Công nghệ enzym full

Phân lập: nghiên cứu kĩ các tài liệu về khả năng sinh enzyme cần tách chiết, sau đó tiến hàng phân lập từ đất, nước, không khí, từ một số thực vật, từ một số SP,… • Tuyển chọn: Từ bộ sưa tập giống của đơn vị, tỉnh, quốc gia nhằm tuyển chọn được chủng VSV có khả năng sinh trưởng nhanh, sinh TH enzyme cao, ổn định

Trang 1

Chuyên đề 4

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME

TS Bùi Xuân Đông, PhD in ingeneering

Trang 2

4.1 CN THU CHẾ PHẨM ENZYME TỪ VSV

Trang 4

A-PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, CẢI TẠO GIỐNG

Trang 5

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

• Phân lập: nghiên cứu kĩ các tài liệu về khả năng sinh enzyme cần tách chiết, sau đó tiến hàng phân lập từ đất, nước, không khí, từ một

số thực vật, từ một số SP,…

• Tuyển chọn: Từ bộ sưa tập giống của đơn vị, tỉnh, quốc gia nhằm tuyển chọn được chủng VSV có khả năng sinh trưởng nhanh, sinh TH enzyme cao, ổn định

Trang 6

CẢI TẠO GIỐNG VSV = TÁC NHÂN ĐỘT BIẾN

• Đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học:

- Dùng tia X (rownghen), tia , tia UV (hiệu quả

nhất)

• Đột biến bằng phương pháp SHPT:

- Biến nạp ADN: TB nhận tiếp xúc trực tiếp với dịch chiết TB cho, không cần tiếp xúc giữa các TB

- Tiếp hợp gen: AND được truyền đi từ TB cho đến

TB nhận khi 2 TB tiếp xúc với nhau

- Tải nạp ADN: được chuyền từ TB cho đến TB nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (Phage)

Trang 7

BIẾN NẠP ADN

Trang 8

TIẾP HỢP ADN

Trang 9

TẢI NẠP

Trang 10

B-NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Trang 11

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT

• Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

• Tiệt trùng

• Điều chỉnh hàm ẩm

• Gieo giống và điều khiển quá trình lên men

Ƣu, nhược điểm của phương pháp:

+Nồng độ enzyme thu được cao hơn phương pháp nuôi cấy chìm

+canh trường sau khi sấy khô vận chuyển dễ dàng

+tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường và tốn ít năng lượng

+ chiến diện tích nuôi cấy, TB làm việc gián đoạn, khó cơ giới hóa, năng suất thấp, tốn nhiều công lao động

Trang 12

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM

VSV phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng (C, N, muối khoáng và vitamin), có sục khí: sự tiết E vào môi trường xảy ra trong suốt quá trình lên men

• Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

• Tiệt trùng

• Điều chỉnh pH, t

• Cấy giống

• Lên men

• Ưu, nhược điểm:

- LM liên tục tiết kiệm được diện tích SX

- Dễ cơ giới hóa và tự động hóa, năng suất cao

- Nồng độ E trong canh trường thấp ->cô đặc->giá thành cao

- Tốn nhiều điện năng do sục khí Không đảm bảo được vô trừng tuyệt đối thì dễ xảy

ra sự tạp nhiễm toàn bộ khối MT

- Thường được áp dụng ở các nước đã phát triển

Trang 13

CÁC THÔNG SỐ CẦN KIỂM SOÁT

TRONG TB LÊN MEN

• Các thông số vật lý:

-Nhiệt độ: 2-10 6 kcal/giờ -> làm nguội TBLM

-pH: cần được điều chỉnh liên tục bằng điện cực nhậy và vô trùng (NaOH, KOH, amoniac, a phosphoric, a sulfuric)

- Bọt: do sục khí, khuấy đảo -> phá bọt, thu hồi bọt

- Oxy: khí cần được tiệt trùng và chọn tốc độ sục khí

• Các thông số sinh lý:

- Cân bằng năng lượng: làm lạnh, tận dụng Q ->lên men

- Áp suất CO2: có lợi với VSV yến khí (Bac Subtilis)/có hại

- Áp suất O2: có lợi cho lên men E coli và TH E penicillinacylase

- Cảm ứng, ức chế: ví dụ cellulase cảm ứng tốt với T vinide

- Khả năng trích ly: Tỷ lệ nucleotid cao sẽ làm tăng độ nhớt -> khó trích ly enzyme

Trang 14

C- TÁCH CHIẾT ENZYME TỪ VSV

Trang 15

PHÁ VỠ TẾ BÀO BẰNG SIÊU ÂM

- Tạo ra một áp lực lớn xuyên

qua dung môi và tác động đến

tế bào vật liệu

- Tăng khả năng chuyển khối

tới bề mặt phân cách phase

- Phá vỡ màng tế bào trên bề

mặt và bên trong khối vật liệu

giúp quá trình thoát chất tan

Trang 16

PHÁ VỠ TẾ BÀO BẰNG MÁY ĐỒNG HÓA

Trang 17

PHÁ VỠ MÀNG TẾ BÀO BẰNG CÁCH NGHIỀN HOẶC

KHUẤY VỚI CÁC BỘT/HẠT THỦY TINH/THÉP

- Bất kì kiểu sinh khối

nào dạng sợi hay đơn

bào đều có thể phá vỡ

bằng máy nghiền bi

dựa trên nguyên lí này

Trang 18

SỐC THẨM THẤU

• Có thể làm dung giải tế bào bằng sốc thẩm thấu khi cho một huyền phù đậm đặc các tế bào vào trong một môi trường ưu trương (20% saccarose) trong nước ở 40C, thì sẽ làm giải phóng ra một số hợp phần của tế bào

• Kỹ thuật này rất nhẹ nhàng, không làm biến tính các protein, song do có nhiều vi sinh vật chống chịu được sốc thẩm thấu, nên kỹ thuật này chỉ dành sử dụng cho các vi khuẩn gram âm (-) như

E.coli để trích ly các enzyme thủy phân có trong

xoang periplasmic (ngoại sinh chất)

Trang 19

XỬ LÝ KIỀM

• Xử lý kiềm (ở pH giữa 11,5 và 12,5) sẽ làm thủy phân màng tế bào và do đó sẽ giải phóng các enzyme

• Kỹ thuật này chỉ áp dụng nếu enzyme bền được trong môi trường kiềm ít nhất cũng từ 20-30 phút Người ta thường dùng phương

pháp này để trích ly Asparaginase từ Erwinia

chrysanthemi

Trang 20

SỬ DỤNG CHẤT TẨY RỬA

• Trong điều kiện pH, lực ion và nhiệt độ xác định,

các chất tẩy rửa ở dạng ion như laurylsulfatnatri hoặc như tween 20 và triton sẽ tổ hợp với

lipoprotein màng tạo ra các mixen do đó sẽ làm cho màng tế bào trở nên có tính thấm, song cũng làm biến tính enzyme

• Các chất tẩy rử như triton x-100 sử dụng riêng rẽ hoặc cùng với các chất khác như guanidine- HCl được dùng để trích ly các enzyme liên kết màng

rất có hiệu quả (cholesteroloxydase từ Nocardia

spescies)

Trang 21

DUNG GIẢI BẰNG ENZYME

• Lysozim thường thủy phân liên kết β (1-4) glucosid của các peptidoglucan vốn tạo ra độ cứng cho tế bào vi khuẩn gram dương và gram

âm

• Lysozim thường được liên kết với EDTA để tạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacrit và phá hủy tế bào đặc biệt là vỏ tế bào vi khuẩn gram (-)

• Kỹ thuật này chỉ được áp dụng ở quy mô nhỏ do các điều kiện thao tác tinh tế và giá thành lysozim cao

Trang 22

C2-CƠ CHẾ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZYME

Trang 23

KHÁI NIỆM TINH SẠCH ENZYME

CHẾ PHẨM ENZYME

ENZYME SẠCH (Chỉ chứa một loại enzyme)

ENZYME THÔ (nước, protein tạp, các tạp chất

và enzyme)

Khái niệm: Tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ

nước, các protein tạp, các tạp chất của tế bào hay môi trường nuôi cấy để thu được chế phẩm enzyme tinh khiết

Trang 24

CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ENZYME

Trang 25

PHƯƠNG PHÁP BIẾN TÍNH ENZYME

• Cơ chế: dựa trên sự tác động của nhiệt độ

điều kiện này enzyme không bền nhiệt và không chịu được pH “khắc nghiệt” sẽ bị biến tính

chịu được acid hoặc kiềm và bền nhiệt

Trang 26

KẾT TỦA BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ

Cơ sở khoa học: Khi thêm dung môi hữu cơ vào

dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch → làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân

tử protein → các phân tử liên hợp lại tạo thành kết tủa

Trang 27

LƯU Ý KHI LỰA CHỌN DUNG MÔI

• Dung môi cần phải hòa lẫn hoàn toàn với nước, và không liên kết với enzyme

• Ít ảnh hưởng tới hoạt động của

dụng

• Các loại dung môi thường dùng:

ethanol, acetone, izopropanol

Trang 28

LƯU Ý KHI LỰA CHỌN DUNG MÔI

 Kết tủa phân đoạn enzyme bằng cách thay đổi nồng độ dung môi

chiết của nấm mốc Aspergillus oryzae bằng ethanol: 66% (mantase), 73% (α-amylase và protease) và 79% (dextrinase)

 E khác nhau thì dung môi và điều kiện kết tủa không giống nhau:

Trang 29

ẢNH HƯỞNG NHIỆT ĐỘ LÊN QUÁ TRÌNH KẾT TỦA

- Khi trộn rượu và dung dịch enzyme kéo theo sự tỏa nhiệt, nhiệt độ tăng lên 10-15ºC → cần phải làm lạnh rượu tránh bất hoạt enzyme

- Trong công nghiệp nhiệt độ thích hợp để kết tủa 3-5ºC

→ dung dịch enzyme làm lạnh đến 1-3ºC còn dung môi -8 ÷ -12ºC TS Bùi Xuân Đông, PhD in ingeneering science 29

Trang 30

NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý KHI TỦA ENZYME BẰNG

- Thời gian kết tủa: ngắn tránh bất hoạt enzyme

→ dùng máy kết tủa liên tục

- Loại dung môi bằng cách cho bay hơi trong chân không hoặc trong không khí

Trang 31

SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THIẾT BỊ KẾT TỦA ENZYME LIÊN TỤC

môi; 3 , 4 – Lưu lượng kế kiểu con quay; 5 – Thiết bị trộn ;

6 – máy tách

Trang 32

KẾT TỦA BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ

• Ƣu điểm:

- Được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

- PP này có độ chọn lọc hơn tủa bằng muối

- PP này sản sinh ít chất kết tủa vô định hình → thu nhận bằng ly tâm thông thường

• Nhƣợc điểm:

- Enzyme có độ tinh sạch chưa cao

- Dung môi dễ gây biến tính enzyme

- Chế phẩm enzyme thu được thường hay có màu

Trang 33

KẾT TỦA BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH

Cơ sở khoa học: Phân tử protein, enzyme bền vững nhờ lớp vỏ nước (vỏ hydrat hóa) Khi nồng độ muối cao, chúng sẽ cạnh tranh, lấy đi lớp vỏ nước làm các phân tử protein liên hợp lại tạo thành kết tủa

Trang 34

PHƯƠNG TRÌNH COHN

 Độ hòa tan của protein, enzyme trong dung dịch muối

được biểu diễn theo phương trình Cohn

lgS = lgS 0 - k s μ

Trong đó:

dung dịch muối và nước

out)

- μ: lực ion của dung dịch muối

μ = 1/2∑m i •𝒁𝟏𝟐

Trang 35

Trang 36

KĨ THUẬT CHỌN LỰA MUỐI TRUNG TÍNH

 Loại muối thường dùng: (NH4)2SO4, Na2SO4, ZnSO4, NaCl trong đó thông dụng nhất là (NH4)2SO4

 + Thường dùng hai dạng muối: Dạng bột, Dạng

bão hòa

 Ưu điểm của (NH 4 ) 2 SO 4:

+ có độ hòa tan cao (720g/l ở 25ºC)

+ ít ảnh hưởng đến enzyme

+ rẻ và phổ biến

70% dd bão hòa; amylase của mầm lúa - 50% dd bão hòa

Trang 37

LƯU Ý KHI MUỐI VÀO DUNG DỊCH PROTEIN ENZYME

 Muối được cho vào từ từ, từng lượng nhỏ

 Khuấy đều, tránh tạo bọt

 Nhiệt độ thích hợp 20-30ºC

 Mỗi enzyme kết tủa ở nồng độ muối xác định

→ tách phân đoạn enzyme

Trang 38

CÁC BƯỚC KỸ THUẬT TỦA ENZYME BẰNG MUỐI

Trang 39

QUY TRÌNH TINH SẠCH LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI

ASPERGILUS NIGER

Trang 40

ƢU ĐIỂM : Phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như một bước cô đặc sớm, nhanh, đơn giản, không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể kết tủa phân đoạn nhiều enzyme

NHƢỢC ĐIỂM:

+ PP muối hóa có độ chọn lọc không cao

+ Độ tinh sạch chưa cao

+ Nồng độ (NH4)2SO4 cao nên tỷ trọng dung môi lớn, cần công đoạn loại muối

+ Kích thước hạt nhỏ (từ 0,5 đến 5μm) nên đòi hỏi lực ly tâm cao

Trang 41

KẾT TỦA ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN

Khái niệm điểm đẳng điện

Điểm đẳng điện (pHi) là giá trị pH mà tại đó tổng

số điện tích âm và điện tích dương của phân tử enzyme bằng 0

Cơ sở khoa học:

Tại điểm đẳng điện phân tử enzyme trung hòa điện

sẽ không chuyển dịch trong điện trường → phân tử

enzyme sẽ kém bền nhất → dễ kết tủa

Trang 42

 Mỗi enzyme có một giá trị điểm đẳng điện xác định

 Biết pHi của enzyme quan tâm hoặc protein tạp → kết tủa đẳng điện → lọc hoặc ly tâm để thu enzyme hoặc bỏ protein tạp

 Sử dụng các dung dịch đệm để đưa pH dịch chiết

về điểm đẳng điện

• Ƣu điểm: Dễ thực hiện, enzyme có độ tinh sạch

cao

• Nhƣợc điểm: Thực hiện ở quy mô nhỏ Thời gian

tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme

Trang 43

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ĐẬU HŨ

Quy trình công nghệ làm đậu phụ - Clip_vn_mp4_Output_1_(new_1).wmv

Trang 44

Ƣu điểm của PP:

- Đơn giản, dễ thực hiện

Nhƣợc điểm:

- Thực hiện ở quy mô nhỏ

- Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian

lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm

thay đổi hoạt tính enzyme TS Bùi Xuân Đông, PhD in ingeneering

Trang 45

CHƯƠNG 3

Kỹ thuật và phương pháp chung

I Những ưu điểm của vi sinh vật trong công nghệ sinh học

II Sơ đồ tổng quát và các công đoạn chính của quá trình lên

men công nghiệp

III Kỹ thuật và phương pháp cơ bản

3.1 Giống cho sản xuất

3.2 Dinh dưỡng và môi trường lên men

3.3 Hệ thống thiết bị

3.4 Khử trùng

3.5 Các phương pháp lên men

3.6 Vận hành quá trình lên men

3.5 Thu nhận sản phẩm lên men

I Những ưu điểm của vi sinh vật

trong công nghệ sinh học

- Vi sinh vật có tốc độ sinh sản mạnh, nhanh; chu kỳ

- Đưa DNA lạ vào dễ

- Mỗi tế bào VSV được coi như nhà máy sản xuất

hoàn chỉnh

II Sơ đồ tổng quát và các công đoạn

chính của quá trình lên men công nghiệp

Sơ đồ khái quát quá trình lên men

Trang 46

II Sơ đồ tổng quát và các công đoạn

chính của quá trình lên men công nghiệp

Một quá trình lên men, thường chia thành 3 công đoạn chính:

-Trước lên men (Upstream): Xử lí, chế biến, phối trộn và

khử trùng nguyên liệu ban đầu

-Lên men (Fermentation) trong nồi lên men được thông

khí tốt (cần phá bọt), trong dịch lên men diễn ra quá

trình truyền khối, truyền nhiệt, tăng sinh khối tế bào và

điều chỉnh hoạt tính sinh học để tạo nhiều sản phẩm

mục tiêu.

-Sau lên men (Downstream): Tách tế bào bằng li tâm hay

lọc, phải phá vỡ tế bào để giải phóng các chất nội bào;

tủa, tinh sạch các chất…; tận dụng phụ phế phẩm

III Kỹ thuật và phương pháp cơ bản

3.2 Dinh dưỡng và môi trường lên men

3.3 Hệ thống thiết bị

3.4 Khử trùng

3.5 Các phương pháp lên men

3.6 Vận hành quá trình lên men

3.5 Thu nhận sản phẩm lên men

3.1.1 Tạo giống VSV

3.1.2 Nâng cao chất lượng giống VSV

3.1.3 Bảo quản giống VSV

Trang 47

1 Tạo giống VSV (nhóm 1)

- Vai trò của giống

- Yêu cầu giống VSV

- Kỹ thuật tạo giống (pp tuyển chọn giống)

2 Nâng cao chất lượng giống VSV (nhóm 2)

- Tạo khả năng thích nghi với đk sx công

nghiệp

- Biến đổi hệ thống di truyền

3 Bảo quản giống VSV (nhóm 3)

- Pp cấy truyền

- Pp bảo quản trong đất hoặc cát

- Pp bảo quản giống trong hạt ngũ cốc

- Pp bảo quản giống dưới lớp dầu khoáng

- Pp đông khô

- Pp làm lạnh đông

- Đọc bài &

làm bài cá nhân

3.1.1 Tạo giống VSV

Vai trò

- Giống quyết định năng suất

- Giống quyết định chất lượng

- Giống quyết định vốn đầu tư cho nhà sx

- Giống quyết định giá thành sản phẩm

3.1.1 Tạo giống VSV

yêu cầu về chất lượng giống vi sinh vật sử

dụng trong công nghệ lên men

+ Giống phải tạo ra SP chính có năng suất cao, SP

phụ ít

+ Sử dụng được các nguồn NL rẻ tiền

+ Sau khi lên men dễ tách khỏi sinh khối

+ Là chủng VSV thuần khiết, không lẫn VSV khác

+ Có khả năng thích ứng & sinh sản mạnh

+ Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao

+ Dễ bảo quản & bảo tồn được đặc tính di truyền

trong suốt thời gian bảo quản & sử dụng

Trang 48

Phương pháp tuyển chọn giống

- Nguồn tự nhiên: chọn nguyên liệu dùng phân lập → phân lập

canh trường tập trung → Phân lập chủng thuần khiết

→Kiểm tra tính di truyền mong muốn → Tạo sự ổn định đặc

tính di truyền mong muốn.

- Nguồn giống sẵn có từ các cơ sở sx: giống vsv đang sx →

phân lập lại → kiểm tra tính di truyền → ổn định đặc tính di

truyền →Nâng cao đặc tính di truyền ( huấn luyện thích nghi

với đk lên men CN hoặc thay đổi cơ chế trong thông tin di

truyền)

- Nguồn giống từ các ngân hàng giống hoặc bảo tàng giống

+ Ưu điểm: có ngay giống thuần khiết với đặc tính cần thiết

được ghi chi tiết trong lý lịch giống do bào tàng cung cấp.

+ Nhược: nhiều đặc tính hoặc yếu tố kỹ thuật đòi hỏi những

đk khác với từng địa phương, từng nhà máy.

Tạo khả năng thích nghi với đk sx công nghiệp

Huấn luyện thích nghi của giống (thích nghi để giảm

giá thành sp…) theo từng bước

VD: Sacchromyces cerevisive: lên men cồn từ 18 – 24%

……

- - - Ngày 2

- - - Ngày 1

Duy trì tác nhân ảnh hưởng: là thành phần chất khô

Biến đổi hệ thống di truyền

Cổ điển

¾Pp lai: trao đổi tính di truyền trong 1 loài

¾Gây đột biến: bằng các tác nhân

Vật lý

Hóa học

Sinh học

Hiện đại: tái tổ hợp gen

Chuyển gen từ SV này sang SV khác

Định dạng
Số trang	93
Dung lượng	5,36 MB