BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢCNội dung báo cáo:Báo cáo thực tập bài 1, 3, 4, 5 và bài 9 hoặc bài 10.Mỗi tiểu nhóm báo cáo 1 bài, lớp có 3 nhóm lớn, gồm 24 tiểu nhóm.Tên của các thành viên trong nhóm, tiểu nhóm, nhóm thực tập ghi ở trang bìa.Báo cáo trên giấy A4, đánh vi tính font Time New Roman, size 13. Không cần bìa cứng.Nội dung bài báo cáo trình bày như sau:1. Tóm tắt lý thuyết (2 điểm): lý thuyết liên quan đến bài thực hành, không trình bày lại lý thuyết trong sách thực hành hay sách lý thuyết mà cần biên tập lại.2. Kết quả (6 điểm): trình bày kết quả thu thập trong quá trình thí nghiệm, không trình bày lại quy trình thí nghiệm và các bước tiến hành.3. Bàn luận (2 điểm): nhận định kết quả thực hiện, so sánh các thông số, liên hệ với các tài liệu liên quan.
Trang 2BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC
Nội dung báo cáo:
Báo cáo thực tập bài 1, 3, 4, 5 và bài 9 hoặc bài 10
Mỗi tiểu nhóm báo cáo 1 bài, lớp có 3 nhóm lớn, gồm 24 tiểu nhóm
Tên của các thành viên trong nhóm, tiểu nhóm, nhóm thực tập ghi ở trang bìa
Báo cáo trên giấy A4, đánh vi tính font Time New Roman, size 13 Không cần bìacứng
Nội dung bài báo cáo trình bày như sau:
1 Tóm tắt lý thuyết (2 điểm): lý thuyết liên quan đến bài thực hành, không trình bày
lại lý thuyết trong sách thực hành hay sách lý thuyết mà cần biên tập lại
2 Kết quả (6 điểm): trình bày kết quả thu thập trong quá trình thí nghiệm, không
trình bày lại quy trình thí nghiệm và các bước tiến hành
3 Bàn luận (2 điểm): nhận định kết quả thực hiện, so sánh các thông số, liên hệ với
các tài liệu liên quan
Trang 3Bài 1 Chọn lọc giống vi sinh vật
1.1 Tóm tắt lý thuyết
Các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật:
• Phân lập từ tự nhiên
• Gây đột biến
• Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn
• Bảo quản giống
Một số phương pháp phát hiện giống vi sinh vật có đặc tính mong muốn:
• Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzym
• Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật
1.2 Kết quả và bàn luận
1.2.1 Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease
a Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym
Protease ngoại bào
Trước khi nhỏ TCA 50%
Sau khi nhỏ TCA 50%
Gelatin 5
Trang 4Amylase ngoại bào
Trước khi nhỏ Lugol
Sau khi nhỏ Lugol
b Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
1 1.1 Amylase ngoại bào
- Khóm rìa răng cưa to: 1,3cm
Trang 53.2 Protease ngoại bào
- Khóm có răng cưa, đường kính 0,5cm.
- Khóm màu vàng, đường kính 0,1cm
- Khóm trắng đục, đường kính 0,1cm
*Mô tả khuẩn lạc gồm: hình thái khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc
** Ghi nhận đường kính vòng phân giải, hoặc đường kính vùng kháng khuẩn
1.2.2 Phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Bảng 2 Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh
a) Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzym.
Amylase ngoại bào
Trang 6- Sau khi nhỏ Lugol phát hiện:
+ Vòng sáng rõ tại môi trường phát hiện ống 4
+ Tại môi trường phát hiện ống 5 hầu như không có vòng sáng
+ Tại môi trường phát hiện ống 6 không có vòng sáng
Protease ngoại bào
- Vi sinh vật có sinh protease sẽ có vòng sáng quanh chỗ vi sinh vật mọc(gelatin bị phân giải nên không tạo tủa với TCA)
- Từ kết quả thí nghiệm cho thấy chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khiphân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ
có khả năng tiết protease ngoại bào
- Cụ thể: + Môi trường phát hiện ống 4>5>6 về khả năng sinh protease
+ Sau khi nhỏ TCA 50% cả 3 môi trường đều tạo vòng sáng quanhchỗ vi sinh vật mọc
Trang 7Bài 2: Đánh giá một số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic1.3 Tóm tắt lý thuyết
- Sinh vật probiotic là những vi sinh vật sống khi được cung cấp với sốlượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ
- Lựa chọn chủng probiotic dựa vào các yếu tố:
+ Tính an toàn
+ Lợi ích đối với sức khỏe
+ Sự tồn tại và phát triển trong ống tiêu hóa
+ Khả năng sản xuất trong công nghiệp
+ Khả năng sống và không bị biến đổi chức năng ở dạng sử dụng
+ Không gây mùi vị khó chịu
+ Phải đến được nơi có tác động
+ Khả năng thực hiện chức năng tại vị trí định cư
- Sau khi uống, probiotic đi qua dạ dày trước khi đến ruột non (pH acid tại
dạ dày dao động từ 1,5-6 sau ăn) Acid dịch vị và hoạt tính thủy phân củapepsin làm giảm đáng kể khả năng sống sót của probiotic Ngoài ra, acidmật và dịch vị tại ruột non cũng là một thách thức với probiotic => Ở bàithực hành này ta khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic (tế bàosinhdưỡng và bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) trong dịch vịnhân tạo ( ở các pH1 và 3) và dịch mật nhân tạo ( ở nông độ muối mật 0.3
và 0.5%)
1.4 Kết quả và bàn luận
1.4.1 Đánh giá đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic
a Hình ảnh của thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị và dịch mật nhân tạo
Khả năng chịu đựng dịch vị
• Tế bào sinh dưỡng
Pha loãng cấp 2 Pha loãng cấp 3
Đối chứng
Trang 10• Tế bào sinh dưỡng
Trang 12b Kết quả khả năng chịu acid dịch vị và dịch mật nhân tạo
Bảng 3 Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo*
Trang 14Bài 3: Tinh chế enzyme amylase bằng alginat1.5 Tóm tắt lý thuyết
- Tinh chế amylase là một khâu quan trọng trong sản xuất Có nhiều phươngpháp tinh chế Trong bài này, ta thực hiện bằng gel alginat
- Phương pháp tinh chế là phương pháp cố định enzym, theo cơ chế hấpphụ, amylase xem alginat cơ chất nên bám lên bề mặt các hạt gel, do đó cóthể lọc lấy amylase dễ dàng
- Xác định hoạt tính amylase được thực hiện bằng phương pháp Heinkel
1.6 Kết quả và bàn luận
1.6.1 Hàm lượng protein
Bảng 4 Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế
Mẫu OD280 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg)
Enzym thô 0,456 Vthô = 10 0,456x10x20 = 91,2
Enzym tinh chế 0,059 Vtinh chế = 20 0,059x20 = 1,18
1.6.2 Hoạt tính enzym
a. Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560
Bảng 2 Thông số đường chuẩn tinh bột
Trang 15560 560/91,2 = 6,14Enzym tinh
chế 0,852 0,671 10 0,199 x10x20 =39,8 39,8/1,18 = 33,73
Tính:
OD560 thô = OD560 chứng (thô) – OD560 thử (thô) = 0.864 – 0.348 = 0.516
OD560 tinh = OD560 chứng (tinh) – OD560 thử (tinh) = 0.852 – 0.671 = 0.181
Lượng tinh bột (mg) phân giải tính theo đường chuẩn : y = 0.9277x - 0.0035
xthô = (0.516 +0.0035)/0.9277 =>xthô =0.560 =>HTE(thô) = 0.560
xtinh = (0.181 +0.0035)/0.9277 = >xtinh =0.199 =>HTE(tinh) = 0.199
Hoạt tính tổng enzym:U = HTE x V x N
Hoạt tính riêng enzym : HTR = HTC/ lượng protein
Hiệu suất tinh chế:
Trang 161.6.3 Bàn luận
- Sau khi tinh chế, hoạt tính chuyên biệt của amylase tăng lên
- Hiệu suất tinh chế còn thấp (7,107%)
- Amylase bị thất thoát trong quá trình tinh chế, có thể do:
+ Thao tác chưa chính xác: amylase thôi chưa hết, khi lọc lấy dịchamylase còn sót trong tủa gel, đo quang không cẩn thận gây sai số….+ Thời gian tối ưu quá trình ủ chưa đúng
- Mức tinh chế giúp đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế Mức tinh chếtrên 1 là đạt yêu cầu và tốt nhất là trên 4 ( trong bài này mức tinh chế 5,49
là đã đạt yêu cầu)
Trang 17Bài 4: Cố định CGTase lên alginat1.7 Tóm tắt lý thuyết
- CGTase là enzym duy nhất chuyển hóa tính bột và các chất tương tự thànhhỗn hợp cyclodextrin
- Tinh bột CGTase chuyển hóa tinh bột β-Cyclodextrin
- Trong bài thực hành này, enzym được cố định bằng phương pháp hấp phụ
và bắt giữ
+ Nguyên tắc là cho enzym lẫn vào mạng lưới gel Ca-alginat, enzym cóthể bám trên bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong hạt gel (bắt giữ)
+ Đệm Tris-HCl pH=8 tạo môi trường ổn định cho enzym hoạt động tối
ưu Tránh dùng đệm phosphat vì gel alginat không bền
Tái sử dụng CGTase đắt tiền, tăng tính ổn định và hoạt tính enzym
1.8 Kết quả và bàn luận
1.8.1 Hàm lượng protein
a Đường chuẩn BSA
Bảng 1 Thông số đường chuẩn BSA
Trang 18Mẫu OD595 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg)Enzym ban đầu 0,7120 Vban đầu =1 0,298 x 10 x 1 = 2,98Enzym không CĐ
Theo đường chuẩn BSA (OD595nm), ta có :
Enzym ban đầu : OD595nm = 0,7120Theo đường chuẩn y = 1,0266x + 0,4057
0,7120 = 1,0266x + 0,4057
x =0,298Vậy nồng độ protein có trong mẫu là 0,298
Enzym không cố định theo bắt giữ : OD595nm = 0,8752Theo đường chuẩn y = 1,0266x + 0,4057
0,8752 = 1,0266x + 0,4057
x = 0,457Vậy nồng độ protein có trong mẫu là 0,457
Enzym không cố định theo hấp phụ : OD595nm = 1,054Theo đường chuẩn y = 1,0266x + 0,4057
1,054 = 1,0266x + 0,4057
x =0,631Vậy nồng độ protein có trong mẫu là 0,631
Trang 19ban đầu
1,8170 1,5830 ((2,422x10x30)/(1135x15))x1000=42,678 42,678/2,98 =
14,322Enzym
Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym:
Phương pháp hấp phụ: TLHT= (HTRenzym CĐ theo hấp phụ / HTR enzym tự
Trang 20c Nhận xét về hiệu suất cố định và và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym
- Hiệu suất cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ cao hơn 1,21 lần phương pháp hấp phụ
- Hoạt tính của enzym bị cố định theo bắt giữ cao hơn 1,87 lần so với hấp phụ
- Hoạt tính của enzyme bị cố định thấp hơn nhiều so với enzyme tự do
bị hấp phụ lên bề mặt của hạt gel
- Hoạt tính của enzym bị cố định theo bắt giữ cao hơn 1,87 lần so với hấp phụ
- Hoạt tính của enzyme bị cố định thấp hơn nhiều so với enzyme tự do, do lúc này enzyme đã bị gắn với chất mang nên sự tiếp xúc của enzym với cơchất bị cản trở về mặt không gian cũng như cấu trúc của enzym bị thay đổi, vì vậy khả năng gắn với cơ chất sẽ bị giảm
Trang 21Bài 5: Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực1.9 Tóm tắt lý thuyết
- Nguyên tắc: Dựa vào sự gắn thuận nghịch của một nhóm chức năng trênprotein với một nhóm chức năng trên pha tĩnh sắc ký Chỉ protein đíchmang nhóm chức năng đặc hiệu mới gắn vào pha tĩnh
- Là kỹ thuật sắc ký đơn giản và hiệu quả nhất để tinh chế protein
1.10 Kết quả và bàn luận
Đường chuẩn được sử dụng trong bài này là: y=1,0266x + 0,4057
1.10.1 Kết quả xác định hàm lượng protein
Bảng 1 Hàm lượng protein trong các phân đoạn
**Mẫu gộp D: là tổng lượng protein trong các ống D1 đến Dn
Nhận xét về hiệu suất tinh chế
Trang 22- Hiệu suất tinh chế 5,57% thấp và không hiệu quả, từ đó cho thấy trong mẫu D ( mẫu tinhchế) chứa rất ít protein cần phân tách.
- Hiệu suất tinh chế còn thấp và chưa đạt tuyệt đối là do:
o Chưa hoạt hoá tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắck ý
o Thao tác tinh chế chưa cẩn thận, cột chưa được nén chặt
o Thao tác bơm, hút dịch vào eppendoff chưa chính xác, ảnh hưởng đến kết quả
đo quang
o Các thể tích đo chưa chính xác ảnh hưởng đến kết quả nồng độ protein
Bài 6: Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion1.11 Tóm tắt lý thuyết
- Nguyên tắc: Dựa vào sự trao đổi thuận nghịch của các điện tích trênprotein với các điện tích trái dấu của pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằngion và pH trong dung dịch mà protein sẽ được gắn vào nhựa hay bị đẩy rakhỏi nhựa
- Là phương pháp được sử dụng phổ biến tinh chế protein
- Các loại nhựa trao đổi ion
• Theo điện tích : cation, anion
• Theo độ mạnh của nhóm mang điện tích trên nhựa: mạnh, yếu
• Theo bản chất của vật liệu mang: Matrix, dextran, agarose…
- Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion dựa trên cơ sở điểm đẳng điện pI(giá trị pH mà protein có tổng điện tích bằng 0):
+ pH > pI, protein tích điện âm
+ pH < pI, protein tích điện dương
1.12 Kết quả và bàn luận
Đường chuẩn sửa dụng trong bài này là đường chuẩn Bradford trong bài 4:
y = 1,0266x + 0,4057
1.12.1 Kết quả xác định hàm lượng protein
Bảng 1 Hàm lượng protein trong các phân đoạn
Mẫu
Trang 23**Mẫu gộp D: là tổng lượng protein trong các ống D1 đến Dn
Nhận xét về hiệu suất tinh chế
- Theo lý thuyết, A=B+C+D Nhưng thực tế, A>B+C+D
- Dịch B và C chứa nhiều protein tạp
1.12.2 Bàn luận
-Dịch B và C chứa nhiều protein tạp, lysozym trong lòng trắng trứng chứa ít protein
-Hiệu suất thấp có thể do:
Thao tác thực hành gây sai số: pha loãng và hút thiếu chính xác, sai số do dụng cụ,