, 1993; Versari,

Parpinello, và Cattaneo, 1999), chúng có khả năng chuyển hóa trực tiếp acid malicthành acid lactic và CO2 nhờ malate carboxylase hay còn gọi là enzyme malolactic(MLE) (Bozoğlu and Yurdugül, 2000; Fugelsang, 1997; Renault et al., 1988;

Salema et al., 1996) Quá trình này có thể xảy ra tự phát trong thời gian lưu trữ rượuhoặc được điều khiển bởi các tác nhân vi sinh vật [9].

Ở Việt Nam, hầu hết các sản phẩm rượu vang đều trải qua 2 giai đoạn, đó làgiai đoạn lên men rượu và lên men phụ nhằm lắng trong cũng như ổn định chấtlượng rượu vang mà không có quá trình lên men malolactic Chính điều này cũng đãgóp phần làm hạn chế chất lượng cũng như mùi vị của sản phẩm, đặc biệt là đối vớinhững loại quả có hàm lượng acid malic cao Vì vậy chúng tôi nghiên cứ quá trìnhlên men malolactic trong sản xuất rượu vang cacao, nhằm khắc phục những khuyếtđiểm đã nêu trên

Trong đồ án này, chúng tôi nghiên cứu những nội dung sau:

‒ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển

của vi khuẩn Leuconostoc oenos.

‒ Khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn Leuconostoc oenos thích hợp bổ sung vào

dịch vang non

‒ Khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos.

‒ Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite

‒ Lên men malolactic với các thông số tối ưu đã nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây cacao

1.1.1 Đặc điểm của cây cacao [4]

Cacao thuộc họ Sterculiaceae, giống Theobroma, loài Cacao, có nguồn gốc từ

miền nam châu Phi

Cacao là cây công nghiệp dài ngày, trồng thích hợp ở vùng nhiệt đới, thân gỗ,cao 5 – 7 m (thường phát triển dưới tán) Sau khi trồng 3 – 4 năm, cây bắt đầu ratrái, sau 10 năm thì cây phát triển hoàn thiện Cây ca cao có thể cho thu hoạch quảđến 50 năm

Hoa nhỏ, đường kính khoảng 15mm, có màu vàng, đỏ, trắng hay tím tùy theoloài Hoa mọc trực tiếp từ thân và cành, thuộc loại lưỡng tính và thụ phấn chủ yếu

là nhờ côn trùng Có khoảng 0,5% hoa nở tạo quả, trong đó 90% quả non sẽ bị khô

và rụng

Điều kiện canh tác: t0 = 20 – 300C, lượng mưa 1500 – 2000 mm/năm, pH củađất: 6,5 – 6,7, phân bón: đạm, kali và các khoáng vi lượng

1.1.2 Các giống cây cacao

Cây cacao (Theobroma Cacao L.) thuộc họ Sterculiceae và còn được chia ra làm nhiều loại khác nhau, quan trọng nhất là các loại Criollo, Forastero và

‒ Trái có màu nâu hoặc xanh trước khi chín

‒ Trái có dạng dài và có đỉnh nhọn rất rõ ở cuối trái, mang mười rãnh đềunhau đôi khi chia thành hai dãy Ta có thể phân biệt được hai nhóm do một trongnăm rãnh không rõ nét

‒ Vỏ thường sần sùi, mỏng, dễ cắt, lớp trong mỏng và ít mô gỗ

‒ Hạt có tiết diện tròn, tử diệp màu trắng ít đắng.

‒ Có từ 20 – 40 hạt/quả

‒ Năng suất thấp và khả năng kháng sâu bệnh kém nhưng chất lượng hạt cacao là tốt nhất có thể làm ra loại chocolate ngon nhất, chiếm 5% thị phần ca cao thếgiới

‒ Trái màu xanh hay ôliu, khi chín có màu vàng

‒ Trái ít có hoặc không có rãnh, bề mặt trơn, đỉnh tròn

‒ Vỏ dày và khó cắt vì ở trong có nhiều chất gỗ

‒ Hạt hơi lép, lớp tử diệp có màu tím đậm, lúc có vị hơi đắng và chát

‒ Có từ 60 – 80 hạt/quả

‒ Chất lượng trung bình, năng suất cao và kháng sâu bệnh tốt, chiếm 80%

thị phần ca cao thế giới Ở Việt Nam, Forastero là giống được trồng nhiều nhất.

Hình 1.3 Giống Trinitario [4]

1.1.3 Cấu tạo quả cacao

Quả cao cao như hình 1.4 Quả phát triển trong 5 – 6 tháng, màu sắc biến đổitùy theo loài Quả ca cao có kích thước lớn, không nứt Trong quả thường có 5hàng hạt bám xung quanh cùi Mỗi hạt có lớp vỏ nhầy bao quanh.

Hình 1.4 Cấu tạo quả cacao [4]

1.1.4 Thành phần hóa học của nước cacao

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nước cacao [4]

1.2 Giới thiệu quá trình lên men malolactic

1.2.1 Khái niệm lên men malolactic [1]

Trong lên men rượu vang, quá trình chuyển hóa L- malic acid (chứa 2 nhómcacboxyl trong phân tử) thành L- hoặc D- lactic acid (chứa 1 nhóm cacboxyl trongphân tử) và CO2 được gọi thực hiện bởi các giống vi khuẩn bao gồm lactic bao gồm

Lactobacillus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus được gọi là quá trình lên

men malolactic Phương trình phản ứng hình thành acid lactic từ acid malic nhưsau:

1.2.2 Vị trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang cacao [1]

Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiếnhành sau khi lên men chính, dịch lên men thu được gọi là “vang non” được tiếnhành lắng gạn cặn và được chuyển sang bồn chứa để sang giai đoạn lên men tiếptheo Quá trình này lên men rất chậm nhằm phân giải những gram đường cuối cùng,song song với quá trình này vi khuẩn lactic sẽ phân giải acid malic thành acid lacticlàm cho rượu vang chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ dễ chịu, CO2 tiếp tụcđược giải phóng nhưng có xu hướng giảm dần, hương vị rượu vang dần được hoànthiện Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác nấm men lắng xuống đáy bồnlên men Tiếp theo, dịch vang được lắng gạn tiếp vài lần, mỗi lần từ 20 đến 30 ngày

để ổn định thành phần của rượu vang rồi tiếp tục vào giai đoạn ủ chín

1.2.3 Mục đích và ứng dụng của quá trình lên men malolactic [1]

1.2.3.1 Mục đích

Lên men malolactic là một quá trình rất quan trọng trong sản xuất các loạirượu vang đỏ hoặc các loại rượu vang có độ chua cao Quá trình này hoàn toànkhông gây nguy hiểm đối với chất lượng vang vì quá trình lên men vi khuẩn lacticchỉ sử dụng acid malic là chính mà không tác động gì tới các cấu tử và thành phần

có trong rượu vang E Peymand (2002) đã xếp mức độ nguy hiểm cho chất lượngrượu vang do tác động của vi khuẩn lactic theo chiều tăng dần lên như sau:

‒ Lên men đường arabinose, acid citric và đường xylose tạo thành mộtlượng không lớn lắm các acid bay hơi và làm giảm chất lượng rượu vang khôngđáng kể.

‒ Lên men acid tartaric, glycerin, glucose, fructose làm thay đổi khá rõ cáchợp phần có trong vang và làm giảm chất lượng của vang

Mức độ gây xấu hay ảnh hưởng không tốt chất lượng rượu vang phụ thuộc vàđặc tính của chủng vi khuẩn lactic và đặc điểm của vang Quá trình lên menmalolactic có ba ý nghĩa quan trọng với rượu vang:

a Làm giảm độ acid của dịch vang lên men

Trước hết, về mặt hóa học, quá trình lên men malolactic làm cho pH của môitrường lên men tăng lên khoảng từ 0,1- 0,3 đơn vị và làm giảm độ acid tổng xuốngkhoảng 0,01 đến 0,03 g/L (tính theo acid tartaric) bởi quá trình decarboxyl hóa mộtgốc acid và chuyển acid malic thành acid lactic có độ acid yếu hơn Tuy nhiên,không phải tất cả các acid malic đều được chuyển hóa thành acid lactic mà chỉ 2/3chúng được chuyển hóa, còn lại bị phân giải hoặc bị oxi hóa thành CO2 thoát khỏidịch men

b Điều chỉnh hương vị đặc trưng cho vang

Sự chuyển hóa acid malic thường đi kèm với quá trình lên men các loại đườngcòn lại để tạo ra rất nhiều sản phẩm là những hợp chất dễ bay hơi nhưacetandehyde, diacetyl, acetoin, acid acetic, 2-3 butadiol, ethyl lactate và các rượubậc cao… Tất cả các hợp chất này tạo nên một tổ hợp các hương vị đặc trưng gópphần tạo nên chất lượng của rượu vang thành phẩm

c Làm ổn định về mặt vi sinh cho rượu vang thành phẩm

Cuối cùng, về mặt bảo quản, quá trình lên men malolactic góp phần tạo nên tính

ổn định về chất lượng cảm quan và vi sinh Điều này có ý nghĩa là sự hiện diện của

quá trình lên men malolactic có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vậtkhác Sự ức chế này được giải thích bởi các nguyên nhân sau:

‒ Một số vi khuẩn không mong muốn có khả năng sử dụng acid malic làmnguồn chất dinh dưỡng Vì thế, việc giảm hàm lượng acid malic trong dịch lên men

sẽ đem lại kết quả tốt để giảm thiểu rủi ro về mặt vi sinh

‒ Vi khuẩn lactic sinh trưởng trước trong môi trường pH thấp và chúng sửdụng các chất dinh dưỡng như: amino acid, các base nitơ, vitamin làm cho môitrường ngày càng nghèo nàn những chất này Từ đó giới hạn được sự sinh trưởng vàphát triển của các vi sinh vật khác

‒ Một số vi khẩn malolactic có thể sản sinh ra độc tố (bacteriocin) có thể

ức chế sinh trưởng của những vi sinh vật khác mà không gây ảnh hưởng gì về mặtcảm quan và sức khỏe con người

Người ta nhận thấy rằng những loại rượu vang không có quá trình lên menmalolactic hay quá trình này không được kiểm soát chặt chẽ thì sau một thời gianđóng chai và bảo quản thường xảy ra hiện tượng bị đục dịch vang hay đôi khi hìnhthành nên cặn lắng hay sủi bọt nhẹ và có khi kèm theo mùi lạ gần giống với mùimón dưa cải bắp truyền thống của Đức Dù ít hay nhiều thì điều này cũng làm ảnhhưởng đáng kể đến chất lượng của rượu vang thành phẩm Vì vậy, nếu quá trình lênmen malolactic được thực hiện một các có kiểm soát thì những rủi ro này có thể bịloại trừ

1.2.3.2 Ứng dụng

Hiện nay, quá trình lên men malolactic được xem như một công nghệ quantrọng nhằm cải thiện chất lượng của rượu vang Người ta cho rằng, hầu hết các loạirượu vang đỏ và khoảng 20% rượu vang trắng trên thế giới đều trải qua quá trìnhlên men này

Đứng trên phương diện thành phần hóa học, lên men malolactic chỉ thích hợpcho sản xuất các loại rượu vang có độ pH thấp, tức là có hàm lượng acid cao Hầu

hết các loại rượu vang đỏ trên thế giới đều được nâng cao chất lượng thông qua quá

trình lên men malolactic Ví dụ các loại rượu vang đỏ: Pinot Noir, Merlot và

Cabernet đều được tiến hành lên men malolactic gần như hoàn toàn Quá trình lên

men malolactic xảy ra hầu hết ở vang đỏ bởi vì ở các vang này có hàm lượng acidmalic khá cao Acid malic có thể bị phân giải bởi vi khuẩn lactic thành acid lacticlàm giảm vị chua gắt khó chịu cho vang Hàm lượng acid malic trong dịch quả còntùy thuộc vào từng loại quả, điều kiện trồng trọt và thời tiết Đối với những loạirượu vang được sản xuất ở vùng khí hậu lạnh, đặc biệt là Đức, Pháp và miền đôngnước Mỹ, thường có hàm lượng acid malic khá cao nên cần thực hiện quá trình lênmen malolactic Ở vùng có khí hậu ấm áp hơn thì ngược lại Hầu như hàm lượngacid malic sẽ giảm cùng với quá trình chín của quả Do đó, thông thường, ở cácvùng này, không cần quá trình lên men malolactic

1.2.4 Các kiểu lên men malolactic [2]

1.2.4.1 Lên men tự nhiên

Sản xuất rượu vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự pháttrong suốt quá trình bảo quản vang non trong vài tháng hoặc vài năm Vi khuẩn cónguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc thùng gỗ Tuy nhiên trong công nghệ sản xuất vanghiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm thối thiểu

thì quá trình lên men như vậy là quá chậm và không đủ độ tin cậy Leuconostoc

oenos sinh trưởng cực kì chậm chạp và đôi khi không phát triển ở vang có pH từ 3.0

– 3.8; cồn 10 – 14%V; 10 – 100ppm SO2 và hàm lượng đường sót thấp Ngoài ra

trong lên men malolactic tự phát ngoài tác nhân là vi khuẩn Leuconostoc oenos còn

rất nhiều vi khuẩn lactic khác vì thế luôn có nhửng rủi ro do việc trao đổi khônghoàn toàn của acid malic hay các sản phẩm có mùi lạ hoặc sự hình thành các amin

do vi khuẩn lactic decarboxyl hóa các amino acid Đặc biệt Pediococcus được coi là

yếu tố quan trọng nhất sinh ra hitsamine Do đó vang có độ pH cao thúc đẩy sự sinhtrưởng của các giống này trong quá trình lên men malolactic thì chắc chắn chứalượng hitsamine không mong muốn

Biện pháp lên men tự nhiên cũng có những ưu điểm là thuận lợi và không đắttiền, nó được áp dụng khá rộng rãi ở Pháp Nhiều năm kinh nghiệm đã chỉ ra rằngthành phần vang và điều kiện môi trường đã thúc đẩy sự sinh trưởng của

Leuconostoc oenos có mặt tự nhiên trong vang vùng Bordeaux của Pháp và thông

thường lên men malolactic bắt đầu trong vòng 1 – 4 tuần sau khi lên men rượu kếtthúc Thành phần và điều kiện đó bao gồm: SO2 tổng thấp (<40 – 50mg/l); duy trì

pH > 3.2 – 3.3; duy trì nhiệt độ của vang khoảng 16 – 250C Tuy nhiên những biệnpháp để thúc đẩy sự sinh trưởng của vi khuẩn tự nhiên để lên men malolactic thànhcông hoàn toàn không phải luôn luôn xảy ra và các phương pháp khác để thúc đẩylên men malolactic trở nên cần thiết

Như vậy lên men malolactic tự nhiên tuy có những ưu điểm là thuận lợi và rẻnhưng nhược điểm cũng rất nhiều đó là khó khởi động, diễn ra rất chậm chạm vàkhó kiểm soát được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình dẫn đến tạo các sảnphẩm phụ không mong muốn Để khắc phục các nhược điểm này, hiện nay, người

ra thường áp dụng phương pháp chủ động đưa vi khuẩn Leuconostoc oenos thuẩn

chủng vào môi trường để thực hiện lên men malolactic Việc cấy vi khuẩn có thểdiễn trong quá trình lên men rượu hoặc sau khi hoàn thành quá trình lên men rượu

1.2.4.2 Lên men một giai đoạn

Lên men một giai đoạn có nghĩa là người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồngthời trong quá trình lên men rượu Phương pháp này có những ưu điểm là vi khuẩn

sẽ có điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp và khihàm lượng cồn tăng dần trong suốt quá trình lên men rượu thì vi khuẩn sẽ dần thíchnghi được với môi trường chứa rượu chứ không bị sốc khi đột ngột gặp môi trường

có nồng độ cồn cao Hơn nữa khi môi trường còn đang giàu chất dinh dưỡng nênthuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nuôi cấy hỗn hợp còn tạođiều kiện cho sự lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, nếu lên menmaloatic không xảy ra tức thời thì có thể do tỷ lệ vi khuẩn trong dịch lên men quá íthoặc do hàm lượng SO2 quá cao đã ức chế vi khuẩn

Nhưng phương pháp này còn có những hạn chế như cạnh tranh nguồn dinhdưỡng và sự tương tác giữa các chủng vi khuẩn vi sinh vật Sự chuyển hóa đườngcủa vi khuẩn lactic để sinh ra acid lactic và acid axetic gây ảnh hưởng đến hiệu suấtquá trình lên men rượu và chất lượng vang Phương pháp này chỉ nên thực hiện khicác chủng vi sinh vật đã được lựa chọn kĩ, không tính đối kháng và lượng tế bào cần

có của mỗi chủng đã được xác định

1.2.4.3 Lên men hai giai đoạn tách riêng

Lên men hai giai đoạn tách riêng là tiến hành lên men rượu và lên menmalolactic riêng biệt Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc, tiến hành lắnggạn cặn và xác nấm men ra khỏi dịch vang non, sau đó đưa vi khuẩn vào thực hiệngiai đoạn lên men malolactic

Phương pháp này có rất nhiều những ưu điểm như sau:

‒ Cho phép điều chỉnh dễ dàng các yếu tố môi trường phù hợp cho từngloài Điều này giúp có thể rút ngắn thời gian lên men mỗi giai đoạn

‒ Không ảnh hưởng đến hiệu suất sinh cồn vì nuôi cấy hai chủng ở hai giaiđoạn riêng biệt

‒ Cuối quá trình lên men do nồng độ đường còn rất thấp nên lúc này vikhuẩn lactic buộc phải sử dụng các acid hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để sinhtồn pH dịch lên men sẽ giảm đến mức thích hợp cho việc chuyển hóa acid malic

‒ Nguy cơ chuyển hóa đường thành các loại acid khác như acid axeticgiảm

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những nhược điểm và nhược điểm lớnnhất là khi kết thúc quá trình lên men rượu nồng độ còn trong môi trường khá cao,khoảng 12 – 15%V Do đó, vi khuẩn khi cấy vào vang non do gặp nồng độ cồn caođột ngột nên bị sốc, số lượng giảm đáng kể nên làm chậm quá trình lên menmalolactic Vì vậy, phải chọn được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu được

độ cồn cao và phải dùng phương pháp nuôi cấy trước tức là nuôi vi khuẩn trong các

môi trường giàu chất dinh dưỡng có bổ sung cồn ở khoảng pH – 4.5 trong 5 – 7ngày để vi khuẩn thích ứng rồi sau đó mới đưa vào vang non, qua đó có thể khắcphục tình trạng chết vi khuẩn một các đáng kể.

1.2.5 Giới thiệu một số loại vi khuẩn lên men malolactic [1]

1.2.5.1 Phân loại theo hình thái vi khuẩn

Thuật ngữ “vi khuẩn malolactic” thường được dùng để chỉ những giống vikhuẩn có khả năng chuyển hóa acid malic trong rượu vang thành acid lactic Tất cả

vi khuẩn malolactic đều là vi khuẩn Gram dương, có hình cầu hoặc hình que, không

có catalase, thuộc nhóm vi hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện Có 3 giống vi khuẩn lactic

rất quan trọng trong sản xuất rượu vang: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc.

Hình 1.5 Các loại vi khuẩn Lactobacillus [18], Pediococcus [19],

Leuconostoc [20].

a Vi khuẩn Lactobacillus

Các trực khuẩn thuộc giống Lactobacillus đều là vi khuẩn Gram dương.

Chúng thường có dạng hình que dài hoặc cũng có thể là ngắn gần như hình cầu.Đường kính khoảng 0.5– 0.7 µm và chiều dài có thể lên đến 8 µm Chúng đứngriêng lẽ, kết đôi hoặc kết thành chuỗi

Có nhiều loài trong Lactobacillus được tìm thấy trong vang, được chia thành 2

nhóm: lên men lactic đồng hình và dị hình tùy thuộc vào khả năng lên men đườnghexose và pentose Các loài lên men lactic đồng hình được liệt kê trong bảng 1.2 chỉtạo ra được acid lactic từ đường Những loài vi khuẩn lactic dị hình được liệt kê

trong bảng đều là những loài dị hình bắt buộc, nghĩa là lên men đường ngoài việctạo sản phẩm là acid lactic, chúng còn có khả năng tạo ra nhiều sản phẩm khác nhưacid acetic, acid succinic, ethanol, carbon dioxide… pH hoạt động tối thích cho các

trực khuẩn Lactobacillus là 5.5– 5.8 Chúng không thể sinh trưởng được trong môi

trường có pH thấp hơn 3.5

Bảng 1.2 Phân loại các vi khuẩn Lactobacillus

Lactobacillus casei Lactobacillus hilgardii

Lactobacillus plantarum Lactobacillus fructivorans

Lactobacillus homohoichii Lactobacillus desidiosus

Lactobacillus curvatus Lactobacillus brevis

Lactobacillus bavaricus Lactobacillus fermentum

Lactobacillus saki Lactobacillus buchneri

b Vi khuẩn Pediococcus

Thuộc giống này là các vi khuẩn hình cầu, Gram dương, không sinh bào tử,không chuyển động, đứng riêng lẻ hoặc kết đôi, kết ba, kết bốn hoặc kết thànhchùm, đôi khi thành chuỗi Chúng có thể là thể kị khí hoặc vi hiếu khí Tất cả cácloài vi khuẩn lactic thuộc giống này đều lên men lactic đồng hình, nghĩa là chúngchỉ có thể lên men đường thành acid lactic Khác với các vi khuẩn Gram dương điểnhình, chúng không chứa acid teichoic trong thành tế bào Có 4 loài Pediococcus có

khả năng phát triển ở pH 4.2 hoặc thấp hơn thường gặp trong rượu vang là: P.

damnosus, P parvulus, P pentosaceus, P acidilactici.

c Vi khuẩn Leuconostoc

Tất cả các vi khuẩn Leuconostoc đều lên men dị hình, các tế bào thuộc giống

này có hình cầu hay hình trứng dài, đứng riêng lẻ, kết đôi hoặc tạo thành chuỗingắn, có khả năng tạo NH3 từ asparagin và không có enzyme catalase Việc nghiêncứu nuôi cấy giống vi khuẩn này rất khó khăn vì chúng đòi hỏi môi trường nuôi cấycần vài chất dinh dưỡng đặc biệt như β-D-glucopyranosyl- D- pantothenic, nguồnacid béo sử dụng là Tween 80 và chất ức chế nấm men cycloheximide Người ta có

thể nuôi cấy chúng trong dịch ép cà chua, táo hoặc nho Tuy nhiên, kết quả nghiên

cứu cho thấy rằng chỉ có một loài của Leuconostoc được tìm thấy và phân lập từ vang nho, đó là Leuconostoc oenos.

1.2.5.2 Sơ lược về vi khuẩn Leuconostoc oenos

Năm 1995 một số nhà phân loại vi sinh vật học đã đề xuất và thống nhất đặt

chủng Leuconostoc oenos với tên mới là Oenococcus oeni Cho đến nay, cách phân loại này được nhiều nhà khoa học chấp nhận và Oenococcus oeni đã trở thành cái tên chính thức cho loài vi khuẩn này Leuconostoc oenos có hình cầu dài, nối với

nhau thành chuỗi Loài này có đặc điểm hoàn toàn khác với những loài vi khuẩnkhác thuộc nhóm này là chúng có thể phát triển ở nồng độ ethanol cao (> 10%) và

pH thấp (<4,2)

Qua rất nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng vi khuẩn Leuconostoc oenos là

loài có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhất (chịu đựng và thích nghi tốt nhất trongmôi trường rượu vang) Đồng thời chúng còn có khả năng cải thiện hương và vị làmtăng chất lượng cho sản phẩm Các chủng vi khuẩn còn lại tuy vẫn có khả năngchuyển hóa acid malic, làm giảm vị chua cho rượu vang nhưng chúng không có khảnăng điều chỉnh hương vị, thậm chí có thể là nguyên nhân gây ra các biến đổi khôngmong muốn trong giai đoạn tàng trữ và bảo quản sản phẩm Vì thế, trong công

nghiệp sản xuất rượu vang Leuconostoc oenos là loài mang lại nhiều đặc tính mong

muốn nhất cho chất lượng rượu vang

a Đặc tính sinh học [2]

Leuconostoc oenos là một loại liên cầu khẩu Gram dương (Gr+) nằm trong hệ

vi khuẩn sinh acid lactic chịu được độ cồn và acid tương đối cao như ở rượu vang

và sâm – panh Có nhiều loại Leuconostoc nhưng chỉ có Leuconostoc oenos mới có

giá trị ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất rượuvang

Leuconostoc oenos có kích thước nhỏ nhất trong các loại vi khuẩn lactic có

trong rượu vang, đường kính tế bào của chúng thường nhỏ hơn 0.7 micromet

Leuconostoc oenos tạo ra các khuẩn lạc rất bé màu trong mờ sau 2 – 3 ngày nuôi

cấy trên môi trường đặc Các tế bào vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thànhchùm 2, 3 tế bào hoặc kết thành chuỗi, các tế bào đều là vi khuẩn Gram dương,

không chuyển động, không sinh bào tử Leuconostoc oenos thường phát triển thích

hợp trên các môi trường acid nhưng rất khó nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo

Trong cùng loài Leuconostoc oenos khả năng lên men đường của mỗi chủng

cũng khác nhau Có chủng lên men được hoàn toàn L – arabinoza và D – fructose ởcác pH 4,5,7 nhưng có chủng lại không lên men được L – arabinoza và chỉ lên men

yếu ớt D – fructose Đối với các loại đường khác thì tác dụng của Leuconostoc

oenos rất yếu hoặc không xác định được Nhìn chung, người ta sẽ dựa vào khả năng

lên mên D – glucose và sự tạo thành acid D – lactic để phân biệt Leuconostoc với

các loài khác Trong khi trên môi trường thực nghiệm dùng D – glucose không chứa

fructose và acid malic thì Leuconostoc onenos cần có khoảng thời gian 15 ngày để

chuyển hóa glucose rồi ngừng phát triển còn các loại vi khuẩn lactic khác chỉ cần có

2 ngày mà thôi Ở đây lượng acid D – lactic tạo thành so với lượng lactic tổng ở loài

Leuconostoc oenos đạt tỉ lệ 95% trở lên, còn các loài khác chỉ từ 25 – 44%.

Sơ đồ chuyển hóa glucose ở Leuconostoc oenos như sau:

Glucose  Ethanol + acid lactic + CO2 + axetat

b Enzym trong Leuconostoc oenos [2]

Leuconostoc oenos có nhiều loại enzym Hoạt tính enzym của loài này gần

như hoạt tính enzym của trực khuẩn và cầu khuẩn Thế nhưng hoạt tính một số loại

enzym của các chủng trong loại Leuconostoc oenos có sự khác nhau khá rõ Người

ta nhận thấy khoạt lực enzym glucosidaza ở các chủng thuộc loài Leuconostoc

oenos đều rất mạnh, đặc biệt là α – galactosidaza, α – arabinoza α và β –

D-glucosidaza, β – D- xylosidaza Các β- glucpsidaza tác dụng ngược lên trên các cơ

chất và thủy phân các antocyamin có trong nước ép nho hoặc trong vang đỏ Do vậyvang đỏ thường bị giảm màu và có sự tích lũy không ổn định glucose và fructosetrong quá trình lên men malolactic [2], [5]

Các enzym esteraza ở loài Leuconostoc oenos thủy phân được các este của

acid béo từ C4 đến C9 và C18 nhưng lại không thủy phân được este của acid béo từ

C10 gây ức chế quá trình sinh trưởng và hoạt động của Leuconostoc oenos [2].

Leuconostoc oenos có khả năng chống chịu tốt đối với một số loại kháng sinh như streptomycin, gentamycin, lyncomycin và neomycin Đối với các loại kháng sinh

khác thì khả năng chống chịu không rõ ràng Đáng chú ý là vi khuẩn Leuconostoc

oenos chống chịu được các chất kháng sinh rất đặc trưng đối với vi khuẩn yếm khí

tuyệt đối hay yếm khí tùy tiện

Tất cả các vi khuẩn thuộc loài Leuconostoc oenos đều không có khả năng tạo

dextran do vậy không làm nhớt môi trường vì thế rượu vang lắng được một các dễdàng

Hoạt độ enzym malolactic của Leuconostoc oenos có một ý nghĩa cực kì quan

trọng vì nó có vai trò lớn trong việc tạo nên chất lượng cảm quan trong rượu vang.Nhờ có enzym này mà acid malic chuyển thành acid lactic và CO2 tạo cho rượuvang có độ chua thích hợp cũng như có vị đắng dịu Mặt khác cũng nhờ enzym này

mà acid citric được chuyển hóa thành các chất khác có vai trò tổng hợp nên mùi

thơm đặc trưng cho vang Hoạt độ malolactic của Leuconostoc oenos có giá trị cao

nhất ở pH = 3 và thấp dần theo chiều tăng của pH Hoạt độ này phụ thuộc rất nhiềuvào nồng độ acid malic vì acid malic là chất cảm ứng cho sự hình thành enzymmalolactic Khi nồng độ acid malic ≥ 10mg/l thì hoạt độ enzym malolactic của

Leuconostoc oenos là cao nhất Ngược lại khi nồng độ acid malic nhỏ hơn 10mg/l

thì hoạt độ enzym malolactic thấp dần

1.2.6 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic

1.2.6.1 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong quá trình lên men malolactic.

Vi khuẩn malolactic có mặt trong tất cả các nước cacao và rượu vang Tùythuộc vào giai đoạn của quá trình làm rượu vang, điều kiện môi trường mà chúng sẽxác định khả năng sinh sản của chính mình Khi phát triển, chúng chuyển hóa một

số lượng lớn các chất Vì thế mà vi khuẩn malolactic đóng một vai trò quan trọngtrong quá trình sản xuất rượu Ảnh hưởng của chúng tới chất lượng rượu vangkhông chỉ phụ thuộc vào các yếu tố tác động vào môi trường ở cấp độ tế bào màcòn phụ thuộc vào việc lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp nhất cho quá trình lênmen

Trong giai đoạn lên men chính, vi khuẩn lactic chiếm số lượng nhỏ, vi khuẩn

acetic và nấm men tìm thấy số lượng nhiều hơn Leuconostoc oenos chiếm số lượng

nhiều hơn có trong lên men malolactic, xuất hiện ngay từ đầu trong quá trình lên

men rượu vang Pediococcus có thể tìm thấy hầu hết sau khi quá trình lên men

malolactic bắt đầu xảy ra và nhiều nhất khi rượu có pH cao hơn Rượu vang có pH

dưới 3.5 thông thường chỉ có Leuconostoc oenos xuất hiện, trong khi rượu có pH

trên 3.5 thì thường có các vi khuẩn khác đặc biệt là các vi khuẩn lactic dị hình

Quá trình tăng trưởng của vi khuẩn malolactic trong môi trường rượu vanggồm 4 pha được thể hiện ở đồ thị 1.6

Đồ thị 1.6 Đường cong sinh trưởng của các vi khuẩn chính

trong lên men rượu [7].

Các pha được giải thích như sau:

‒ Pha thích nghi (pha lag): đây là giai đoạn vi khuẩn malolactic thích

nghi với môi trường, một vài loại vi khuẩn lactic có thể xuất hiện và lớn lên, đạt sốlượng 103 đến 104 CFU/ml, thường gặp là Lactobacillus plantarum và Lactobacillus

casei, và một số lượng ít hơn là Leuconostoc oenos và Pediococcus cerevisiae Số

lượng tế bào vi khuẩn không tăng nhưng việc trao đổi chất vẫn diễn ra mạnh mẽ.Tuy nhiên ở giai đoạn này chất dinh dưỡng đã bị nấm men sử dụng gần như cạn kiệt

để tạo ra ethanol, vì thế mà lượng ethanol này có thể gây ức chế và kìm hãm sự traođổi chất của vi khuẩn malolactic Sự thích nghi của vi khuẩn malolactic phụ thuộcvào quá trình xử lí nguyên liệu

‒ Pha tăng trưởng (pha log): trong pha này hầu hết các vi khuẩn

malolactic đã thích nghi và sẽ tăng trưởng với tốc độ sinh trưởng cực đại Các tếbào còn sống sẽ bắt đầu nhân lên đến khi sinh khối đạt ổn định và acid malic bắtđầu suy giảm trong pha này, chất dinh dưỡng chủ yếu được sử dụng để xây dựngvật chất tế bào và sinh sản

‒ Pha cân bằng: trong pha này số lượng tế bào sống là ổn định, acid malic

hầu như được phân giải hoàn toàn

‒ Pha suy vong: các tế bào sống bắt đầu già đi, giảm dần và tế bào chết

tăng lên, xuất hiện hiện tượng tự phân do các enzyme protease nội bào

Trong những ngày đầu của quá trình lên men rượu, vi khuẩn và nấm men đềusinh sản Sau đó, chúng bắt đầu thích nghi hơn với môi trường và nhanh chóng tăng

số lượng Trong suốt thời gian này, vi khuẩn vẫn tiếp tục sinh sản để tăng số lượngnhưng bị giới hạn khi mật độ tế bào đạt 104 đến 105 CFU/ml Việc tăng mật độ tếbào phụ thuộc vào pH môi trường Vi khuẩn malolactic đóng vai trò quan trọngtrong lên men malolactic, chúng thường diễn ra sau khi nấm men đã hoàn tất quátrình lên men rượu, khi đó mật độ tế bào đạt 106 CFU/ml (Lonvaud-Funel, 1999;Osborn et al., 2000; Versari et al., 1999) [8]

Đồ thị 1.7 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình

lên men rượu và lên men malolactic [9]

Hơn nữa, vi khuẩn malolactic có thể được bổ sung vào các giai đoạn sau củaquá trình lên men rượu: bổ sung cùng với nấm nem khi bắt đầu len men rượu.(Davis et al., 1985) [9]

Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn được thể hiện ở đồ thị 1.8

Đồ thị 1.8 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men

rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống

trước khi lên men rượu [9]

Khi bổ sung vi khuẩn malolactic sau khi hoàn tất quá trình lên men rượu [9]thì quá trình sinh trưởng của vi khuẩn malolactic thể hiện ở đồ thị sau:

Đồ thị 1.9 Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách

cấy giống sau khi lên men rượu [7]

Quá trình lên men malolactic bắt đầu khi tế bào đạt đến pha tăng trưởng, tứcngay sau khi mật độ tế bào đạt 107 CFU/ml Quá trình này được tiếp tục và kết thúctrong pha cân bằng hoặc ở giai đoạn đầu của pha suy vong Trong điều kiện thuậnlợi với nồng độ giới hạn của acid malic, quá trình lên men malolactic có thể hoànthành ngay trước khi kết thúc pha tăng trưởng Lúc này mật độ tế bào tối ưu đạt 108

CFU/ml Ngay sau khi sinh khối đã tăng đủ số lượng và đạt đến sự ổn định thì acidmalic bắt đầu bị suy giảm Các vi khuẩn malolactic vẫn luôn luôn có mặt nhưnghoạt động của chúng còn tùy thuộc vào các điều kiện khác nhau, đặc biệt là nhiệt

độ Việc chuyển hóa 2g acid malic/ml có thể mất thời gian hơn việc chuyển hóa 4gacid malic/ml nếu mật độ tế bào thấp (Ribéreau-Gayon et al., 2000) [7]

1.2.6.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men

Trong giai đoạn lên men malolactic, tác nhân vi sinh vật chính là vi khuẩnmalolactic Sự hiện diện của nấm men không đóng vai trò rõ rệt vì trong giai đoạnnày hầu như nấm men không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất yếu và bước vào phasuy vong, nhường chỗ cho vi khuẩn malolactic phát triển Một phần nấm men chết

đi có thể bị tự phân Hiện tượng tự phân của nấm men là hiện tượng các thành phầncủa xác tế bào nấm men bị phân giải dưới tác dụng của enzyme thủy phân(hydrolase) của chính bản thân tế bào Trong quá trình này, hầu hết các protein, acidnucleic, lipid và các vật chất của tế bào đều bị phân giải thành những chất có phân

tử lượng thấp hơn và hòa tan vào môi trường Điều kiện để hiện tượng tự phân của

tế bào xảy ra là tế bào đã chết nhưng vẫn còn giữ được hoạt tính của các enzymehydrolase Trong sản xuất rượu vang truyền thống, người ta có thể tận dụng xácnấm men tự phân làm nguồn cung cấp một số chất dinh dưỡng cần thiết cho vikhuẩn lên men malolactic phát triển

1.2.6.3 Sự tương tác giữa vi khuẩn malolactic và nấm men

Sự tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic có ý nghĩa quan trọngtrong sản xuất rượu vang Bên cạnh việc nghiên cứu, tuyển chọn những giống vikhuẩn malolactic có khả năng thích nghi cao và lên men malolactic tốt, ta còn phảinghiên cứu những tương tác có lợi giữa nấm men và vi khuẩn nhằm mục đích tăngcường khảnăng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của môitrường Đã có khá nhiều nghiên cứu về vấn đề tương tác giữa nấm men và vi khuẩnmalolactic.

Những nghiên cứu trên đều chỉ ra được các loại tương tác khác nhau (kíchthích, kìm hãm, trung lập) giữa vi khuẩn malolactic và nấm men

Mức độ của những tương tác này còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm sựtương tác của từng tổ hợp chủng nấm men vi khuẩn malolactic cụ thể, sự hấp thụ vàgiải phóng các chất dinh dưỡng bởi nấm men, sự tạo thành các sản phẩm trao đổichất ngoại bào có khả năng kích thích hoặc gây độc đối với vi khuẩn malolactic

Khi xét ảnh hưởng tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic ta thường

đề cập đến 2 khía cạnh chính:

Nhiều chủng nấm men có khả năng gây nên những tác động kích thích hoặc kìm hãm đến sự sinh trưởng và khả năng lên men vi khuẩn malolactic:

a Ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men:

Một vài loài nấm men có khả năng góp phần vào quá trình lên menmalolactic, nhưng vai trò này đã bị phủ định bởi chức năng chính của nấm men làchuyển hóa chất dinh dưỡng thành cồn Cơ chế tương tác mang tính chất ức chế củanấm men đến vi khuẩn malolactic vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng Tuy nhiên

đã có nghiên cứu cho thấy rằng những ảnh hưởng của nấm men lên vi khuẩn là hạnchế sự phát triển và tồn tại do sản phẩm tạo ra hay sự cạnh tranh chất dinh dưỡngcủa nấm men Những nghiên cứu của Lallemand ở phòng thí nghiệm cho biết nấm

men tạo chất kháng khuẩn làm hạn chế sự phát triển của Leuconostoc oenos và các

vi khuẩn lactic khác Chất kháng khuẩn này là các sản phẩm trao đổi chất ngoại bàocủa nấm men như ethanol, SO2, các acid béo mạch trung bình và protein Đó là cácchất kháng khuẩn tự nhiên

‒ Ethanol có khả năng ức chế các vi khuẩn nói chung kể cả vi khuẩnmalolactic Người ta thấy rằng đối với vi khuẩn malolactic, ethanol tác dụng mạnh

mẽ lên sự sinh trưởng nhưng ít ảnh hưởng đến khả năng lên men malolactic của vikhuẩn này Theo Capucho và San Romao (1994): ở nồng độ 4% (v/v), ethanol đã

có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic nhưng khả năng phân giải acidmalic của vi khuẩn vày vẫn đạt được 95%

‒ SO2 sinh ra từ nấm men cùng với SO2 được cho vào từ quá trình sulfitehóa dịch nho ban đầu là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự ức chế vikhuẩn malolactic và kéo dài thời gian lên men Người ta thấy rằng, hầu hết cácchủng nấm men có khả năng tổng hợp được SO2 với hàm lượng lên đến 30mg/l, một

số ít có thể sinh ra SO2 nhiều hơn, thậm chí hơn 100mg/l

‒ Các acid béo mạch trung bình như acid decanoic, dodecanoic, hexanoic,octanoic… cũng có khả năng ức chế sinh trưởng và khả năng lên men malolactic vikhuẩn lactic, cụ thể: acid decanoic có khả năng ức chế cả nấm men lẫn vi khuẩnmalolactic (Edwards và Beelman, 1987; Edwards và cộng sự, 1990; Lonvaud-Funel

và cộng sự, 1988) Đối với hỗn hợp acid decanoic và dodecanoic, Capucho và SanRonao(1994) đã chứng minh rằng, hàm lượng thấp của các acid này (12,5mg/ldecanoic và 2,5 mg/l dodecanoic) kích thích khả năng lên men malolactic của vikhuẩn nhưng ở hàm lượng cao hơn thì xảy ra theo chiều hướng ngược lại Sự có mặtđồng thời của các acid hexanoic, octanoic và decanoic có thể gây tác động ức chếđến sinh trưởng và lên men malolactic mạnh hơn so với khi chỉ tồn tại riêng lẻ từngloại acid béo (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988)

‒ Sự tạo thành các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cũng đã được nghiêncứu Theo nghiên cứu của Dick và cộng sự (1992), các hợp chất này có bản chất làprotein tích điện âm Tuy nhiên khả năng này cũng phụ thuộc vào từng chủng và có

ít những nghiên cứu sâu về lĩnh vực này đối với các chủng nấm men khác nhautrong sản xuất rượu vang (H.Alexandre và cộng sự, 2004)

‒ Bên cạnh khả năng ức chế bởi các chất có hoạt tính sinh học và các chấtkháng khuẩn tự nhiên, sự ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men còn do sự cạn

kiệt về nguồn chất dinh dưỡng Các chất này được nấm men sử dụng trong giaiđoạn sinh trưởng và lên men ethanol Kết quả là sau khi kết thúc quá trình lên menethanol và bắt đầu lên men malolactic, các chất sinh trưởng như amino acid, vitaminhầu như không còn đủ cho vi khuẩn malolactic phát triển.

b Kích thích vi khuẩn malolactic sinh trưởng bởi nấm men

Tác động kích thích lên vi khuẩn malolactic của nấm men ít được nghiên cứuhơn Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Fornachon (1968), sự kích thích khả năng lênmen malolactic của vi khuẩn có liên quan đến hiện tượng tự phân của nấm men Khinấm men tự phân sẽ giải phóng vào dịch lên men một lượng các hợp chất nitơ gồmcác acid amin, peptide, protein và vitamin Ngoài ra những phân tử lớn khác nhưglucan, mannoprotein cũng được giải phóng trong quá trình tự phân nấm men vàkích thích sự phát triển của vi khuẩn Các hợp chất này rất cần thiết cho sự sinhtrưởng và trao đổi chất của vi khuẩn malolactic trong vang, cụ thể:

‒ Các phân đoạn nitơ khác nhau sinh trưởng vi khuẩn malolactic: Hiện nayvẫn chưa có một kết luận chính thức nào về khả năng sử dụng và chuyển hóa cácloại peptide ở các vi khuẩn malolactic Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy

sự ảnh hưởng của các phân đoạn protein từ dịch tự phân nấm men trong môi trườngvang đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic Các nghiên cứu trênđều cho thấy, khi sử dụng các phân đoạn nitơ khác nhau gồm các phân đoạn cóphân tử lượng lần lượt là <0,5; 0;5 –1;0; 1 – 10; >10kDa thì các acid amin tự do vàđoạn peptide có phân tử lượng <1kDa có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của vikhuẩn rất tốt so với các phân đoạn có phân tử lượng lớn hơn gồm các đại phân tử

>10kDa và các đoạn peptide 1 – 10kDa (Feuillat và cộng sự, 1977; Benetier và Chassagne, 2003)

Guilloux-‒ Vai trò của hợp chất nitơ cao phân tử đối với hoạt tính enzyme thủy phânprotein của vi khuẩn malolactic: Nghiên cứu của Lonvaud-Funel và cộng sự (1988)lại cho thấy rằng các phân đoạn protein có phân tử lượng >12kDa cũng đóng vai trònhư một chất cảm ứng và góp phần quan trọng trong việc làm tăng hoạt tính của cácenzyme exoprotease của vi khuẩn malolactic Trên cơ sở đó, nghiên cứu của

Guilloux - Benetier (1993, 1995) đã cho thấy ảnh hưởng của các hợp chất cao phân

tử sinh ra từ quá trình tự phân của nấm men đối với sự sinh trưởng của vi khuẩnmalolactic Những chất này gồm các polysaccharide thành tế bào và các phân tửprotein Việc bổ sung các hợp chất cao phân tử từ dịch chiết nấm men vào canhtrường lên men malolactic có khả năng kích thích hoạt tính các enzyme

aminopeptidase ở Leuconostoc oenos Do vậy, vi khuẩn này có thể thủy phân được

các phân đoạn nitơ cao phân tử có trong vang ở cuối giai đoạn lên men chính Nhờ

đó, nó góp phần giúp rút ngắn pha thích nghi và làm tăng tốc độ tổng hợp sinh khốicủa vi khuẩn malolactic Nghiên cứu của Farias và Manca de Nadra (2000) cũng đã

làm sáng tỏ khả năng phân giải các phân đoạn protein ở vi khuẩn Leuconostoc

oenos có khả năng làm tăng hàm lượng các amino acid và peptide trong dịch lên

men rượu vang

c Sự ức chế nấm men bởi vi khuẩn Malolactic:

Sự có mặt của các chủng vi khuẩn malolactic hoạt động mạnh có thể khôngảnh hưởng đến nấm men ở pha sinh trưởng Nhưng đến giai đoạn suy vong, nó làmtăng tốc độ chết của nấm men do hình thành nên các chất ức chế hoặc làm cạn kiệtcác chất dinh dưỡng và các yếu tố sinh trưởng cần thiết của nấm men Do vậy, sự ứcchế nấm men bởi vi khuẩn malolactic chỉ có thể xảy ra ở giai đoạn cuối trước khikết thúc quá trình lên men chính Các nguyên nhân dẫn đến sự ức chế này có thểgiải thích theo các cơ chế sau:

‒ Cơ chế thứ nhất liên quan đến khả năng ức chế nấm men bởi các sảnphẩm trao đổi chất của vi khuẩn malolactic như propionate và acetate Ngoài ra sựsinh trưởng của vi khuẩn còn làm tổn thất một lượng đáng kể carbohydrate cần thiếtcho nấm men Từ đó làm giảm tốc độ sinh tổng hợp ethanol và ảnh hưởng đến chấtlượng sản phẩm

‒ Cơ chế thứ hai để giải thích cho khả năng ức chế nấm men của vi khuẩnmalolactic là chúng có khả năng phân giải thành tế bào nấm men nhờ enzyme β-1.3-glucanase (Guilloux-Benatier và cộng sự, 2000)

‒ Cuối cùng, sự hình thành các độc tố bacteriocin của vi khuẩn malolacticcũng được xem là một tác nhân gây ức chế nấm men (Yurdugul và Bozoglu, 2002).Tuy nhiên, khả năng này vẫn chưa được giải thích một cách rõ ràng.

1.2.6.4 Ảnh hưởng của điều kiện công nghệ và môi trường đến quá trình lên men malolactic

a Ảnh hưởng của pH

pH có ảnh hưởng rất sâu sắc đến sinh trưởng, phát triển, cũng như khả năng

phân giải acid malic của Leuconostoc oenos Đây là yếu tố quyết định đến tiến trình

lên men malolactic, pH tối ưu cho quá trình lên men malolactic tùy thuộc vào chủng

và môi trường nuôi cấy Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển cũng như phân giảiacid malic của các chủng vi khuẩn là rất khác nhau ngay cả trong cùng một loài Vi

khuẩn Leuconostoc oenos có thể phát triển được bắt đầu từ pH = 2,9 nhưng pH tối

ưu cho sự phát triển của chủng vi khuẩn này lại là 4,5 – 6,5 Sở dĩ vi khuẩn

Leuconostoc oenos chuyển hóa được acid malic thành acid lactic vì trong tế bào của

nó có chứa enzyme malolactic Do bản chất của enzyme là protein nên hoạt lực của

nó chỉ phù hợp với một số khoảng pH nhất định, nếu không sẽ xảy ra hiện tượngkeo tụ hoặc biến tính protein và sẽ dẫn tới mất hoạt lực enzyme

b Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thông thường nhiệt độ 200C là nhiệt độ tối ưu để lên men malolactic, tuynhiên trong quá trình lên men chỉ có ở các cơ sở có hệ thống cấp lạnh mới có thểđiều chỉnh được tương đối chính xác nhiệt độ này Chỉ một số ít chủng vi khuẩn cókhả năng lên men malolactic ở 150C, còn dưới 150C thì quá trình lên men malolacticrất khó xảy ra

Khi không có mặt SO2 trong rượu thì nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn malolactic

là 23 – 250C (lượng acid malic sẽ giảm thấp nhất khi nhiệt độ đạt 20 – 250C[Ribéreau Gayon và cộng sự, 1975] Tuy nhiên việc giảm lượng acid malic sẽ thíchhợp hơn với việc tăng nồng độ SO2 ở 200C

Bảng 1.3 Tốc độ phát triển vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ [6]

Thông thường nếu nồng độ cồn vượt quá 10%V thì quá trình lên men

malolactic sẽ bị ức chế một cách mạnh mẽ Nhưng Leuconostoc và Pediococcus thì

lại chịu được nồng độ cồn 12 – 14%V Khi nồng độ cồn vượt quá 15%V thì sự pháttriển của vi khuẩn không diễn ra nữa, tuy nhiên quá trình lên men malolactic vẫn cóthể xảy ra Như vậy cồn ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mạnh hơn là vàochính quá trình lên men malolactic, so với pH và nhiệt độ thì ảnh hưởng của nồng

độ cồn đến quá trình lên men malolactic là ít sâu sắc hơn

c Ảnh hưởng của SO 2 [2]

Trong sản xuất rượu vang người ta sử dụng SO2 để chống oxy hóa và khángkhuẩn vì SO2 có tác dụng ức chế một vài loại enzyme oxy hóa khử và ức chế sựphát triển của một số loại vi khuẩn lactic hay vi khuẩn acetic bất lợi Một phần SO2

ở dạng tự do, còn một phần chúng kết hợp với các cấu tử khác có trong rượuvang.Trong quá trình lên men cồn, SO2 kết hợp với nhiều chất khác, sau quá trìnhnày ảnh hưởng của SO2 lên vi khuẩn có giảm đi nhưng vẫn còn có những tác dụngnhất định Hầu hết các vi khuẩn acid lactic đều rất nhạy cảm khi nồng độ SO2 tự dođạt 10 – 20mg/l hoặc cao hơn

Thông thường nồng độ SO2 tổng số luôn được giữ ở mức thấp hơn 70mg/lđối với rượu đỏ và 40mg/l đối với rượu trắng Như vậy có thể nói rằng ngoài nhữngtác dụng quan trọng trong quá trình chế biến vang thì SO2 cũng lại là một chất ứcchế đáng kể quá trình lên men malolactic sau này Do đó, để quá trình lên men

malolactic thực hiện được một cách tốt đẹp thì cần phải sunfite hóa dịch lên menmột cách vừa phải để các vi khuẩn có lợi có thể sinh trưởng và phát triển được.

Tác động của một số nhân tố chính là: pH, nhiệt độ, độ cồn, hàm lượng SO2

đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos được thể hiện ở đồ

thị 2.10

Đồ thị 1.10 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình

lên men malolactic [7]

d Ảnh hưởng của ngồn nitơ [2]

Nguồn nitơ có ảnh hưởng khá nhiều đến sự phát triển của Leuconostoc oenos.

Tuy nhiên, trong quá trình lên men malolactic thì nguồn dinh dưỡng nitơ trong môitrường rất dồi dào do sau khi kết thúc quá trình lên men rượu, lượng nấm men cònlại trong vang non sẽ tự phân (do trong tế bào của chúng có chứa hệ enzyme thủyphân protein), nguồn nitơ tự phân của nấm men là một nguồn đạm rất lí tưởng cho

sự phát triển của Leuconostoc oenos.

e Ảnh hưởng của thành phần đường [2]

Đường cũng là một cơ chất quan trọng trong quá trình phát triển của vi khuẩn

Leuconostoc oenos Chúng chính là nguồn cung cấp carbohyrate cho các con đường

chuyển hóa của vi khuẩn Tuy không phải là cơ chất chính trong quá trình lên menmalolactic nhưng thành phần đường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng vàphát triển của vi khuẩn Theo kết quả nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh thì khi môitrường chỉ có fructose hoặc glucose làm cơ chất thì nhận thấy frutose có tác dụng

kích thích sinh trưởng mạnh hơn glucose

f Ảnh hưởng của acid malic và các acid hữu cơ khác [2]

Các acid hữu cơ chủ yếu trong dịch vang non là: acid malic, acid lactic, acidcitric Ngoài ra còn có lượng nhỏ các acid khác như: acid tartaric Các acid này ảnh

hưởng đến vi khuẩn Leuconostoc oenos như sau:

‒ Acid malic: là chất cảm ứng cho sự hình thành enzyme malolactic, vì vậytrong môi trường buộc phải có thành phần này Nếu chỉ xét về mặt sinh trưởng vàphát triển thì acid malic hầu như không có tác dụng gì trong việc kích thích sự sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos, kể cả hai dạng L và D, thậm

chí còn có tác dụng ức chế khi nồng độ vượt quá 10g/l Như vậy sự có mặt của acid

malic là cần thiết để làm chất cảm ứng nhằm thu được vi khuẩn Leuconostoc oenos

có hoạt lực malolactic cao nhưng chỉ trong giới hạn nồng độ cho phép để khônggây ức chế cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng, các nghiên cứu chothấy nồng độ acid malic cho hoạt độ malolactic của vi khuẩn cao nhất là 10g/l đốivới dạng D và 5g/l đối với dạng L

‒ Acid lactic: ức chế sự phát triển của Leuconostoc oenos.

‒ Acid citric và acid tartaric: hai acid này có trong quả và đi vào dịch lênmen vang Khi môi trường có fructose thì acid citric có tác dụng kích thích sự phát

triển của Leuconostoc oenos Khi môi trường có mặt glucose thì acid citric hầu như

không có tác dụng kích thích sinh trưởng Sự tiêu hao đường glucose phụ thuộc vàonồng độ acid lactic có trong môi trường, khi nồng độ acid lactic tăng lên thì lượngđường glucose tiêu hao sẽ giảm

1.3 Giới thiệu quá trình làm trong rượu vang

1.3.1 Mục đích của quá trình làm trong rượu vang [2]

Độ trong là một trong những đòi hỏi số một về chất lượng của rượu vang đốivới người tiêu dùng Hiện tượng đục là một dung dịch có mặt các tiểu phần và cácchất lơ lửng mà nó làm chệch ánh sáng từ hướng đi thông thường, nó là một nhân tốgây ảnh hưởng không tốt khi đánh giá chất lượng rượu vang Do đó, việc đo độtrong có liên quan đến việc xác định độ đục, nó phụ thuộc vào số lượng và kíchthước của các tiểu phần trong dung dịch lơ lửng Nhiều công trình nghiên cứu khoahọc đã kết luận rằng rượu vang có thể làm trong trong thời gian ngắn bằng việc loại

bỏ các tiểu phần này Mục đích chính của quá trình ổn định rượu vang là để đảmbảo độ trong được dài lâu và ngăn chặn quá trình lắng cặn Quá trình ổn định rượuvang bị ảnh hưởng bởi các điều kiện như: nhiệt độ, sự ôxi hóa hay ánh sáng nơi màrượu vang được tàng trữ Các cơ chế hóa học và sinh học gây ra đục hay lắng cặn vàcác quá trình xử lí hiệu quá để làm ổn định rượu vang trước khi đóng chai cũng đãđược nhiều nhà khoa học nghiên cứu

Quá trình lắng cặn tự nhiên là quá trình kết lắng các tiểu phần trong dung dịch

lơ lửng và sự hấp phụ của chúng trên các vách của thùng chưa rượu vang bằng tronglực Sau khi quá trình lên men malolactic, rượu vang có chứa các tiểu phần từ dịchquả, nấm men và vi khuẩn, các muối, các chất keo và các chất không kết tinh khác.Các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, ôxy, các chất tanin từ gỗ sồi cũng thúc đẩy hoặchạn chế quá trình kết lắng Việc làm trong rượu vang cũng có thể thực hiện bằngcách tách cặn, nhất là khi rượu vang được tàng trữ trong các thùng chứa có kích cỡnhỏ Quá trình lắng tự nhiên thường xảy ra rất nhanh trong quá trình sản xuất rượuvang đỏ và rượu vang trắng khô, nhưng lại chậm hơn trong các loại rượu vang trắngngọt

Còn quá trình làm trong bổ sung một chất với mục đích để tạo ra hiện tượngkết vông và lắng cặn trong vang non chưa ổn định [9] Để đạt được độ trong cầnthiết ổn đỉnh về mặt hóa lí, người ta thường bổ sung có chủ định các chất có khảnăng hấp phụ, các chất này có thể kết tủa một phần các thành phần hòa tan có mặttrong rượu vang, và thường được gọi là các tác nhân làm trong [8] Các chất này sẽgian giữ các tiểu phần gây đục và không ổn định trong rượu vang, do vậy mà rượu

sẽ ổn định và trong hơn Bằng cảm quan người ta có thể thấy rằng quá trình làmtrong có cả thay đổi tốt và xấu, tùy thuộc vào chủng loại và chất lượng của các tácnhân làm trong sử dụng thì rượu vang sẽ có vị êm dịu hơn hay sẽ có tác dụng ngượclại.

Một số thí dụ điển hình về hoạt tính của một số tác nhân làm trong:

‒ Loại bỏ tanin và các hợp chất polyphenol gây nâu hóa bằng các chất làmtrong có bản chất là protein như casein, isinglass, albumin và gelatin

‒ Hấp phụ protein rượu vang bằng đất trao đổi như betonite

‒ Loại bỏ các hợp chất mono- và poly- phenol phân tử nhỏ bằng các vậtliệu polyamide như là polyvinyl polypyrrolidone (PVPP) và nylon

‒ Loại bỏ các mùi không mong đợi của vang bằng sunphat đồng hoặc một

số chất khác

1.3.2 Một số tác nhân làm trong

Các tác nhân làm trong có thể được phân loại thành một trong các nhóm dướiđây:

‒ Các chất protein: casein, albumin, isinglass, gelatin

‒ Đất họa tính: các dạng bentonite và các loại khác

‒ Các polyme với các thành phần trơ hoặc pirridone: nilon, PVPP

‒ Các chất keo có khả năng hòa tan hạn chế: polysaccharide tự nhiên vàcác chất kết tủa ferroxyanide cùng các muối của nó

1.3.2.1 Các chất trợ lắng có bản chất protein

Mục đích của việc bổ sung các chế phẩm có bản chất protein vào rượu vangnhằm làm dịu và giảm tính chất se lưỡi của rượu vang, nó còn làm giảm màu bằngcách hấp phụ và kết quả các thành phần phenol và tanin Tất cả các loại protein nàyđều có bản chất tự nhiên và thường được sử dụng trong thực tế là các dạng tinhkhiết Bốn loại thông dụng nhất hay được áp dụng trong rượu vang là: casein,albumin, isinglass vả gelatin [8]

Gelatin là sản phẩm thủy phân các gân và da của động vật Nó được phân loại

như một dẫn xuất colagen và có trọng lượng phân tử lớn [8] Các gelatin tinh thể