SINH học PHÂN tử và tế bào

SINH học PHÂN tử và tế bào. Về ý nghĩa khoa học, có thể nói rằng, sự ra đời của công nghệ di truyền và những thành tựu đạt được đã tạo nên một cuộc cách mạng về nhận thức của con người đối với thế giới sinh học. Ngày nay, con người hiểu rõ hơn về các cơ chế di truyền và đang từng bước điều khiển chúng để tạo ra các chủng loại sinh vật có lợi cho con người. Về ý nghiã thực tiễn, công nghệ di truyền được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất liên quan đến nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược, bảo vệ môi trường,...

CHUYÊN ĐỀ:

SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TẾ BÀO

MỞ ĐẦU

Mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinhhọc, trong đó quan trọng nhất là acid nucleic và protein Vì vậy việc tìm hiểu,phân tích các đại phân tử là rất cần thiết Chúng ta có thể kết hợp phân tích cấutrúc, đặc điểm của các đại phân tử với sự phát triển các kỹ thuật và các côngnghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất các hợp chất thứ cấpdùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh

Di truyền học thực sự trở thành một bộ môn khoa học độc lập kể từ nhữngnăm 1900 - 35 năm sau ngày Mendel công bố công trình “Các thí nghiệm lai ởthực vật” Từ đó đến nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các nghành khoahọc khác như vật lý, toán học, hóa học, di truyền học đã và đang khám phá rấtnhiều quy luật về sự tồn tại và lưu truyền sự sống và trở thành một mũi nhọntrong nghiên cứu sinh học

Những thành tựu rực rỡ của di truyền học đã đem lại những nhận thứcmới về cấu tạo và sự vận hành bộ máy di truyền của cơ thể sống Cùng với sựphát triển mạnh mẽ của di truyền học, một lĩnh vực nghiên cứu mới của ditruyền học ra đời, đó là kỹ thuật di truyền Có thể nói, kỹ thuật di truyền là một

tập hợp của nhiều kỹ thuật như hóa học, sinh học phân tử, vi sinh vật học, mà

trong đó, vai trò hàng đầu thuộc về các tư duy và phương pháp của di truyền

Có rất nhiều kĩ thuật được ứng dụng trong công nghệ sinh học để nghiêncứu vật chất sống, như điện di, PCR, giải trình tự gen, phương pháp tạo thể độtbiến nhân tạo

Trong đó, điện di là một kỹ thuật rất hữu ích nhằm phân tích, xác định vàtinh sạch các đoạn DNA, RNA, protein dựa vào sự dịch chuyển của chúng trongmôi trường điện trường PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tửnhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm môphỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống Kỹ thuật này được sử dụng

rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khácnhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, chuẩn đoánnhững bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống Trong thuậtngữ di truyền học, xác định trình tự DNA là quá trình xác định trật tự nucleotidecủa một đoạn DNA Hiện nay, hầu hết mọi xác định trình tự DNA đều được

thực thi dùng phương pháp phân tách trình tự (chain termination method) Kĩ thuật này dùng phân tách trình tự cụ thể (sequence-specific termination) của một phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) dùng chất nền nucleotide

đã được chỉnh sửa

NỘI DUNG

A PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI

I Khái niệm và nguyên tắc chung:

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác độngcủa điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA,RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thựccủa chúng

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịchchuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng Protein có điện tíchthực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổinhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương

Hình 1: Nguyên tắc chung của điện di

Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn

đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặcpolyacrylamide gel Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá thể rắn (agarose hoặcpolyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất Kỹ thuật này sử dụng một dungdịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân

tử và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khiđiện di Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử

protein và các phân tử DNA có chiều dài <1kb, còn agarose gel phân tách hiệuquả các phân tử DNA và RNA có kích thước từ 20bp đến 20 kb.

II Các phương pháp điện di:

1. Điện di lòng dịch và điện di giấy:

Điện di trong lòng dịch: đã được Tiselius mô tả đầu tiên để phân chiaprotein huyết thanh vào năm 1939 Hiện nay, nó không còn được dùng nữa,nhưng vẫn còn được xem như một quy chiếu để đo độ di động điện di thực, vìkhông có dòng thuỷ động gây nhiễu và không có sự can thiệp của giá thể

Điện di giấy: Điện di trên giấy là phương pháp điện di thường được sửdụng để phân tích và phân giải các phân tử cỡ nhỏ Phương pháp này khôngđược sử dụng để phân giải các đại phân tử (ví dụ protein…) bởi vì sự hấp thụ vàsức căng bề mặt liên kết với giấy điện di thường làm thay đổi hoặc biến tính cácđại phân tử tạo ra độ phân giải kém

2. Điện di trên màng cellulose acetat:

Màng cellulose acetat là chất nền quen thuộc để phân chia protein huyếtthanh trong xét nghiệm ngày nay Chấm một lượng nhỏ huyết thanh trên màngcellulose acetat dới dạng một vạch nhỏ bằng bộ chấm mẫu chuyên dụng Sau khichạy điện di (khoảng 30 phút ở 230V) và nhuộm các protein, màng được làmtrong bằng sấy khô, rồi đọc kết quả trên máy đo mật độ (densitometor)

Hình 2: Kết quả phân chia protein trên màng và định lượng bằng

densitometor (bên trái là bản đồ điện di protein huyết thanh, bên phải là kết

quả định lượng bằng densitometor)

3. Điện di mao quản:

Đây là một phương pháp mới cho sự phân tích điện di và có ứng dụngngày càng nhiều trong nghiên cứu sinh hóa Tên của phương pháp đã giúp taphần nào đoán được nguyên lý hoạt động của nó, trong đó vật chất được phântích và môi trường điện di được đặt trong một ống mao dẫn mịn, dài (thôngthường dài từ 50 đến 100cm và đường kính trong từ 15 đến 100 μm) Một lượngm) Một lượngmẫu rất nhỏ (cỡ nano lít) được đặt tại một đầu của ống mao dẫn và chịu sự điện

di dưới trường tạo bởi điện áp từ 20 đến 30kV

Ưu điểm của điện di mao dẫn là nó cho độ phân giải cực cao, tốc độ và độnhạy cao đối với việc phân tích các mẫu rất nhỏ nhưng rõ ràng nó không thực sựhữu ích trong phương pháp chuẩn bị vật liệu (preparative) Nó thường sử dụngtrong việc phân tách các phân tử DNA có kích thước khác nhau chỉ mộtnucleotit đơn lẻ Bởi vì phương pháp điện di mao dẫn có độ phân giải rất cao,nên nó là cơ sở để phân tách các polynucleotide trong trình tự DNA kiểu mới.Phương pháp điện di mao dẫn cũng phù hợp với sự phân tách các phân tử khôngtích điện bằng cách thêm các vi hạt tích điện vào trong môi trường dung dịchđiện di Nếu hỗn hợp dung dịch hòa tan được ngăn cách giữa môi trường nước

và phần kỵ nước bên trong của vi hạt được đưa vào trong hệ thống này thì chúng

có thể được phân tách bằng phương pháp điện di Điện di mao dẫn là mộtphương pháp có tính linh động cao, phạm vi ứng dụng và phương pháp tối ưuhóa cho nó vẫn đang được nghiên cứu

4. Điện di trên gel:

Đối với phương pháp điện di trên gel, phân tử được phân tách trong hệđệm lỏng được hỗ trợ trong một chất nền polimer Hệ thống điện di trên gel cómột số ưu điểm rõ rệt Đầu tiên, chúng có thể thích hợp trên những mẫu lớn hơn

so với hầu hết các hệ thống điện di giấy, và cũng có thể sử dụng cho việc chuẩn

bị tỷ lệ xích (preparative scale) cho các đại phân tử Thứ hai là tính chất của chấtnền gel có thể thay đổi theo ý muốn để phù hợp với những ứng dụng cụ thể, bởi

vì gel làm tăng độ ma sát và điều chỉnh sự linh động điện di Rất nhiều tác nhândạng gel đã được sử dụng trong hệ thống điện di, trong đó gel agarose (polymerpolygalactose) được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt là trong ứng dụng với những

đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein v.v Gel polyacrylamide là một trongnhững tác nhân hữu ích và linh hoạt nhất sử dụng trong phân tách điện di bởi vì

nó dễ dàng giải quyết một loạt các protein và acid nucleic

4.1 Điện di trên gel agarose:

Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thànhphần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng30% Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốcxen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose Cấu trúc của agarosekhông đồng nhất: vừa tích điện vừa trung hòa Các chuỗi polymer liên kết chéovới nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùythuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá

Hình 3: Cấu trúc của agarose gel

4.1.1 Nguyên lí điện di agarose gel

Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách

ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hê ̣điện di trong một điện trường

có điện thế và cường độ ̣thích hợp Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gelphụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường Điện

di agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định

và tinh sạch các đoạn DNA Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp:

các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnhquang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.

4.1.3 Quy trình điện di trên gel agarose

4.1.3.1 Chuẩn bị agarose gel

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di , loại agarosedùng tốt nhất trong thí nghiệm là type -II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-

endoosmotic) Nó dễ dàng chảy ra và taọ thành một dung dịch trong suốt, kếtquả là gel đàn hồi thậm chí là ở nồng độ thấp Tuy nhiên , type-II-agarose dễ bịbẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa Sp còn ức chế các enzyme nhưligase , polymerase và RE Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thếphải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫuhoặc cơ chất cho các enzyme này.

Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vào 100 ml đệm 0,5 TAE vào

nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Nếu quá trìnhđun mất nước quá nhiều thì phải them nước cho đủ 100ml Để nguội khoảng 60

0C và đổ vào buồng điện di có cài sẵn lược Chiều dày gel khoảng 5mm là thíchhợp Sau 30 – 40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra

4.1.3.2 Đặt mẫu DNA vào giếng

Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độDNA cao hoặc thấp Chẳng hạn theo tỉ lệ sau:

DNA (1 Lg/1 µL ) : 1 L

Đệm màu bromophenol (x10 loading dye) : 1µL

Nước cất 2 lần: 9 µL

Tổng số : 11µL

Dùng micropipette hút 1µL dung dịch trên cho vào giếng

Thường đặt mẫu sau khi đã đổ dung dịch đệm 0,5 x TAE vào buồng điện

di cho ngập gel, ít khi đặt mẫu trước rồi đổ đệm sau Thường dùng micropipetteloại 20 – 200 µL và đặt vào buồng điện di trên bàn có nền đen Khi tăng điện thếcủa quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so vớicác đoạn nhỏ DNA dịch chuyển từ cực âm đén cực dương Quan sát sự dịchchuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di

4.1.3.3 Nhuộm DNA bằng EtBr

Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùngthuốc nhuộm huỳnh quang EtBr Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel rakhỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5µg/µL, trong thời gian 30 –

45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ độ (10 vòng/ phút) Đổ dịch nhuộm EtBrvào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hailần, mỗi lần 15-20 phút EtBr thường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ở

4 0C trong tối EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn Tuynhiên, ái lực (affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tươngđối thấp và có hiệu suất huỳnh quang không cao Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xenvào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở tronggel

Thường EtBr ( 0,5 µg/ mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứngnhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di Mặc dù tính linh động điện di củaDNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưngkhả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện dihoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gelkhông có ETBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong Gel đượcngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr ( 0,5µg/ mL) trong 45 phút ở nhiệt

a Khuôn đổ gel b Gắn lược và đổ

agarose gel vào khuôn

Hình 5: Sơ đồ các bước trong quá trình điện di agarose gel

4.1.3.4 Quan sát và chụp ảnh

Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ( = 302nm)

Dùng thiết bị chuyên dụng để lưu trữ hình ảnh DNA (Gel DocumentationSystem)

a b

Hình 6: Quan sát DNA dưới ánh sáng tử ngoại (a) và hình ảnh điện di

DNA trên agarose gel (b)

4.1.4. Một số phương pháp thu hồi DNA từ agarose gel

- Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp:

Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâmđược cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đếnnồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70 0C để hòa tan hoàn toàn trong đệm.Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/ chloroform và kết tủa Lưu ýDNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phươngthức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose

- Ly tâm:

Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệmchiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớpbông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 ml Cột nàyđược cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000

- 15.000 rpm trong 10 - 15 phút DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm

sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm Cho đệm rửa vào cột và rửa cộtvài lần bằng cách ly tâm nhanh Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNAvào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube Dung dịchDNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần Cũng có thể đông lạnh mẫugel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA

- Điện di vào bẫy:

* Cách 1: Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước củabăng DNA quan tâm Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện dinhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện

di có thể được kiểm soát bằng UV) Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết

bằng pipette

* Cách 2: sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trướcbăng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA - 45 Gel sau đóđược điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy

Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóngmẫu giấy tới 70 0C DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa.

- Dùng hạt thủy tinh

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI ở nồng độ khoảng

4 M Sau đó, các hạt thủy tinh được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quảvới các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI RNA, protein

và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh Tiếp theo, tiến hànhrửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệmmuối thấp Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại cóphạm vi tối ưu hẹp Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quảlắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau vàcác sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa

4.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng

- Kích thước của phân tử:

Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độdịch chuyển càng chậm Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ởcác tốc đô ̣tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng

- Nồng độ agarose:

Đoạn DNA mang kích thước khác nhau dịch chuyển ở các tốc độ khác nhauqua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau

- Cấu hình của DNA:

Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một khối lượngphân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau DNA của cácplasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng

có dạng mạch thẳng

- Thành phần base và nhiệt độ

Điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ bởi thành phầnbase của DNA hoặc nhiệt độ Trong agarose gel, tính linh động điện di tương

đối của các đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong khoảng 4– 30 0C Nói chung, agarose gel thường được chạy ở nhiệt độ phòng.

4.2 Điện di trên gel acrylamid

Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau:

Gel polyacrylamide được hình thành từ quá trình polymer hóa acryamide(đơn phân tử) và N,N&-methylene-bis-acrylamide Khi có mặt các gốc tự do,được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn định bởi TEMED (N, N, N' , N'-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi bắt đầu khi các acrylamidemonomer được polymer hoá thành một chuỗi dài

Khi bisacrylamide (N, N'-methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phảnứng polymer hoá, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel Độ xốp củagel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo Mức độ liênkết chéo sẽ xác định kích thước lỗ, từ đó phân tách các phân tử protein với kíchthước khác nhau Kích thước trung bình của các lỗ gel được điều chỉnh bằngcách thay đổi tỷ lệ acrylamide và bisacrylamide

4.2.1 Nguyên lí điện di trên gel acrylamid

Điện di trên gel acrylamid dùng để phân tách các phân tử protein, cácđoạn DNA , kể cả RNA và DNA/RNA Gel phải được rót vào giữa hai tấm kính

và được ngăn cách bởi các miếng đệm (gel spacers) để ngăn không chopolyacrylamide tiếp xúc với không khí Gel có thể dài từ 10-100cm tùy thuộcvào yêu cầu phân tích và chúng thường được chạy trong phương thẳng đứng Cóthể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau của polyacrylamide từ 3,5% - 20% tùy

thuộc vào kích thước của phân tử protein hhoặc đoạn DNA quan tâm Nồng độthấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tửlớn hơn Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể đượcđiều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel Điều này cho phép tối ưuhóa một khuôn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân

tử protein

Điện di polyacrylamide gel được dùng để phân tích và thu hồi các đoạnDNA có chiều dài từ 5 - 2.000 bp Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụngtrong khoảng từ 3,5 - 20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm.Hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là:

- Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân tách và tinh sạch cácđoạn DNA sợi đôi

- Polyacrylamide gel biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNAsợi đơn (kết hợp với urea và formamide) và phân tách và tinh sạch protein (kếthợp polyacrylamide với natri dodecyl-sulfat SDS)

Trong đó, polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụngnhất Hiệu quả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộc vào nồng độcủa acrylamide, kích thước và điện tích của DNA

4.2.2 Chuẩn bị

Thiết bị:

Hình 7: Cấu trúc thiết bị điện di polyacrylamide gel

4.2.3 Phương pháp điện di polyacrylamide gel không biến tính

4.2.3.1 Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính

Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20cm x 40cm Miếngđệm dày khoảng 0,5 mm - 2,0 mm Các gel dày hơn thường nóng lên trong quátrình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA , vì thế người ta thường sử dụngcác gel mỏng Tuy nhiên , khi khi chạy một lượng lớn DNA (> 1µg/băng) thìcần chuẩn bi ̣gel dày

c Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên

cơ sở kích thước tấm kính, độ dày miếng đệm

d Bổ sung 35 µL TEMED vào mỗi 100mL dung dịch tạo polyacrylamidegel, trộn hỗ hợp bằng cách vortex Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính,gắn nhanh lược vào, tránh bọt khí ở răng lược (giếng) Đỉnh của răng lược phảihơi cao hơn mép gel Nếu cần bổ sung một ít dung dịch tạo gel để làm đầy mépgel

e Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng,

bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel co vào nhiều

f Sau khi polymer hóa hoàn toàn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính khỏi đáykhuôn gel Gắn khuôn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm

1 x TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếngbằng đệm 1 x TBE

g Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm 6 x gel loading Dye Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe

-h Nối buồng điện di với bộ nguồn Polyacrylamide gel không biến tínhthường chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đến 8 V/cm Chạy gel cho đến khithuốc nhuộm chỉ thi ̣dịch chuyển đến vi ̣trí mong muốn Tắt nguồn, lấy khuôngel ra và đặt lên bàn Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra , tấm kính lớn ở phía sauđược dùng làm giá đỡ và chuẩn bị nhuộm gel

Hình 8: Các bước chuẩn bị điện di

4.2.3 Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel

4.2.3.1 Nhuộm bằng ethidium bromide

Ngâm nhe ̣gel trong dung dịch nhuộm (0,5µg/mL EtBr trong 1 x TBE) Sau

30 – 40 phút , lấy gel và tấm kính đỡ ra, cẩn thận thấm khô bề mặt gel bằng giấythấm Kimwipe Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap ), tránh tạo rabọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tửngoại Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr , do đó không thể

phát hiện các băng DNA bằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp hơn10ng.

4.2.3.2 Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc:

Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để phát hiện cho phép phát hiện mộtlượng protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleicacid (pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr

Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là:

- Dùng các dung dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm vàogel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde

- Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùngformaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiệnkiềm Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với cácgel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gelmỏng

Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau:

- Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sựkhuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ vàtrung hòa các hóa chất không mong muốn (urea và đệm)

- Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chấtbẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định

- Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cảithiện độ nhạy và độ tương phản Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút Tuynhiên, đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) chỉ cần 10 phút để có chấtlượng hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy

- Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kếttủa màu nâu trong quá trình phát triển màu

- Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L),sodium thiosulfate (4µM) và formaldehyde để giảm các background không đặchiệu một cách hiệu quả Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 oC, thời gian rửa thay

đổi tùy vào thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giâyđến vài phút.

- Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanhcàng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh 7,5%

4.2.3.3 Phóng xạ tự ghi:

DNA có thể được phát hiện bằng đồng vị phóng xạ 32P Cố định nucleic acidtrong acetic acid 7,5% Sau đó, tiến hành rửa gel trong nước khử ion Dùng giấythấm Kimwipe để thấm khô bề mặt gel Tiếp theo, đánh dấu phóng xạ và sấygel ở 80 0C trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ Ủ phim phóng xạ khoảng 24giờ

4.2.4 Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel

Phương pháp tốt nhất để phân lâp ̣ DNA từ polyacrylamide gel là kỹ thuậtcủa Maxam và Gilbert (1977)

- Ưu điểm của phương pháp:

+ DNA thu được có độ tinh sạch cao

+ Phân lập cả hia loại DNA sợi đôi và sợi đơn từ các polyacrylamide gelkhông biến tính và biến tính

Phương thức sau đây được cải tiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977):

- Chạy điện di polyacrylamide gel Xác định vị trí của DNA quan tâm bằngphóng xạ tự ghi hoặc bằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV

- Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm Không loại bỏ Saranwrap khỏi gel trước khi cắt, cắt cả gel lẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ

có chứa DNA quan tâm ra khỏi Saran wrap

- Chuyển gel vào trong E - tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette

để ép mảnh gel theo thành của tube

- Tính toán thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung 1 - 2 thể tích của đêṃchiết vào E - tube

- Đóng tube và ủ ở 37 0C kèm theo lắc vòng nhe ̣ Đoạn DNA nhỏ (<500bp)được dung ly trong khoảng 3-4 giờ, đoạn lớn hơn mất khoảng 12-16 giờ

- Ly tâm 12.000 vòng trong 1 phút ở 4 0C Chuyển thể nổi vào E-tube sạch.

- Bổ sung thêm 0,5 thể tích đệm chiết vào E - tube cũ có mảnhpolyacrylamide gel, vortex nhanh và ly tâm Trộn hai thể nổi lạivới nhau

- Bổ sung hai thể tích ethanol ở 4 0C, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30phút Thu hồi DNA bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở 4 0C

- Hòa tan trở lại DNA trong 200µL đệm TE (pH = 7,6) và bổ sung thêm 25

µL của 3M sodium acetate và kết tủa DNA

- Rửa cẩn thận tiểu thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đệm

4.2.5 Phương pháp điện di polyacrylamide gel biến tính

Làm biến tính các protein bằng cách đun nóng trong dung dịch chứa các chấtkhử (ᵦ-mercapto-ẹthanol) để cắt các cầu disulfua và một chất tẩy, natri dodecyl-sulfat (SDS)

SDS gắn với bề mặt protein làm cho chúng tích điện âm Sự di chuyển củaprotein trong gel acrylamid thực tế chỉ phụ thuộc duy nhất vào trọng lượng phân

tử của chúng Phương pháp này đơn giản, nhanh, chính xác và thực tế đượcdùng thay cho phần lớn các phương pháp lý học (siêu ly tâm phân tích, khếchtán ánh sáng…) trong xác định trọng lượng protein Gần đây, cetyl-triammon-bromua (CTAB) đã được đề nghị sử dụng thay cho SDS, vì nó tương đối giữ đư-

ợc hoạt tính sinh học sau khi điện di, còn SDS thì không

Hình 9: Sơ đồ tóm tắt điện di SDS‒PAGE

Trong quá trình điện di, hệ đệm điện di có vai trò là môi trường để duy trìdòng điện ổn định chạy trong gel Loại đệm điện di được sử dụng phổ biến nhấttrong SDS – PAGE là hệ đệm không liên tục Laemmli “Không liên tục” nghĩa

là loại đệm được sử dụng trong gel và trong bể điện di khác nhau Hệ đệmkhông liên tục Laemmli gồm lớp gel cô có pH = 6.8, lớp gel tách có pH = 8.8 vàđệm điện di ở pH = 8.3, trong đó lớp gel cô có nồng độ acrylamide thấp hơn sovới lớp gel tách

Hình 10: Hệ đệm không liên tục Laemmli

III Ứng dụng của phương pháp điện di:

1 Trong y tế:

 Điện di protein huyết thanh:

Là một cách để theo dõi, phát hiện bất thường trên xét nghiệm, chẳng hạnnhư mức độ protein tổng số/ albumin máu bất thường, protein nước tiểu mức độcao, nồng độ canxi cao, hoặc số lượng tế bào máu trắng hoặc đỏ máu thấp Khi các triệu chứng cho thấy một tình trạng viêm, bệnh tự miễn dịch, mộtbệnh nhiễm trùng cấp tính hoặc mãn tính, rối loạn thận hoặc gan, hoặc nguyên

Khi một bác sĩ đang điều tra các triệu chứng cho thấy đau tủy, chẳng hạnnhư đau xương, thiếu máu, mệt mỏi, gãy xương không giải thích được, hoặcnhiễm khuẩn tái phát, để tìm sự hiện diện của một dải protein đặc trưng(globulin miễn dịch đơn dòng) trong vùng beta hay gama, nếu một dải sắcnét được nhìn thấy, bản chất của một globulin miễn dịch đơn dòng sẽ được xácnhận bởi điện di immunofixation

 Điện di thuốc trị liệu

Tác dụng: chữa bệnh bằng cách đưa các ion vào cơ thể hoặc lấy các ionthuốc có hại ra khỏi cơ thể

Ví dụ: Muốn lấy một ion có hại (Ca++) ra khỏi cơ thể thì ta đặt điện cựctrái dấu vào vùng da nhiễm ion, điện cực đó sẽ hút các ion này ra khỏi cơ thể vềphía nó

Tác dụng của dòng điện một chiều:

+ Tác dụng giãn mạch: Làm tăng cường tuần hoàn và dinh dưỡng, tăngchuyển hóa chống viêm

+ Tác dụng lên hệ thần kinh: Tại cực dương có tác dụng giảm đau, giảm

co thắt, giảm trương lực cơ Tại cực âm có tác dụng kích thích làm tăng trươnglực cơ

+ Tác dụng của ion thuốc: Không gây tổn thương da, không gây lâytruyền các bệnh đường máu như khi tiêm.

2 Trong nông nghiệp:

Giúp phát hiện nhanh những tính chất nổi bật của lúa như mùi thơm,protein, amylose,…

Giúp các nhà chọn giống thực hiện công tác chọn lọc, tạo giống lúa thuần,giống lúa mới một cách nhanh nhất, rẻ tiền và hiệu quả cao

Chọn ra được dòng Nếp Bè 1-2 có chiều dài hạt dài hơn giống đối chứng,năng suất cao hơn 15% và hàm lượng protein trên 10%

3 Trong công nghệ sinh học:

 Điện di agarose gel có nhiều ứng dụng như:

Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứngcắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…)

Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tửhoặc in dấu di truyền…)

Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern,hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern

 Điện di được ứng dụng để kiểm tra độ tinh sạch và định lượng protein

Do tính đơn giản của phương pháp, điện di được áp dụng phổ biến đểđánh giá độ tinh sạch và định lượng protein Ví dụ, điện di được áp dụng phổbiến để theo dõi protein sạch hay không mà phép thử nghiệm enzyme không làmđược Ngay cả khi có một trắc nghiệm enzyme tốt đi nữa, ta cũng nên kiểm tracác mẫu protein bằng điện di trong quá trình tinh sạch protein bởi vì phươngpháp điện di cho phép chúng ta quan sát được các tạp chất có thể có

Dựa vào tính linh động khác nhau của hầu hết các protein mà điện dithường được dùng để ước lượng khối lượng phân tử của các chuỗi polypeptide

Để chuẩn độ thí nghiệm điện di, một số polypeptide có khối lượng phân tử đãđược biết trước được đem chạy điện di đồng thời với các chuỗi polypeptide chưabiết, và tính linh động tương đối Rf của mỗi loài được xác định Tính linh động

tương đối được tính bằng cách chia khoảng cách protein di chuyển cho khoảngcách của chất nhuộm di chuyển Chất nhuộm là một phân tử nhỏ mang điện tích

và có màu nên di chuyển nhanh hơn nhiều so với các protein Do chất nhuộm cómàu nên cho phép ta thấy được dấu vết của nó đi trước và từ đó ta tính được giátrị Rf ngay cả khi vệt dấu chạy không chính xác như nhau Đối với phân tíchnày điều quan trọng là không để vệt dấu ăn màu đi ra khỏi gel, nếu không takhông thể tính được giá trị Rf Với protein chuẩn nên có ít nhất năm loại proteinbiết khối lượng phân tử khác nhau để chúng tạo phân bố khắp trong gel để ta cóthể ước lượng khối lượng protein chưa biết của mẫu

 Phương pháp điện di mao quản nói chung và phương pháp điện di maoquản điện động học mixen nói riêng góp phần phân tích nhiều loại chỉ tiêu trongthực phẩm như đường, các aminoaxit, các peptide, chất béo, vitamin, các chấtphụ gia, các chất độc vi lượng cả vô cơ và hữu cơ

B PHƯƠNG PHÁP PCR

I Khái niệm:

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếchđại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương phápnày được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Phươngpháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn

ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụngtrong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh,xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biếnđịnh hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,…

II Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợpDNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân

số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động củaenzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với mộtmạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primernày được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựatrên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đượckhuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộmbằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đíchkhác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNAxác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt làtrình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt(trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3bước như sau :

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy củaphân tử (94 – 95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNAmạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạchkhuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.

Bước 2: (bắt cặp, annealing)

Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) củacác primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệmnhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 0C Tùy thuộc vào Tm của cácprimer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốtnhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vàoprimer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn nàytùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giâyđến vài phút

Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m × 2n

m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa

n: Là số chu kỳ

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thànhhai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từmột DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷbản sao

Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999)

III Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR:

2 Enzyme

Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối

nước nóng Thermus aquaticus Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến

tính Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường vớinhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn

3 Primer và nhiệt độ lai

Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thínghiệm PCR Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽmang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn Việc lựa chọnprimer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau: