Chuong 3. Goc tu do va chat khang oxy hoa

Sự oxy hóa trong hệ thống sinh học• Chúng ta sống trong điều kiện hiếu khí • Oxy là nguyên tố duy trì sự sống • Chúng ta sử dụng khoảng 3.5 kg oxy mỗi ngày • 2,8% oxy được sử dụng để tạo

CHƯƠNG 3 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA

Sự oxy hóa và sức khỏe con người

Một trong những điều nghịch lý của cuộc sống trên hành

tinh này là các phân tử duy trì cuộc sống, như oxy, không những là phân tử quan trọng cho sự chuyển hóa năng

lượng và hô hấp mà còn là nguyên nhân của nhiều bệnh và

sự thoái hóa

Marx, Science, 235, 529-531 (1985)

Tại sao phải học chương này?

Nếu tra từ “Antioxidants” từ internet…

• Sci-Finder 248,724 Articles (April 2012)

• Google Search 30,500,000 Web pages (April 2012)

• Chemical Abstracts 14,609 Publications (2011 alone)

Sự oxy hóa khử

▪ Có khả năng oxy hóa mạnh

▪ Có khả năng tạo chất oxy hóa mạnh (các kim loại chuyển tiếp)

Reactive Oxygen Species (ROS)

(Chất chứa oxy hoạt động)

Reactive Oxygen Species (ROS)

(Chất chứa oxy hoạt động)

Reactive Nitrogen Species (RNS)

(Chất chứa nitơ hoạt động)

Sự oxy hóa trong hệ thống sinh học

• Chúng ta sống trong điều kiện hiếu khí

• Oxy là nguyên tố duy trì sự sống

• Chúng ta sử dụng khoảng 3.5 kg oxy mỗi ngày

• 2,8% oxy được sử dụng để tạo các gốc tự do (free radicals)

• Nhiều kg peroxide (tổn thương sự oxy hóa lipid) được tạo

ra trong cơ thể mỗi ngày

Nguồn gốc nội sinh của ROS và RNS

NADPH oxidase

Xanthine Oxidase,

NOS isoforms

Fe Cu

Transition metals

Ty thể là nơi tạo ra ROS

Peroxisomes là nơi tạo ra ROS và RNS

Peroxisomes là nơi tạo ra ROS và RNS

Enzymes trong peroxisome sản sinh ROS

Schader & Fahimi, Histochem Cell Biol, 2004

NADPH oxidase là nguồn gốc của ROS

Chủ yếu trong neutrophil, macrophage

Prostaglandin H Synthase (PHS) là nguồn của ROS

xanthine oxidase xanthine oxidase

Dịch bào là nơi tạo ROS

NO•

Nitric Oxide Synthases (NOS):

neuronal nNOS (I)

endothelial eNOS (III)

inducible iNOS (II)

Lysosome là nơi tạo ROS và RNS

Myeloperoxidase (MPO)

Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh

Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh

Chức năng của gốc tự do

̶ Cần thiết cho sự tăng trưởng các cấu trúc tế bào

̶ Cần thiết cho hoạt động kháng khuẩn- Tế bào bạch cầu(phagocytes) phóng thích gốc tự do để phá hủy các tácnhân gây bệnh

̶ Có vai trò trong hệ miễn dịch

̶ Có vai trò trong quá trình sinh tổng hợp của tuyến tiền liệt

̶ Một số gốc tự do có vai trò trong tín hiệu tế bào

Lược sử: Tác hại của gốc tự do

• 1775 Priestly- Toxicity of oxygen to the organism similar

to burning of candle

• 1954 Gilbert and Gersham- Free radicals are important

player in biological environment and responsible for deleterious process in the cell

• 1969 Mc Cord and Fridovich- Superoxide theory of

toxicity

Tác hại của gốc tự do

̶ Gốc tự do phá hủy tất cả các đại phân tử quan trọng của

tế bào như proteins, carbohydrates, lipids và acid nucleic

̶ Sự phá hủy các thành phần tế bào khởi đầu cho nhiềutiến trình bệnh tật và sự lão hóa

Stress oxy hóa

• Mất cân bằng giữa gốc tự do

và hàng rào kháng oxy hóa cơ

thể (Stress oxy hóa) gây ra:

➢ Peroxid hóa lipid

➢ Biến đổi cấu trúc protein

➢ Tổn thương ADN

Sự lão hóa là con đường tất yếu của tổn thương oxy hóa

1956 Denham- Free Radical Theory of Ageing

Stress oxy hóa và sự tổn thương tế bào

• Liều cao:

trực tiếp gây tổn thương/ giết chết tế bào

• Liều thấp/tạo quá mức chất oxy hóa mạn tính:

hoạt hóa các lộ trình bên trong tế bào

kích thích sự tăng sinh tế bào

tổn thương proteins, DNA và lipid của tế bào

Free Radicals/Reactive Intermediates

Lipids Proteins DNA

Damage to Ca 2+ and other ion transport

systems

DNA damage

Cell Injury

Disruption of normal ion gradients

Activation/deactivation

of various enzyme systems

Altered gene expression

Depletion of ATP and NAD(P)H

Adapted from: Kehrer JP, 1993

Xơ vữa động mạch Cao huyết áp

Tim mạch

Alzheimer Parkinson

Thần kinh

Thận Suy thậnUng thư

Gan nhiễm mỡ Viêm gan

Nội tiết Hội chứng chuyển hóa

Đái tháo đường Cường giáp

ROS

Các căn bệnh liên quan đến gốc tự do

Điều gì xảy ra khi có sự peroxyde hóa lipid?

• Thay đổi cấu trúc màng

Thay đổi tính lỏng và các kênh trên màng tế bào

Thay đổi sự hoạt động của các protein gắn trên màng (tín hiệu) Tăng tính thấm của màng đối với các ion

• Sản phẩm của sự peroxyde hóa lipid có thể liên kết với cácchất khác → tổn thương chất

Ví dụ: proteins and DNA

• Sản phẩm của sự peroxyde hóa lipid có tính độc

Ví dụ: 4-hydroxynonenal toxicity

• Phá vỡ sự dẫn truyền các tính hiệu liên quan đến màng

• Tổn thương ADN và đột biến

Sự tổn thương lipid do ROS

• Lipid có khả năng bị oxy hóa rất cao

• Acid béo không bảo hòa (Polyunsaturated fatty acid(PUFA)) là thành phần tạo nên lipoprotein có tỷ trọngthấp trong máu (low-density lipoprotein (LDL))

• Malondialdehyde (MDA) là dấu sinh học (biomarker) củastress oxy hóa (sản phẩm của sự peroxyde hóa lipid)

• MDA phát hiện bằng TBA (Acid thiobarbituric)

Sản phẩm cuối cùng của sự peroxyde lipid

• Cơ thể tạo ra nhiều sản phẩm để kiểm soát sự peroxidehóa lipid như Vitamin E, và enzymes như SOD, catalase,

và peroxidase…

Sự oxy hóa các thiol protein (protein –SH)

Oxy hóa trung tâm hoạt động của protein

mất chức năng/ chức năng không bình thường

Sự hình thành các liên kết disulfide

liên kết protein-protein (RS-SR)liên kết protein-GSH (RS-SG)

biến đổi cấu trúc bậc 2 và bậc 3 của protein tăng sự phân hủy protein

Sự oxy hóa làm tổn thương protein

• .OH và RO. là nguyên nhân làm tổn thương protein

• Trực tiếp làm tổn thương protein bởi quá trình peroxidehóa, làm tổn thương những gốc acid amin chuyên biệt,làm thay đổi cấu trúc bậc 3, phân hủy và bẻ gãy cấu trúcprotein

• Không có cơ chế sửa chữa những protein bị tổn thương

• Những enzyme phân hủy protein đóng vai trò quan trọngtrong việc loại bỏ những protein bị tổn thương

Sản phẩm của sự oxy hóa protein

• Aldehydes, keto và các hợp chất carbonyl

• 3-Nitrotyrosine, được tạo ra bởi sự tương tác củatyrosine và ONOO-, là một chỉ thị sinh học cho sự oxyhóa gây tổn thương protein

• Những sản phẩm khác của sự tổn thương protein gồmhydroxyproline, glutamyl semialdehyde,

• Sự oxy hóa thường làm thay đổi cấu trúc protein nên dẫn đến thay đổi chức năng của protein.

• Sự oxy hóa thường làm bẻ gãy, bất hoạt hoặc tăng sự phân hủy protein.

• Mất hoạt tính enzyme

• Làm biến đổi chức năng nội bào như sự tạo năng lượng, can thiệp vào quá trình tạo nên tính hiệu năng của màng, thay đổi protein nội bào.

• Glycation của proteins (glycation là sự kết hợp của protein và đường → tạo ra những sản phẩm đẩy nhanh tiến trình lão hóa).

Sự tổn thương protein và bệnh tật

• ADN thường rất ổn định

• ROS, đặc biệt .OH, có thể tương tác với ADN và gây ranhiều dạng tổn thương ADN

• Sự biến đổi base của ADN, làm phá vỡ cấu trúc xoắn kép

và cấu trúc mạch đơn, mất base purine, làm tổn thươngđường deoxyribose, tạo liên kết chéo giữa ADN vàprotein

• Trong 4 loại base nitơ, guanine là base dễ bị oxy hóanhất

Sự oxy hóa làm tổn thương ADN

• Sản phẩm của sự oxy hóa guanosine như một phân tửdấu sinh học cho sự tổn thương ADN

Sự oxy hóa làm tổn thương ADN

• ROS trong tế bào dẫn đến tổn thương ADN, sự tổnthương này dẫn đến đột biến nếu không được sửa chữa

• Tổn thương ADN tạo nên những mã di truyền sai, quátrình tổng hợp ADN không được điều hòa, ảnh hưởngđến sự phân chia tế bào gây ung thư

• Sự hiện diện của 8-oxo-2-deoxyguanosine (oxo8dG)trong ADN là dấu sinh học quan trọng để xác định sự tổnthương ADN

• Sự tổn thương ADN là nguyên nhân của bệnh ung thư vànhiều rối loạn khác

Sự oxy hóa làm tổn thương ADN

• Số lượng “cú sốc” ADN/ tế bào/ ngày khoảng 100.000 ởchuột và 10.000 ở người.

• Sự tổn thương ADN là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnhnguy hiểm như ung thư, các bệnh do lão hóa…

Sự tổn thương ADN và bệnh tật

Tổn thương oxy hóa

Gốc tự do

Chất kháng oxy hóa là gì?

 Ngăn cản sự chuyển điện tử từ O2 đến phân tử hữu cơ

 Ổn định các gốc tự do

 Kết thúc chuỗi phản ứng của các gốc tự do

ANTIOXIDANT: a substance that is able, at relatively low concentrations , to

compete with other oxidizable substrates and, thus, to significantly delay or inhibit the oxidation of other substrates

Chất kháng oxy hóa là gì?

Chất kháng oxy hóa là chất (với nồng độ tương đối thấp), cókhả năng cạnh tranh với chất có khả năng oxy hóa chất kháclàm chậm, hoặc ức chế sự oxy hóa chất khác

Phân loại chất kháng oxy hóa

Ⅰ Dựa vào nơi chất kháng oxy hóa định vị

a) Chất kháng oxy hóa huyết tương (Plasma antioxidants)

– ascorbic acid (Vitamin C), bilirubin, uric acid, transferrin,

ceruloplasmin, β-carotene;

b) Chất kháng oxy hóa màng (Cell membrane antioxidants)

– α-tocopherol (Vitamin E)

c) Chất kháng oxy hóa nội bào (Intracellular antioxidants)

– superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione

peroxidase (GPx)

Ⅱ Dựa vào hoạt động và đặc tính tự nhiên

a) Chất kháng oxy hóa là enzyme (Enzymatic antioxidants)

– SOD, catalase, GPx, glutathione reductase

b) Chất kháng oxy hóa không phải enzyme (Non-enzymatic

antioxidants)

– Chất dinh dưỡng (Nutrient antioxidants)

β-carotene, α-tocopherol, ascorbic acid, – Chất chuyển hóa (Metabolic antioxidants)

bilirubin, uric acid, ceruloplasmin, ferritin, transferrin,

albumin, glutathione

Phân loại chất kháng oxy hóa

1 Superoxide dismutase (SOD)

2O2·⁻+ 2H+ SOD H2O2 + O2

SOD là hàng rào đầu tiên bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương của các superoxide.

Chất kháng oxy hóa là enzyme

SOD hiện diện trong hầu hết các tế bào trong cơ thể SOD

là một metalloenzyme với nhiều nhóm ngoại SOD thường

2 Catalase, CAT

2H2O2 Catalase 2H2O + O2

Catalase, enzyme phụ thuộc sắt,

hiện diện trong tất cả cơ quan của

cơ thể, nồng độ cao ở gan và hồngcầu Não, tim và cơ xương nồng độrất thấp

Chất kháng oxy hóa là enzyme

3 Glutathione peroxidase, GPx

GPx là enzyme phụ thuộc selenium

Enzyme tham gia trong các quá trình tạo năng lượng ở mức

độ tế bào, sự hoạt động của GPx phụ thuộc nồng độ hormone thyroid, chức năng hoạt động bình thường của ty thể, và lộ trình

pentose-phosphate

Chất kháng oxy hóa là enzyme

1 α-tocopherol (vitamin E)

Chất kháng oxy hóa hòa tan trong lipid quan trọng nhất

Hiện diện trong tất cả các màng của tế bào

Bảo vệ chống lại sự peroxide lipid

Chất kháng oxy hóa là chất dinh dưỡng

1 Vitamin E dự trữ trong các mô mỡ (adipose tissue)

2 Vitamin E ngăn chặn sự peroxide phospholipids và tránh

sự tổn thương màng tế bào thông qua hoạt động kháng

oxy hóa

1 α-tocopherol (vitamin E)

Chất kháng oxy hóa là chất dinh dưỡng

Là chất kháng oxy hóa tan trong nước.

Chất kháng oxy hóa bẻ gãy chuỗi phản ứng tạo ra chất oxy hóa, tác nhân khử hoặc cho điện tử. Loại bỏ gốc tự do và ức chế sự peroxide lipid Hoạt hóa sự tạo α-tocopherol.

+ 2O2·⁻ + 2H+ H2O2 +

Dehydroascorbate, DHA

2 Acid ascorbic (vitamin C)

Chất kháng oxy hóa là chất dinh dưỡng

Carotenoids là một chuỗi có 40C chứa các nối đôi liên hợp,

hấp thu ánh sáng mạnh và thường có màu đỏ, hoặc cam

Thường có ở vi khuẩn, tảo và thực vật bậc cao

3 Carotenoid

Chất kháng oxy hóa là chất dinh dưỡng

Giống vitamin, được tạo ra trong cơ thể hoặc cung cấp từ các nguồn thực vật và động vật khác.

Đóng vai trò quan trọng trong sự tái tạo các chất kháng oxy hóa khác như ascorbic acid, α-tocopherol và glutathione

4 Acid α-lipoic

Chất kháng oxy hóa là chất dinh dưỡng

Đóng vai trò như cơ chất trong phản ứng oxy hóa khử GSH, GSH loại bỏ (làm sạch) gốc tự do hydroxyl và oxy đơn (singlet oxygen) GSH có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa

xenobiotic

1 Glutathion (GSH)

Chất kháng oxy hóa là chất chuyển hóa

1 Uric acid Loại bỏ gốc tự do hydroxyl và các oxy đơn

2 Ceruloplasmin Ức chế sự peroxyde hóa lipid phụ thuộc đồng và sắt

3 Transferrin Ngăn cản sự tạo thành các gốc tự do phụ thuộc sắt

4 Albumin Loại bỏ các gốc tự do bề mặt

5 Bilirubin Bảo vệ albumin từ sự peroxyde

6 Haptoglobin Gắn với các Hb tự do và ngăn cản sự peroxyde lipid

2 Các chất kháng oxy hóa khác

Chất kháng oxy hóa là chất chuyển hóa

❖ Ức chế sự biến đổi nitrit thành nitrosamines (là một tác

nhân gây ung thư) và tăng cường sự đáp ứng miễn dịch

❖ Vitamins E, C, ubiquinones,… loại bỏ gốc tự do

❖ Trung hòa các gốc tự do giúp bảo vệ cơ thể khỏi tác

động của môi trường

Tại sao chất kháng oxy hóa quan trọng?

Hiện nay có hơn 4.000 chất kháng oxy hóa được phát hiện

“Mạng lưới kháng oxy hóa”

 Duy trì sự xúc tác của hàng rào kháng oxy hóa

 Chất kháng oxy hóa làm giảm sự khử (re-reduce antioxidants)

 Phụ thuộc vào tình trạng năng lượng của tế bào

 Glucose là chất kháng oxy hóa quan trọng nhất

ROOH ROH G-SeH G-SeOH

2 GSH GSSG

NADPH NADP +

glucose-6-phosphate 6-phosphogluconate

2 GSH GSSG

NADPH NADP +

glucose-6-phosphate 6-phosphogluconate

Ubiquinone

NAD(P)H NAD(P) +

Tocopherol Tocopheroxyl radical

LOO

LOO

Ascorbate Dehydroascorbate GSH GSSG Ubiquinol

Ubiquinone

NAD(P)H NAD(P) +

Giảm sự xúc tác của peroxide Giảm sự xúc tác của các gốc tự do lipid

• Sự cân bằng giữa sự sản sinh chất oxy hóa và kháng oxy

hóa rất quan trọng để duy trì sự sống của tế bào và chức năng sinh học

Sự cân bằng giữa oxy hóa và kháng

Stress oxy hóa là gì?

• Nếu có quá nhiều gốc oxy hóa được tạo ra và quá ít

chất kháng oxy hóa, được gọi là stress oxy hóa →nguyên nhân của nhiều bệnh

• Sự mất cân bằng giữa việc tạo ra nhiều gốc tự do và

khả năng bảo vệ tự nhiên của sinh vật

• Liên quan đến nhiều bệnh lão hóa như ung thư, đái

tháo đường, Alzheimer’s,…

• Stress oxy hóa thường rất ít thử nghiệm để đo

Phát hiện các gốc tự do

• Rất khó phân tích vì tính chất lý hóa, ví dụ như thời gian

bán rã ngắn…

Phát hiện sản phẩm cuối cùng của stress oxy hóa

• Đơn giản hơn, phạm vi sử dụng kỹ thuật sử rộng hơn

Biomarker (dấu sinh học) của stress oxy hóa

• Ức chế sự tạo thành NO· ( Nitric Oxide)

• Loại bỏ gốc tự do DPPH

• Ức chế sự hoạt động enzyme xanthine oxidase

• Loại bỏ các gốc anion superoxide

a Sự tạo thành các anion superoxide bằng enzyme (xanthine oxidase)

b Sự tạo thành các anion superoxide không bằngenzyme (hệ thống NADH/Phenazine methosulphate)

Vài thử nghiệm xác định hoạt chất

kháng oxy hóa in vitro

• Thử nghiệm độc tính gan bởi CCl4 (Carbon tetrachloride)

Một số phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của một chất

• FRAP assay (Ferric reducing-antioxidant power assay)

• Nguyên tắc khử Fe3+ của Fe3+-2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) thành Fe2+

• Hoạt tính kháng oxy hóa của một chất được đo bởi sự thay đổi ở bước sóng 593 nm

• ABTS+ radical cation scavenging assay

• ABTS (2,2’-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) + K2S2O8  ABTS.+

• ABTS.+ được hấp thu ở bước sóng 734 nm.

• Khả năng chống oxy hóa của một chất được xác định bởi tỷ

lệ giảm của độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 734 nm khi cho chất chống oxy hóa vào phản ứng

• Khả năng chống oxy hóa được xác định bởi % ức chế, IC50

• Hàm lượng chất kháng oxy hóa trong mẫu thử được xác

định tính theo đường chuẩn (trolox)

Một số phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của một chất

• LIPID peroxidation assay

• Phương pháp này được sử dụng để đo các lipid

Phương pháp khảo sát hoạt động làm sạch gốc tự

Đo độ hấp thu quang phổ

(OD) ở 517 nm

(Shirwaikar et al., 2006)

Khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số

(TAS assay) in vitro

+ 0,2mL H2O2 10mM

ủ 37C

60 phút

1 mL acid acetic 20% và TBA 0,8% trong NaOH

Khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số

(TAS assay) in vitro

Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số

in vitro theo mM Trolox

Cộng hưởng điện tử (Electron spin resonance: ESR)

 Phát hiện các nhóm gốc tự do có thời gian lưu tồn ngắn

 Phản ứng với thuốc thử bắt giữ gốc tự do  sản phẩmcộng hưởng bền vững (spin adducts)

 Hằng số bắt cặp của sản phẩm cộng hưởng  Cấu

trúc của gốc tự do

 DMPO (thuốc thử bắt điện tử): phát hiện các gốc tự do

ở trạng thái hoạt hóa

DMPO: 5,5-dimethyl-1-pyrroline N- oxide