Cùng với sự phát triển chung của ngành chăn nuôi, ngành chăn nuôi vịt ñang dần trở thành ngành sản xuất hàng hoá quan trọng, góp phần vào chương trình xoá ñói giảm nghèo cho nông dân. Hàng năm, nước ta tiến hành nhập nội hàng loạt các giống vịt cao sản và ñược nhân ra trên diện rộng, các giống này tuy có ưu ñiểm cho năng suất cao nhưng sức ñề kháng kém hơn rất nhiều so với giống vịt nội ñịa. Trong các bệnh diễn ra trên vịt, bệnh viêm gan vịt do virus là một bệnh truyền nhiễm hết sức nguy hiểm. Bệnh xảy ra cấp tính ở vịt con từ 1 - 6 tuần tuổi, lây lan nhanh, mạnh, tỷ lệ chết cao, có khi lên tới 100%, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi [2]. Hệ gen của virus gây bệnh viêm gan ở vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi ñơn dương, có ñộ dài khoảng 7.600 – 7.700 nucleotit, chứa duy nhất một khung ñọc mở ñơn, gồm 3 tổ hợp gen P1, P2 và P3. Tổ hợp gen P1 mã hoá cho các loại protein cấu trúc VP0, VP1 và VP3. Tổ hợp gen P2 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm protein 2A, 2B và 2C. Cuối cùng, tổ hợp gen P3 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm 4 loại protein là 3A, 3B, 3C và 3D. Trong ñó, ñặc biệt quan trọng là protein cấu trúc VP1, ñược mã hoá bởi ñoạn gen có ñộ dài 714 nucleotit. ðây là gen kháng nguyên, vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên vừa quyết ñịnh tính gây bệnh của virus. ðối với các chủng virus vacxin, việc xác ñịnh ñược mức ñộ tương ñồng với các chủng cường ñộc viêm gan vịt ñang lưu hành có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Vì vậy, việc so sánh vùng gen VP1 trong giám ñịnh sinh phân tử không những có mục ñích chẩn ñoán mà còn giúp tìm hiểu tương ñồng kháng nguyên, phân biệt ñược mức ñộ ñộc lực, cũng như xác ñịnh mức ñộ ñồng nhất về tính kháng nguyên của virus.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
- -
NGUYỄN LUẬN
XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ GEN VP1 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS VACXIN VIÊM GAN VỊT Ở VIỆT NAM VÀ SO SÁNH VỚI MỘT SỐ CHỦNG KHÁC
CỦA THẾ GIỚI
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành : THÚ Y
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS LÊ THANH HÒA
HÀ NỘI - 2008
Trang 2LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chưa từng ñược công bố hay bảo vệ trong một học vị nào
Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc
Hà nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008
Tác giả luận văn
Nguyễn Luận
Trang 3Lời Cảm Ơn
Sau thời gian học tập và nghiên cứu, ñến nay tôi ñã hoàn thành khoá học Nhân dịp này, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất ñến PGS.TS Lê Thanh Hòa - Trưởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), người thầy ñã tận tình hướng dẫn trực tiếp và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi ñược học tập, thực hành thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này
Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S ðoàn Thị Thanh Hương, Th.S Nguyễn Thị Bích Nga cùng toàn thể cán bộ Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn ñến sâu sắc tới toàn thể các thầy giáo - cô giáo trong Nhà trường, khoa Sau ñại học, Khoa Chăn nuôi - Thú y, ñặc biệt là các thầy giáo
- cô giáo ở Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành ñề tài
Xin chân thành cảm ơn Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã hỗ trợ kinh phí cho ñề tài nghiên cứu này
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các cơ quan, những người thân, gia ñình
và bạn bè ñã ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008
Nguyễn Luận
Trang 4MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan 1
Lời cảm ơn 2
Mục lục 3
Danh mục các chữ viết tắt 6
Danh mục bảng 7
Danh mục hình 8
1 MỞ ðẦU 10
1.1 Tính cấp thiết của đề tài……… 10
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài……… 11
1.3 Ý nghĩa khoa học của đề tài………11
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12
2.1 Bệnh viêm gan virus ở vịt (Duck Hepatitis)……… 12
2.1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh……… 12
2.1.2 Lồi mắc bệnh……… 13
2.1.3 ðường xâm nhập và cách lây lan……….13
2.1.4 Cơ chế gây bệnh của virus……… 14
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích……… 14
2.1.6 Chẩn đốn bệnh viêm gan vịt do virus……….16
2.1.7 Phịng chống bệnh………17
2.2 Một số đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt type I……… 18
2.2.1 ðặc tính nuơi cấy virus………18
2.2.2 Sức đề kháng của DHV-1………20
2.2.3 ðặc tính kháng nguyên của virus DHV-1………20
2.2.4 Biến dị của virus ……… 21
2.3 Sinh học phân tử và sơ đồ phả hệ virus viêm gan vịt type I ……… 21
2.3.1 Sơ lược về Picornavirus ……… ………21
2.3.2 Sơ lược về hình thái và cấu tạo virus viêm gan vịt type I………23
Trang 52.3.3 Sơ lược về phả hệ virus DHV-1……… ………25
2.4 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt ……….……… 29
2.4.1 Miễn dịch thụ ñộng ……….………29
2.4.2 Miễn dịch chủ ñộng ……….………30
2.5 Các kĩ thuật sinh học phân tử ……… 31
2.5.1 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ………31
2.5.2 Phản ứng RT-PCR ……….………32
2.5.3 Kĩ thuật ñiện di… ……….………32
2.5.4 Nguyên lí tách dòng và lưu giữ nguồn gen……… ………33
2.5.5 Tầm quan trọng của việc thu nhận, lưu giữ và nghiên cứu ñặc tính phân tử gen kháng nguyên VP1 của virus vacxin viêm gan vịt ñược sử dụng ở Việt Nam ……….……….………34
2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt trong và ngoài nước …………35
3 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
3.1 Nội dung nghiên cứu……… ……… 38
3.2 Nguyên liệu… ……… 38
3.2.1 Giống virus và chuỗi gen VP1….………….……… 38
3.2.2 Cặp mồi ………… ……….………39
3.2.3 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm……….………39
3.3 Qui trình thu nhận và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt…… 41
3.4 ðịa ñiểm thực hiện ñề tài ……… ……… 42
3.5 Phương pháp nghiên cứu ……… ……… 42
3.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số …….………42
3.5.2 Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR một bước.………43
3.5.3 Phát hiện sản phẩm RT-PCR ……… ………44
3.5.4 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR… ………….………45
3.5.5 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen ………45
3.5.6 Thực hiện phản ứng giải trình trình tự…….………49
3.5.7 Tinh sạch sản phẩm giải trình trình tự ….………50
Trang 63.5.8 Xử lý số liệu……….………51
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số……… ……… 52
4.2 Kết quả phản ứng RT-PCR ……… ……… 53
4.3 Kết quả dòng hóa và tách dòng sản phẩm……… ……… 54
4.3.1 Kết quả dòng hóa sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli ………54
4.3.2 Kết quả kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp ………56
4.4 Kết quả giải trình trình tự nucleotit và axit amin của gen kháng nguyên VP1 ở 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt……… ……….57
4.5 Kết quả truy cập ngân hàng gen, so sánh chuỗi gen kháng nguyên VP1 của 2 chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng khác trên thế giới… ……… 59
4.6 So sánh thành phần nucleotit và axit amin của gen VP1 giữa hai chủng virus vacxin ở Việt Nam và một số chủng trên thế giới……… ……… 62
4.6.1 Các chủng tham gia trong phân tích so sánh ………62
4.6.2 Kết quả ñối chiếu so sánh thành phần nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của VxAC và VxXT với các chủng khác trên thế giới ………63
4.7 Tỷ lệ tương ñồng nucleotit và axit amin giữa các chủng nghiên cứu …… 69
4.8 Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng virus nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác……… ……… 71
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74
5.1 Kết luận ……… 74
5.2 Kiến nghị……… ……… 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO 75
PHỤ LỤC 81
Trang 7CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DPV : Duck Picornavirus
DHV : Duck Hepatitis Virus
VxXT : Vacxin do Xí nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất VxAC : Vacxin có nguồn gốc ñưa về từ Ai Cập
DNA : Axit Deoxyribonucleic
RNA : Axit Ribonucleic
VP : Viral Protein
VPg : Viral Protein genome-linked
PCR : Polymerase Chain Reaction
RT-PCR : Revese Transcription - Polymerase Chain Reaction EDTA : Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid
dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate
ddNTP : Dideoxy Nucleotide Triphosphate
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase
TAE : Tris Acetic acid EDTA
LB : Luria Bertani-agar
UTR : Untranslated Region
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
cs : cộng sự
tr : trang
Trang 84.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi gen
VP1 của chủng virus vacxin xưởng thuốc (VxXT)
61
4.3 Các chủng virus viêm gan vịt sử dụng so sánh 62 4.4 So sánh tỷ lệ (%) tương ñồng về nucleotit (trên ñường chéo)
và axit amin (dưới ñường chéo) của hai chủng virus vacxin
viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng
trên thế giới thuộc DHV-1
70
Trang 9
DANH MỤC HÌNH
2.1 Tư thế chết ñiển hình ở trạng thái opistotonus của vịt bị nhiễm
virus viêm gan vịt (ảnh minh họa)
15
2.2 Gan vịt xuất huyết (ảnh minh họa) 15
2.4 Mô tả hệ gen và chuỗi polypeptit của virus viêm gan vịt 22 2.5 Cây phả hệ thể hiện liên quan của DHV-1 với 24 loại virus
thuộc 11 chi trong họ Picornaviridae Mối quan hệ ñược xây dựng dựa trên khoảng cách của cây phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về axit amin của phức hệ protein [60] Vị trí của nhóm virus viêm gan vịt (DHV 1) ñược chỉ dẫn bằng mũi tên
28
3.1 Sơ ñồ vị trí bám của mồi ñể thu nhận ñoạn DNA (~0.8kb) chứa
gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã gen VP1 của virus viêm gan vịt bằng cặp mồi DH3F-DH4R (ảnh minh họa)
39
3.2 Sơ ñồ qui trình nghiên cứu lưu giữ và phân tích vùng gen VP1
của virus viêm gan vịt
41
4.1 Kết quả ñiện di RNA tổng số ñược chiết tách từ mẫu VxXT và
VxAC trên thạch agarose 1%
52
4.2 Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR (~800 bp) của mẫu VxXT
và VxAC trên thạch agarose 1%
53
4.3 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp trên ñĩa thạch (LB-agar
1,5%) có chứa kháng sinh kanamycin và X-gal, bao gồm các khuẩn lạc xanh và trắng cần chọn lọc
55
4.4 Kết quả tách dòng vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt ñược
ñiện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, các sản phẩm DNA
56
Trang 10plasmid ñược kiểm tra bằng cách cắt với enzym EcoRI
4.5 Giản ñồ giải trình trình tự (chromatogram) thành phần nucleotit
của vùng gen VP1 virus viêm gan vịt của chủng VxXT Các nucleotit tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), khi ñọc bằng tia laze cho hiển thị Adenine có màu xanh lá cây (green), Thymine có màu ñỏ (red), Guanine có màu ñen (black)
và Cytosine có màu xanh nước biển (blue)
57
4.6 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của chủng virus
viêm gan vịt VxAC nghiên cứu
58
4.7 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của chủng virus
viêm gan vịt VxXT nghiên cứu
58
4.8 So sánh trình tự nucleotit gen VP1 của 2 chủng virus vacxin
viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới
64
4.9 So sánh trình tự axit amin vùng gen VP1 của 2 chủng virus
vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới
65
4.10 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu
(VxAC và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần nucleotit Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ
71
4.11 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu (VxAc
và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần amino acid Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ
72
Trang 111 MỞ ðẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI
Cùng với sự phát triển chung của ngành chăn nuơi, ngành chăn nuơi vịt đang dần trở thành ngành sản xuất hàng hố quan trọng, gĩp phần vào chương trình xố đĩi giảm nghèo cho nơng dân Hàng năm, nước ta tiến hành nhập nội hàng loạt các giống vịt cao sản và được nhân ra trên diện rộng, các giống này tuy cĩ ưu điểm cho năng suất cao nhưng sức đề kháng kém hơn rất nhiều so với giống vịt nội địa
Trong các bệnh diễn ra trên vịt, bệnh viêm gan vịt do virus là một bệnh truyền nhiễm hết sức nguy hiểm Bệnh xảy ra cấp tính ở vịt con từ 1 - 6 tuần tuổi, lây lan nhanh, mạnh, tỷ lệ chết cao, cĩ khi lên tới 100%, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuơi [2]
Hệ gen của virus gây bệnh viêm gan ở vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi đơn dương, cĩ độ dài khoảng 7.600 – 7.700 nucleotit, chứa duy nhất một khung đọc mở đơn, gồm 3 tổ hợp gen P1, P2 và P3 Tổ hợp gen P1 mã hố cho các loại protein cấu trúc VP0, VP1 và VP3 Tổ hợp gen P2 mã hố cho các loại protein phi cấu trúc, gồm protein 2A, 2B và 2C Cuối cùng, tổ hợp gen P3 mã hố cho các loại protein phi cấu trúc, gồm 4 loại protein là 3A, 3B, 3C và 3D Trong đĩ, đặc biệt quan trọng là protein cấu trúc VP1, được mã hố bởi đoạn gen cĩ độ dài 714 nucleotit ðây là gen kháng nguyên, vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định tính gây bệnh của virus ðối với các chủng virus vacxin, việc xác định được mức độ tương đồng với các chủng cường độc viêm gan vịt đang lưu hành cĩ ý nghĩa thực tiễn rất lớn Vì vậy, việc so sánh vùng gen VP1 trong giám định sinh phân tử khơng những cĩ mục đích chẩn đốn mà cịn giúp tìm hiểu tương đồng kháng nguyên, phân biệt được mức độ độc lực, cũng như xác định mức độ đồng nhất về tính kháng nguyên của virus
Mặt khác, các nghiên cứu gần đây về hệ gen và sinh học phân tử phân loại virus đều cho thấy virus viêm gan vịt thuộc về một nhĩm mới trong họ Picornaviridae; hơn nữa, đã cĩ biến đổi để tạo nên những genotype và serotype khác biệt [22], [36], [37], [61], [62], [60] ðồng thời, các nghiên cứu này cũng xác định
Trang 12virus viêm gan vịt không còn thuộc chi Enterovirus hoặc ít nhất ñã có những biến
chủng, khiến cho virus không còn có những ñặc tính vốn có trước ñây như virus viêm gan vịt cổ ñiển [22], [61] Tại Việt Nam, rất có thể virus viêm gan vịt cũng bị biến ñổi tạo nên genotype, serotype thuộc nhóm mới như các nghiên cứu nước ngoài ñã xác ñịnh Tuy có rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học và có rất nhiều chủng virus viêm gan vịt ñược phân lập nhưng chưa có nghiên cứu sâu sắc nào về ñặc tính sinh học phân tử, ñịnh hướng dịch tễ học phân tử trong phòng chống bệnh này Xuất phát từ nhu cầu cần có dữ liệu sinh học phân tử gen và hệ gen cũng như xác ñịnh vị trí phân loại của virus viêm gan vịt có mặt tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
“Xác ñịnh ñặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam và so sánh với một số chủng khác của thế giới”
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ðỀ TÀI
Với tên ñề tài nghiên cứu, mục tiêu của chúng tôi là:
- Giải trình trình tự vùng gen VP1 của các chủng virus vacxin hiện có mặt tại Việt Nam
- So sánh vùng gen VP1 của chủng virus vacxin thu ñược với một số chủng virus vacxin và cường ñộc khác trên thế giới ñể có thể xác ñịnh ñược mức ñộ tương ñồng giữa các chủng so sánh
- Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chủng virus vacxin này với các chủng virus viêm gan vịt của thế giới ñược thu nhận ñể so sánh
1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI
- Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử về chủng virus vacxin viêm gan vịt
ở Việt Nam
- Tạo cơ sở xác ñịnh tính tương ñồng về gen và axit amin giữa các chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng virus khác của thế giới ñể từ ñó giúp ích cho việc nghiên cứu vacxin phòng bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam
Trang 132 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 BỆNH VIÊM GAN VIRUS Ở VỊT (DUCK HEPATITIS)
Bệnh viêm gan vịt do một loại virus (Duck Hepatitis Virus – DHV) thuộc họ
Picornaviridae gây ra, có 3 type virus gây bệnh khác nhau, bao gồm type I (DHV-1), type II (DHV-2) và type III (DHV-3), phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt type I Bệnh có biểu hiện bệnh tích ñặc trưng: gan sưng, xuất huyết lốm ñốm trên gan [66]
2.1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh
Bệnh viêm gan do virus ở vịt ñược phát hiện lần ñầu tiên vào mùa xuân năm
1945 tại Mỹ bởi Levine và Hofstad [42], bệnh xảy ra trên ñàn vịt con một tuần tuổi nhưng chưa phân lập ñược mầm bệnh Levine và Fabricant theo dõi ñược bệnh này trên ñàn vịt trắng Bắc Kinh ở ñảo Long (Mỹ) vào năm 1949 và ñã phân lập ñược virus gây bệnh này vào năm 1950 bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà [43] Năm 1956, bệnh ñược phát hiện ở bang Massachusetts, Illinois và Michigan, sau ñó bệnh xảy ra trên khắp nước Mỹ Năm 1965, bệnh viêm gan vịt xảy ra ở Norfolk – Anh trên những ñàn vịt con ñã ñược tiêm phòng vacxin nhược ñộc viêm gan vịt type I Bằng phương pháp bảo hộ chéo trên vịt ñã phân lập ñược virus viêm gan vịt type II khác hẳn với virus viêm gan type I Virus type II chỉ gây bệnh ở Anh Năm 1968, virus viêm gan vịt type I ñã gây bệnh trên khắp thế giới trong ñó có một
số nước Châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc [64]
Trên ñảo Long (Mỹ), bệnh viêm gan vịt ñã xảy ra trên ñàn vịt con ñược dùng vacxin nhược ñộc type I, bệnh xảy ra nhẹ hơn so với bệnh viêm gan vịt của virus type I, tỷ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30% [58] Haider và Calnek ñã ñặt tên virus này là virus viêm gan vịt type III, và cho ñến nay, virus viêm gan vịt type III mới chỉ ñược công bố ở Mỹ [30]
Bệnh viêm gan vịt do virus type I ñã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong
ñó có Việt Nam
Ở Việt Nam, Trần Minh Châu và cs ñã nghi có bệnh viêm gan vịt do virus vào năm 1978 nhưng chưa phân lập ñược virus Từ năm 1979 ñến năm 1983, bệnh xảy
Trang 14ra ựã ựược ghi nhận làm chết nhiều vịt ở các ựịa phương như ở đông Anh - Hà Nội (1979 - 1980), ở Gia Lâm - Hà Nội (1983) ựã làm chết hàng ngàn vịt [9], [5]
Năm 2004, Nguyễn Phục Hưng qua ựiều tra 10 huyện thuộc 4 tỉnh và thành phố là Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh và Hà Tây, thấy bệnh xảy ra ở vịt con dưới 40 ngày tuổi, ựặc biệt bệnh xảy ra nhiều và có tỷ lệ chết cao ở lứa tuổi 1 - 7 ngày tuổi [11] Hàng năm, bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra thường xuyên Tuỳ từng thời ựiểm
mà bệnh xuất hiện ở các vùng ựịa lý khác nhau
2.1.2 Loài mắc bệnh
Trong tự nhiên, virus viêm gan vịt type I chỉ gây bệnh ở vịt con [1] Vịt trưởng thành bị nhiễm virus không có triệu chứng lâm sàng, không ảnh hưởng ựến sản lượng trứng Gà, gà tây và các ựộng vật khác không mắc bệnh Gia cầm non một vài ngày hay vài tuần tuổi vẫn có thể bị nhiễm bệnh, con vật có biểu hiện triệu chứng, bệnh tắch và có kháng thể trung hoà trong máu Gà con có thể bị nhiễm bệnh, bệnh thể hiện không ựiển hình và có thể truyền virus cho con khác [17]
Trong phòng thắ nghiệm, dùng virus viêm gan vịt type I gây bệnh cho vịt con bằng cách cho uống hoặc tiêm phúc mạc, vịt có bệnh tắch như gan sưng, xuất huyết lốm ựốm trên gan, túi mật sưng, lách sưng và có thể phân lập ựược virus từ gan 17 ngày sau khi cho uống
Các loài vật khác như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng, chó ựều không cảm thụ với bệnh
2.1.3 đường xâm nhập và cách lây lan
Trong ựàn vịt con bị bệnh, virus viêm gan vịt type I lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con khỏe, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao 100% Virus xâm nhập vào cơ thể qua ựường tiêu hoá, hô hấp, qua vết thương hoặc qua ựường miệng Có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ắt gặp Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng ựàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau ựó ắt ngày [43], [50], [52]
Bệnh viêm gan vịt không lây truyền qua ựường trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt [16] Ở những vịt khỏi bệnh, virus ựược
Trang 15bài xuất ra ngoài theo phân sau 8 tuần [52] Các loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, ñây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa [17] Ở vịt khỏi bệnh, virus ñược bài xuất qua phân ít nhất 1 tuần sau khi nhiễm bệnh
2.1.4 Cơ chế gây bệnh của virus
Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc ñường tiêu hoá, hô hấp hoặc vết thương rồi vào máu Theo máu, virus ñến các cơ quan phủ tạng ñặc biệt là gan, ñây
là cơ quan thích hợp nhất ñối với virus Quá trình ñược biểu hiện qua hai giai ñoạn:
Ở giai ñoạn ñầu, virus gây rối loạn trao ñổi chất ở gan, do quá trình trao ñổi
mỡ ở gan và ñặc biệt là quá trình trao ñổi cholesterol bị ñình trệ làm cho lượng glycogen trong gan giảm thấp nhưng lượng lipit lại tăng cao Vì vậy, vịt con ở thời
kỳ cuối của bào thai thiếu năng lượng dẫn ñến sức ñề kháng của chúng bị giảm sút Giai ñoạn thứ hai là giai ñoạn virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào nội
mô huyết quản, gây ra xuất huyết ñặc trưng Virus sinh sản trong tế bào gan, nhất là
tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kuffer Khi kiểm tra thấy tổ chức gan
bị phá hoại, cơ thể không ñược giải ñộc làm con vật chết do ngộ ñộc
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
2.1.5.1 Triệu chứng lâm sàng
Thời kỳ nung bệnh từ 1 - 5 ngày, ñôi khi kéo dài 8 - 13 ngày Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào ñộc lực của virus, liều lượng và phương pháp gây bệnh cũng như tình trạng cơ thể
Triệu chứng ñầu tiên xuất hiện sau 1 - 2 giờ mắc bệnh, gây chứng xanh tím niêm mạc, rối loạn vận ñộng, co giật, vịt chỉ ngồi, sau ñó nằm la liệt, nghiêng sườn
và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân (gọi là opistotonus), ñầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang bên sườn và vịt con thường chết ở tư thế này (hình 2.1) ðây là một trong những dấu hiệu ñặc trưng của bệnh Một số trường hợp thấy vịt bị ỉa chảy, phân loãng, triệu chứng này không phải xuất hiện ở tất cả vịt Bệnh kéo dài 2
- 3 ngày và có thể kéo dài hơn Khi ñã xuất hiện triệu chứng thì vịt ốm ít khi khỏi, phần lớn là chết Những con ốm không có triệu chứng lâm sàng sau khi khỏi bệnh
Trang 16sẽ hình thành kháng thể trong máu [11]
Hình 2.1 Tư thế chết ñiển hình ở
trạng thái opistotonus của vịt bị nhiễm
virus viêm gan vịt (ảnh minh họa)
Hình 2.2 Gan vịt xuất huyết (ảnh minh họa) Bệnh viêm gan vịt truyền nhiễm do virus có tỷ lệ chết biến ñộng từ vài phần trăm ñến 90% [15] Vịt mắc bệnh do virus viêm gan vịt type I gây ra thường xảy ra ñột ngột, thời gian nung bệnh ngắn chỉ trong vòng 24 giờ Vịt chết tập trung vào ngày thứ 2 - 3 - 4 sau khi mắc bệnh, tỷ lệ chết rất cao có khi lên tới 100% Farmer gọi bệnh viêm gan vịt là hội chứng thận thoái hoá mỡ và hoại tử tuyến tụy [25]
2.1.5.2 Bệnh tích
- Bệnh tích ñại thể
Bệnh tích tập trung chủ yếu ở gan (hình 2.2) Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ Một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin Bề mặt loang lổ do có nhiều ñiểm xuất huyết, xuất huyết lan rộng không có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ khác nhau Hiện tượng xuất huyết trên bề mặt gan không
có ở tất cả vịt chết Khi nhỏ bệnh phẩm vào niêm mạc mũi thì xuất huyết rất rõ ở gan Khi tiêm bệnh phẩm vào phúc mạc, các cơ quan khác ít bị tổn thương và càng
ít hơn khi gây ra bệnh qua ñường miệng Trong gan có thể gặp các ổ hoại tử do bệnh viêm gan bị biến chứng sang bệnh phó thương hàn Lách có thể sưng, thận tụ máu, hoặc lấm tấm xuất huyết
Tiêm chủng virus DH - EG - 2000 cho phôi gà 10 ngày tuổi thấy hiện tượng
Trang 17xuất huyết trên da Hiện tượng xuất huyết gan và phù phơi xuất hiện gần như đồng thời trên tất cả các phơi Ở những phơi cĩ biểu hiện xuất huyết trên da thường xuất hiện kèm theo hiện tượng phù phơi, bệnh tích xuất huyết gan cĩ lúc khơng xuất hiện cùng với xuất huyết trên da và phù Một số phơi khi mổ khám khơng thấy bệnh tích nào khác ngồi hiện tượng gan xuất huyết [11]
- Bệnh tích vi thể
Biến đổi vi thể của bệnh thường xuất hiện ở gan và đại não Gan cĩ những đám tế bào bị hoại tử, ống mật, viêm tăng sinh quanh mạch và viêm tăng sinh mơ thần kinh đệm, lúc đầu là những bạch cầu cĩ hạt sau đĩ là tế bào lympho và các tương bào Ở vịt con khơng chết cĩ sự tái sinh của các tế bào nhu mơ gan Sự tổn thương của tế bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan virus giống những tổn thương như ở viêm gan của người [23]
Quan sát biến đổi vi thể ở phơi gà 10 ngày tuổi chết do nhiễm virus viêm gan vịt type I (chủng DH - EG - 2000) thấy tế bào hạt của nhiều cơ quan tăng sinh, gan
cĩ các điểm hoại tử, tăng sinh ống mật, phù dưới da, khơng quan sát thấy các thể bao hàm trong tế bào Khi tiến hành làm tiêu bản vi thể thấy gan bị biến đổi, bè gan
và các tế bào gan sắp xếp lộn xộn, các vi huyết quản xuyên tâm giãn rộng chứa hồng cầu và tế bào viêm Cĩ hiện tượng xuất huyết lan tràn trong nhu mơ gan Tế bào lympho tăng sinh mạnh, cĩ thể tập trung thành từng đám lớn hoặc rải rác xen kẽ với những tế bào gan Một số tế bào gan mất đi phần nguyên sinh chất, chỉ cịn lại nhân, một số tế bào bị thối hĩa mỡ và thối hĩa khơng bào [11]
Tiêm virus viêm gan vịt type I vào xoang niệu mơ phơi vịt 10 - 14 ngày tuổi Sau khi tiêm 24 - 72 giờ phơi chết cĩ biểu hiện xuất huyết dưới da, gan xuất huyết và
cĩ nhiều điểm hoại tử Trong trường hợp vịt bị bệnh ở thể cấp tính, sau khi nhiễm virus 24 giờ thấy tế bào gan thối hố, hoại tử, trong tế bào cĩ các tiểu phần virus
2.1.6 Chẩn đốn bệnh viêm gan vịt do virus
Dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và diễn biến bệnh lý để chẩn đốn sơ bộ bệnh viêm gan vịt do virus và cĩ biện pháp xử lý kịp thời tại cơ sở chăn nuơi Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp diễn biến bệnh phức tạp nên việc chẩn
Trang 18đốn cịn dựa vào kết quả của các kĩ thuật chẩn đốn Mặt khác, bệnh được chẩn đốn thơng qua triệu chứng và bệnh tích điển hình khi tiêm mẫu bệnh cho phơi gà, phơi vịt và vịt con Ngồi ra, phương pháp nuơi cấy virus trên mơi trường tế bào một lớp gan phơi vịt cũng được sử dụng, virus gây ra hiện tượng co trịn và hoại tử
tế bào
Các phản ứng huyết thanh khơng được sử dụng trong việc chẩn đốn các ổ bệnh cấp tính Tuy nhiên, ngay từ thời gian đầu Levine và Fabricant (1950)[43] đã dùng phản ứng trung hồ cho các mục đích như: giám định virus, đánh giá miễn dịch đối với vacxin và điều tra về dịch tễ học Các phản ứng xét nghiệm thường dùng là phản ứng trung hồ trên phơi gà, trên phơi vịt hay ở vịt con Theo báo cáo của Malinovskaya thì phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) nhạy hơn phản ứng trung hồ [64], [45] Phản ứng trung hồ được sử dụng để định type viêm gan vịt type I [65] và dùng phản ứng bảo hộ chéo để phân biệt virus viêm gan vịt type I, type II và type III [29]
Hiện nay, các nhà khoa học đã nghĩ tới việc dùng kháng thể phịng bệnh và trị bệnh Năm 2001, cơng ty HANVET sản xuất kháng thể viêm gan vịt với liều phịng 0,5ml/con, liều điều trị 1ml/con, tiêm dưới da hoặc cho uống [13]
- Tiêm thẳng vacxin vào ổ dịch cũng cĩ thể khống chế được bệnh viêm gan virus ở vịt Việc khống chế bệnh bằng cách này dựa trên cơ sở của hiện tượng cản nhiễm trong miễn dịch chống virus của cơ thể sinh vật
Thực tế cho thấy, việc dùng vacxin cĩ hiệu quả hay khơng cịn phụ thuộc vào
Trang 19nhiều yếu tố như kháng thể truyền từ mẹ, thời gian vịt con tiếp xúc với virus cường ñộc viêm gan vịt Nếu vịt con sinh ra chưa có miễn dịch thì cần ñược tiêm phòng trong vòng 24 giờ ñầu, sau 4 - 7 ngày tiêm nhắc lại, mỗi lần tiêm là 0,5ml kháng thể lòng ñỏ hay kháng huyết thanh Ở ñàn vịt con ñược vịt mẹ truyền cho kháng thể, nếu bị nhiễm bệnh tự nhiên thì việc dùng vacxin sẽ kém hiệu quả Còn ñối với ñàn vịt con ñã sớm tiếp xúc với virus cường ñộc thì việc sử dụng vacxin sẽ không có hiệu quả Vì vậy, việc áp dụng các biện pháp vệ sinh thú y thích hợp và tẩy uế chuồng trại sẽ góp phần rất quan trọng trong việc giải quyết căn bệnh này
2.2 MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE I 2.2.1 ðặc tính nuôi cấy virus
Virus viêm gan vịt là loại kí sinh nội bào tuyệt ñối [8] ðể gây bệnh, cần sử dụng huyễn dịch các cơ quan của vịt con chết do bệnh viêm gan vịt (gan, phổi, thận…) ñã ñược xử lí bằng kháng sinh Có thể cấy chuyển virus viêm gan vịt trên ñộng vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào
2.2.1.1 Nuôi cấy trên phôi trứng
Tiêm bệnh phẩm vào màng nhung niệu, vào túi noãn hoàng cũng có hiệu quả như tiêm vào niệu nang [52]
- Trên phôi vịt: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 -
14 ngày tuổi Sau khi gây nhiễm 24 - 72 giờ, phôi chết với bệnh tích như phôi còi cọc, xuất huyết dưới da ñặc biệt ở vùng ñầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu
ñỏ hoặc hơi vàng, có thể có ñiểm hoại tử Những phôi chết muộn, nước xoang niệu
mô có màu xanh nhạt và có bệnh tích rõ hơn Ở phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước ối có màu xanh và gan bị xanh - ñen, những bệnh tích này ít thấy
Trang 20cấy liên tục trong 68 đời, hiệu giá virus duy trì ở mức độ 10-4 đến 10-6 [16] Như vậy, gây bệnh cho bào thai cĩ thể được sử dụng để chẩn đốn viêm gan do virus
Trong thiên nhiên, một số chủng độc với độc lực giảm ở những lần cấy truyền đầu tiên cĩ thể khơng gây chết phơi [16] Ở phơi gà chết và bị giết sau khi gây nhiễm 5 - 6 ngày đã phát hiện thấy xuất huyết nặng dưới da, phơi cịi và bị thuỷ thũng thành chất nhầy như gelatin Gan bào thai sưng, màu vàng - xanh lá cây hoặc màu xanh - đen, trên gan thường thấy các ổ hoại tử từng điểm hoặc từng vệt nhỏ xoắn lấy nhau hình thành từng đám như hình lưới hay cĩ nhiều điểm xuất huyết loang lổ Khi gây bệnh bằng chủng cĩ độc lực yếu cĩ thể khơng quan sát thấy sự kìm hãm phát triển của phơi thai [52]
2.2.1.2 Nuơi cấy trên mơi trường tế bào
Virus type I cĩ khả năng nhân lên trên nhiều loại tế bào như tế bào xơ phơi vịt,
xơ phơi gà, thận phơi vịt, thận phơi gà, gan phơi vịt, thận phơi ngỗng [32]
Trên mơi trường nuơi cấy, sau 8 giờ gây nhiễm cĩ thể quan sát thấy sự huỷ hoại tế bào (CPE - Cytopathogen Effect), đạt cực đại sau 2 - 4 ngày Sự huỷ hoại tế bào biểu hiện bằng những cụm tế bào co trịn, nguyên sinh chất đặc lại tạo khơng bào, tế bào vỡ ra rồi chết Dựa vào đặc điểm này để thể đánh giá hiệu giá virus Với việc cấy truyền virus lần thứ 25 trên tế bào thận phơi vịt, virus khơng cịn khả năng gây huỷ hoại tế bào trên tế bào thận phơi gà Năm 1972, Maiboroda và cs đã theo dõi sự phát triển của virus viêm gan vịt trên tế bào thận phơi vịt một lớp bằng kĩ thuật kháng thể huỳnh quang thấy virus gây biến đổi bệnh tích tế bào, hàm lượng virus cao nhất sau 2 ngày gây nhiễm [44] và kết quả ở tế bào thận lợn con cũng tương tự [64]
2.2.1.3 Nuơi cấy trên động vật cảm thụ
Virus viêm gan vịt cĩ khả năng nhân lên ở vịt con dưới một tuần tuổi Huyễn dịch bệnh phẩm chứa virus viêm gan vịt được tiêm dưới da, tiêm bắp, cho uống hoặc nhỏ mũi cho vịt Trong vịng 18 - 48 giờ sau khi gây nhiễm, thường dưới 24 giờ vịt thí nghiệm cĩ biểu hiện triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của bệnh
Trang 21Các loài ñộng vật khác như thỏ, chuột lang, chuột bạch, chó virus không có khả năng nhân lên
2.2.2 Sức ñề kháng của DHV-1
Virus viêm gan vịt thuộc loại virus không có vỏ bọc ngoài nên mẫn cảm với formalin, ñề kháng cao với ete và chloroform Trong ñiều kiện môi trường khắc nghiệt, virus có khả năng sống sót trong thời gian dài [66] Virus có khả năng tồn tại lâu bên ngoài môi trường; trong rơm lót chuồng, trong thức ăn, nước uống, virus có thể tồn tại từ 15 ñến 40 ngày Virus tương ñối ổn ñịnh ở nhiệt ñộ thấp, nhưng bị bất hoạt nhanh chóng ở nhiệt ñộ cao Ở nhiệt ñộ 4oC virus tồn tại ñược khoảng 2 năm
Ở 50oC trong 1 giờ không ảnh hưởng ñến chuẩn ñộ virus, nhưng phần lớn virus bị
vô hoạt ở 56oC sau 30 phút Ở nhiệt ñộ 37oC, virus viêm gan vịt tồn tại 21 ngày, khi cho virus tác dụng với dung dịch formalin 0,01% thì virus viêm gan vịt vẫn tồn tại ñược trong 8 giờ Ở nhiệt ñộ 15oC - 20oC, virus bị vô hoạt hoàn toàn bởi formaldehyde 1% hay NaOH 1% trong 3 giờ chloramin 3% trong thời gian 5 giờ [15] Theo Reuss (1959)[52], virus mất ñộc lực trong các ñiều kiện nhiệt ñộ phòng
từ 48 ñến 96 giờ Trong tủ lạnh, sức hoạt ñộng của virus tồn tại 120 giờ Ở nhiệt ñộ -20oC virus tồn tại ñược khoảng 9 năm Làm lạnh ñến -38oC, giữ ñược khả năng lây lan của virus trong 8 tháng hoặc lâu hơn [6]
Ở 56oC và 60oC, tuy virus kháng với tác dụng của ion Mg++ 1M nhưng khi không có mặt của cation này thì virus rất nhạy cảm với các nhiệt ñộ trên [62]
Virus viêm gan vịt có khả năng kháng trypsin và amonium sulphate Tế bào chứa virus có thể tồn tại ở pH = 3 trong 9 giờ Virus không bị vô hoạt bởi lysol 2%; creolin 15%, naphthalysol, xylonaphtha hay anhydrous sodium carbonat 20% Theo Haider, ở ñiều kiện có 5% phenol virus bị vô hoạt hoàn toàn [31] Trong tự nhiên, khi ñiều kiện vệ sinh kém virus có thể tồn tại ñược 10 tuần Trong phân ẩm virus sống ñược 37 ngày
2.2.3 ðặc tính kháng nguyên của virus DHV-1
Kết quả của phản ứng trung hoà huyết thanh cho thấy giữa ba type virus viêm gan vịt không có mối quan hệ kháng nguyên với nhau, không xảy ra phản ứng trung
Trang 22hoà chéo giữa virus viêm gan vịt type I với huyết thanh kháng virus viêm gan ở người và ở chó [60], [66]
Virus viêm gan vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của gà, vịt, cừu, chuột lang, thỏ, lợn Virus không ngưng kết hồng cầu khỉ khi thắ nghiệm ở pH
= 6,8 - 7,4; nhiệt ựộ 4oC; 24oC; 37oC
2.2.4 Biến dị của virus
Trong tự nhiên, kháng nguyên của virus viêm gan vịt type I thường không
ổn ựịnh, dễ bị biến dị [56] đã phân lập ựược các type virus biến dị ở Ấn độ, Ai Cập và chứng minh sự biến dị của virus type I bằng phản ứng huyết thanh học Vịt ựược miễn dịch với type I không ựủ bảo hộ khi công cường ựộc bằng chủng virus biến dị [55]
2.3 SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ SƠ đỒ PHẢ HỆ VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE I
2.3.1 Sơ lược về Picornavirus
Picornavirus là những virus có kắch thước nhỏ, xuyên qua ựược màng lọc Beckelfeld và Seitz [43] Qua kắnh hiển vi ựiện tử, virus là những hạt tròn bề mặt xù
xì, không có vỏ bọc, hệ gen chứa RNA sợi ựơn dương, khoảng 7100 - 9000 nucleotit Capsid có cấu tạo dạng khối ựa diện, ựường kắnh khoảng 27 - 30nm (hình 2.3)
Hiện nay, họ Picornaviridae gồm có 23 loại virus và ựược nhóm vào 9 chi, ựó
là Enterovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus,
Erbovirus , Kobuvirus và Teschovirus [57] Ngoài ra, ựã có giả thuyết nên nhóm 3 loại virus là Porcine Enterovirus 8 (PEV-8), Simian Virus 2 (SV-2) và Duck
Picornavirus (DPV) xếp chung vào một chi mới và dự kiến ựặt tên nhóm là
ỘSapelovirusỢ [40]
Trong họ Picornaviridae, tất cả virus ựều thiếu cấu trúc mũ hoá (methylation) ở ựầu 5Ỗ mà thay vào ựó là một protein nhỏ gọi là VPg (Viral Protein genome-linked) VPg này liên kết ựồng hoá trị với ựầu 5Ỗ thông qua một gốc tyrosin [20] Trong hệ gen của các virus có một vùng nucleotit làm ựiểm khởi ựầu ựể ribosome dịch mã, gọi
là IRES (Internal Ribosome Entry Site) đó là một cấu trúc di truyền hoạt ựộng phức
Trang 233D 3C 3B 3A 2C 2B 2A3 2A2 2A1 VP1 VP3 VP0
TỔ HỢP GEN P1
2
VPg
Protein cấu trúc
Protein phi cấu trúc
Poly A
tạp dạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi ñộng cho quá trình dịch mã không
phụ thuộc ñiểm mũ của hệ gen virus [19] Phần gen nằm giữa 2 vùng không dịch mã 5’UTR và 3’UTR (UTR - Untranslated Region), chứa ñựng một khung ñọc mở ñơn
có kích thước khá lớn, mã hoá cho một chuỗi polypeptit chung, có chiều dài khoảng hơn 2000 axit amin (hình 2.4)
Hình 2.3 Mô tả virus viêm gan vịt type I (ảnh minh họa)
Hình 2.4 Mô tả hệ gen và chuỗi polypeptit của virus viêm gan vịt (ảnh minh họa)
Ở chuỗi polypeptit chung, phần protein ký hiệu L (Leader Protein) là protein dẫn, tiếp ñó là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4(1A), VP2(1B), VP3(1C) và VP1(1D) ðoạn cuối cùng gồm 7 protein phi cấu trúc là protein 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D (hình 2.4) Tuy nhiên, giữa các chi khác nhau sẽ có sự thay ñổi nhỏ
Trang 24về trật tự sắp xếp này Chuỗi polypeptit chung của Picornavirus thường bị phân giải
bởi một, hai hoặc cả ba enzym protease là 3Cpro, 2Apro và Lpro thành 10, 11 hoặc 12
chuỗi polypeptit (thành 10 chuỗi polypeptit ñối với Kobuvirus và Parechovirus; thành 11 chuỗi polypeptit ñối với Enterovirus, Rhinovirus và Hepatovirus, hoặc thành 12 chuỗi polypeptit ñối với Aphthovirus, Cardiovirus, Erbovirus, Teschovirus
và nhóm PEV-8/SV2/DPV) [40] Số lượng chuỗi protein ñược tạo thành phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như sự có mặt hay vắng mặt protein L; số lượng protein 2A
và sự phân cắt hay không phân cắt VP0 thành VP4 và VP2 Phần lớn ở các virus trong họ Picornaviridae, VP0 là một loại protein ñược myristyl hoá (gọi là myristate), tức là ñược gắn thêm axit béo bão hòa gồm 14 cacbon tại vị trí Glycin theo qui luật (GxxxS/T) thông qua mối liên kết amid, từ ñó VP0 có thể tự phân tách thành protein VP4 và VP2 Hầu hết những virus trong họ Picornaviridae ñều có một
protein 2A, chỉ riêng Ljungan Virus có thể có 2 loại protein 2A [35]
2.3.2 Sơ lược về hình thái và cấu tạo virus viêm gan vịt type I
ðây là một Picornavirus nên có hình thái giống với hình thái chung Là loại virus có kích thước nhỏ, khoảng 20 - 30nm, không có vỏ bọc ngoài, có 32 capxome,
hệ gen chứa axit ribonucleic (RNA), sợi ñơn dương, có ñộ dài khoảng 7690 nucleotit, ở ñầu cuối 3’có thêm ñuôi ñuôi poly (A) dài khoảng 18 nucleotit
2.3.2.1 Thành phần hệ gen
Hệ gen chứa khoảng 29% Adenine, 23% Guanine, 21% Cystein và 28% Uracil Trong ñó, hàm lượng G + C chiếm khoảng 44% của hệ gen DHV-1 chứa duy nhất một khung ñọc mở nằm ở vị trí từ nucleotit thứ 625 ñến 7375 (Open Reading Frame: ORF), mã hoá cho một chuỗi polypeptit gồm khoảng 2249 axit amin gọi là protein chung [22] Tất cả các chủng DHV-1 ñều có cùng kích thước trong ñoạn ORF và ñầu cuối 3’UTR, nhưng chủng DRL-62 của DHV-1 thì lại khác, DRL-62 chứa ñựng 315 nucleotit ở ñầu cuối 3’UTR và có khác biệt về chiều dài ñầu 5’UTR [36], [60] Chuỗi protein chung ngay sau khi ñược tổng hợp, phải trải qua nhiều lần myristyl hoá, glycosyl hoá và phân cắt ñể tạo nên các protein sản phẩm ñộc lập
Trang 252.3.2.2 Cấu tạo hệ gen của virus viêm gan vịt type I (DHV-1)
Trình tự hệ gen của virus viêm gan vịt type I ñã ñược xác ñịnh với sự cấu tạo ñặc trưng của một Picornavirus, gồm có những vùng sau:
- Vùng không dịch mã ở ñầu 5’ (5’UTR - 5’ Untranslational Region): Là một vùng gen ñộ dài khoảng 625 nucleotit, không mã hoá nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình sao mã, tăng cường ñộc lực và tạo khung vỏ capsid DHV-1 cũng bị thiếu cấu trúc mũ ở ñầu 5’ mà thay vào ñó là một protein nhỏ gọi là VPg Ở ñầu 5’ DHV-1 có bộ mã khởi ñầu ñể bắt ñầu cho quá trình dịch mã, bộ mã này ñược ñặt ở
vị trí nucleotit thứ 627 của hệ gen Mặt khác, ñầu 5’ hệ gen RNA của DHV-1 chứa vùng gen làm vị trí cho ribosome ñi vào gọi là IRES [51], ñược ñặt ở trong miền Kozak tối ưu (GxxAUGG) [22], [39], tại vị trí nucleotit thứ 626 và ñược bao bọc trong một cấu trúc bậc hai [67] IRES ñược phân thành 4 loại dựa trên cấu trúc sơ
cấp và cấu trúc thứ cấp [19] Có một yếu tố hoạt ñộng duy trì ở dạng cis nằm ngay
cạnh yếu tố IRES là motif Yn-Xm-AUG Trong ñó, Yn là một vùng giàu pyrimidine, Xm là một ñoạn dài 15 - 25 nucleotit, theo sau là mã AUG Trình tự motif Yn-Xm-AUG ở DHV-1 là AUG-CA-AUG [60] Tại vùng 5’UTR hệ gen có
cấu trúc bậc hai tạo ra cấu trúc vòm khép kín (stem - loop) Những Picornavirus
type I không có cấu trúc hình “lá sồi” ở ñầu 5’UTR, do vậy, ñầu 5’UTR của DHV-1
có thể sở hữu một IRES loại II và cũng duy trì một bản sao thứ hai của cấu trúc tetranucleotit GNRA (RNRA2) [60], [62]
- Vùng không dịch mã ở ñầu cuối 3’ (3’UTR - 3’ Untranslational Region): Vùng này có ñộ dài khoảng 315 nucleotit, lớn hơn vùng 3’UTR khác của những
Picornavirus có nguồn gốc ñộng vật Mặt khác, ñầu cuối 3’UTR ở DHV-1 có thể
tạo ra năm cấu trúc RNA bậc hai, còn ñầu cuối 3’UTR của DPV (Duck
Picornavirus) chỉ có thể tạo thành 4 cấu trúc RNA bậc hai Vùng 3’UTR có vai trò
trong quá trình nhân lên của những Picornavirus [54]
- Protein L (Leader Protein): Trong họ Picornaviridae, protein L xuất hiện
trong 5 chi virus là Teschovirus, Aphthovirus, Erbovirus, Cadiovirus và Kobuvirus
Trong DPV, protein L có chiều dài khoảng 451 axit amin, lớn nhất trong họ
Trang 26Picornaviridae Có kích thước khoảng 67 axit amin (ở Encephalomyocarditis Virus)
ñến 219 axit amin (ở Equine Rhinitis B Virus) và sở hữu một motif GxCG có chức năng như enzym protease – trypsin [61]
- Protein 2A: Protein này có 3 phân ñoạn protein là protein 2A1, 2A2 và protein 2A3 ðây là một trong những ñặc ñiểm ñặc trưng của DHV-1 [62]
- Protein cấu trúc của DHV-1
Có 3 vùng protein cấu trúc gồm protein VP0, VP3 và protein VP1 Trong ñó, vùng VP1 có tính ổn ñịnh cao và có tính sinh miễn dịch, nằm trên bề mặt ngoài
cùng của tất cả các Picornavirus, chứa ñựng hầu hết những motif mà có chức năng
tương tác với thụ thể của tế bào và kháng thể trung hòa ñơn dòng [49] Trình tự protein VP1 này là khác nhau trong giữa các chi virus [62]
- Protein phi cấu trúc
Một số protein phi cấu trúc như protein 2C, 3C và 3D, chứa ñựng những motif ñặc trưng khác hẳn với những motif trong các protein ñã biết ở Picornavirus khác, gồm có motif GxxGxGK (S/T) - kéo dài từ axit amin thứ 145 ñến 152 và motif DDLxQ - từ axit amin thứ 192 ñến 196 trong protein 2C, những motif này có chức
năng như enzym helicase [26], [33] Motif GxxGxGK (S/T) cũng xuất hiện trong
protein 2A2 (GksGsGKS; axit amin thứ 6-13) Trong motif DDLxQ ở protein 2C, Leucin ñược thay thế bởi Phenyalanin
Ở DHV, motif GxCG ñược ñịnh vị tại axit amin thứ 142 - 145 (GSCG) của protein 3C, còn bộ ba xúc tác thì ñược ñặt tại vị trí H38-D69-C144 trong enzym 3Cpro Một số motif ñược bảo tồn ñặt trong protein 3Cpol là KDELR, PSG, YGDD
và FLKR [33], [40] Motif YGDD ñược ñặt ở vị trí axit amin thứ 281 - 320 trong protein 3Cpro, còn motif KDELR ở vị trí axit amin 150 - 154 và motif FLKR ñặt ở vị trí axit amin thứ 365 - 368 Trong motif PSG, Prolin ñược thay thế bởi Cystein tại axit amin thứ 280 - 282
Trong hệ gen DHV-1, vùng gen ñược quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là vùng gen mã hoá cho protein VP1, dài khoảng 700 nucleotit Vùng VP1 gây ảnh hưởng ñáng kể ñến sự biến ñổi về gen; về ñặc ñiểm hình thái và thích hợp cho
Trang 27quá trình phân tích sự phát sinh lồi của virus [47], [49] Vùng gen mã hố protein VP1 được chứng minh là vùng gen kháng nguyên, quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực của virus Những đột biến trong vùng gen VP1 dễ dẫn đến thay đổi thành phần axit amin và đặc tính gây bệnh của virus, từ đĩ cĩ thể hình thành ra biến chủng mới Với sự trợ giúp của phương pháp sinh học phân tử, vùng gen mã hố cho VP1 được chọn làm đích để phân tích, so sánh, chuẩn đốn các chủng virus cường độc viêm gan vịt, để giúp tìm ra những vùng hay thay đổi và những vùng khơng thay đổi, tìm hiểu những vùng gen tạo ra các axit amin độc lực Trên cơ sở các dữ liệu cùng với các phương pháp hiện đại sẽ
cĩ thể thay đổi vùng gen khơng mong muốn của virus, để tạo ra loại vacxin thế
hệ mới tốt nhất, tạo điều kiện cho cơng tác phịng bệnh đạt được kết quả cao
2.3.3 Sơ lược về phả hệ virus DHV-1
Với sự trợ giúp của các phương pháp sinh học phân tử, hệ gen của một số chủng virus viêm gan vịt type I trên thế giới đã được xác định Các nghiên cứu cho thấy virus viêm gan vịt là một loại virus thuộc họ Picornaviridae Trước đây, dựa
vào một số đặc tính của chúng mà DHV-1 được xếp vào chi Enterovirus trong họ
Picornaviridae [66] Tuy nhiên, những nghiên cứu trong những năm gần đây đang
cĩ nhiều tranh cãi về việc xếp virus này vào chi nào trong họ Picornaviridae cho thích hợp
Năm 2006, tồn bộ trình tự hệ gen (genome) của 2 chủng virus viêm gan vịt DRL-62 và R85952 đã được xác định Mặc dù virus viêm gan vịt type I trước đây
đã được phân loại như một Enterovirus dựa trên những nền tảng cơ bản về hình thái học và những đặc tính hố lý của hạt virus, nhưng khi so sánh 2 chủng DHV-1 với những virus khác thấy protein 2A1 của 2 chủng DHV-1 này cĩ mối liên hệ với
protein 2A của chi Aphthovirus và protein 2A3 giống với protein 2A của
Parechovirus Ngồi ra, các phân tích trình tự hệ gen của DHV-1 cho thấy virus cĩ
quan hệ gần gũi với các thành viên của chi Parechovirus hơn là chi Enterovirus
Tuy nhiên, cĩ sự tương đồng thấp giữa chủng DHV-1 với những họ hàng gần của
Trang 28chi Parechovirus, Ljungan Virus và Human Parechovirus Vì vậy, DHV-1 có thể
thuộc về một chi mới trong họ Picornaviridae [36], [37]
Năm 2007, trình tự hệ gen của 3 chủng virus viêm gan vịt type I khác cũng ñã ñược xác ñịnh [60], ñó là chủng virus phân lập ở Thái Lan (03D), chủng vacxin của
Mỹ (5886), chủng vacxin của Anh (H) So sánh sự tương ñồng về trình tự nucleotit
và trình tự các cặp axit amin với 2 virus ñiển hình HPeV- Human Parechovirus và LV-Ljungan Virus thuộc chi Parechovirus ñể xác ñịnh loài và ñịnh type cho virus
trong cùng một chi Tiêu chuẩn ñể xác ñịnh các virus thuộc cùng một chi ñó là tương ñồng về trình tự axit amin khoảng 34 - 35% và có khoảng 44 - 55% sự tương ñồng về trình tự nucleotit Tỷ lệ tương ñồng về trình tự các cặp axit amin và nucleotit trong vùng gen VP1 giữa DHV-1 với LV ñạt khoảng 23,0 ñến 24,6% (axit amin) và khoảng 26,0 ñến 28,8% (nucleotit) Tỷ lệ này trong phần VP1 giữa DHV-1
và HPeV là khoảng 23,8 ñến 26,7% (axit amin) và khoảng 26,1 ñến 31,0% (nucleotit) Trong khi tỷ lệ tương ñồng về trình tự axit amin và nucleotit giữa HPeV
và LV là khoảng 33,9 ñến 39,6% (axit amin) và khoảng 31,3 ñến 40,1% (nucleotit)
Do ñó, DHV-1 không ñược thừa nhận xếp vào trong cùng một chi chung với HPeV
và LV Ding và Zhang ñã ñề nghị xếp virus viêm gan vịt vào một chi mới trong họ Picornaviridae (Hình 2.5) [22]
Cũng trong năm 2007, hai chủng virus viêm gan vịt type I ñã ñược xác ñịnh,
ñó là chủng DHV - C80 và chủng vacxin ñược tiếp truyền trên phôi gà của Trung Quốc Chủng DHV-C80 có tỷ lệ G+C khoảng 44%, tương ñối giống so với những
Parechovirus (42% ñối với Ljungan Virus) và Teschovirus (45% ñối với Porcine
Teschovirus 1) Chuỗi protein của DHV-C80 có tỷ lệ tương ñồng khoảng từ 11 ñến
28% so với 9 chi trong họ Picornaviridae, với Parechovirus tỷ lệ này tương ñối cao
(khoảng 26 ñến 28%) Vì vậy, DHV-1 có thể thuộc một nhóm mới trong họ
Picornaviridae, và có quan hệ gần gũi nhất với chi Parechovirus [22]
Nhánh mới ñược tạo ra ñã chia những Picornavirus thành 11 chi Trong ñó, DHV-1 tạo thành một nhánh riêng biệt nằm ở giữa Parechovirus và Hepatovirus
trong cây phả hệ Cây phả hệ ñược xây dựng dựa trên sự phân tích trình tự của cả
Trang 29chuỗi polypeptit và trình tự vùng 3Dpol Theo sơ ñồ thì DHV-1 là một nhánh ñơn
khác biệt với tất cả các chi Picornavirus khác [61]
Hình 2.5 Cây phả hệ thể hiện liên quan của DHV-1 với 24 loại virus thuộc 11 chi trong họ Picornaviridae Mối quan hệ ñược xây dựng dựa trên khoảng cách của cây phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về axit amin của phức hệ protein [60] Vị trí của nhóm virus viêm gan vịt (DHV 1) ñược chỉ dẫn bằng mũi tên
Ngày nay ñã có ñầy ñủ cơ sở dữ liệu gen học cho phép phân DHV-1 vào 3 genotype là A, B và C Trong ñó, genotype A bao gồm tất cả các DHV-1 cổ ñiển cho ñến nay; genotype B và C bao gồm các chủng mới phân lập gần ñây (2006 -
Trang 302008) ở đài Loan và Hàn Quốc Vì có tắnh biến ựổi di truyền cao, ựặc biệt là biến ựổi ở vùng chứa gen mã hoá protein mang tắnh kháng nguyên nên quần thể virus viêm gan vịt gây bệnh có nhiều serotype khác nhau, ựiều này sẽ ảnh hưởng rất lớn tới vấn ựề vacxin và miễn dịch [38], [63]
Hiện nay, chưa có một tài liệu nào công bố về sinh học phân tử gen và hệ gen của virus gây bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam Do vậy, việc nghiên cứu về hệ gen và phân loại virus viêm gan vịt tại Việt Nam là một việc làm hết sức cần thiết nhằm tạo ựiều kiện thuận lợi cho việc phòng trị bệnh ở nước ta ựạt ựược hiệu quả cao nhất
2.4 MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS VIÊM GAN VỊT
Khi ựưa vacxin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần ựầu hay lần thứ hai, thứ ba, Hàm lượng kháng thể tăng dần, ựạt mức cao nhất sau 2 - 3 tuần rồi giảm dần và mất
ựi sau vài tháng hoặc vài năm
Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, trước hết cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế ựáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu Tham gia vào cơ chế này có vai trò của da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, ựặc biệt là vai trò của các tế bào làm nhiệm vụ thực bào Sau ựó, cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế ựáp ứng miễn dịch ựặc hiệu với hoạt ựộng của các cơ quan, tế bào có thẩm quyền miễn dịch, tạo kháng thể ựặc hiệu ựể loại trừ kháng nguyên
Cũng như nhiều bệnh truyền nhiễm khác, miễn dịch chống bệnh viêm gan virus của vịt gồm miễn dịch thụ ựộng và miễn dịch chủ ựộng
2.4.1 Miễn dịch thụ ựộng
Ở gia cầm non, hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện Ngay từ lúc mới sinh, cơ thể chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh một cách ựặc hiệu Trạng thái miễn dịch chỉ có ựược sau khi cơ thể vịt mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể ựặc hiệu cho con non qua lòng ựỏ trứng [34]
Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch thụ ựộng của vịt con ựược nhận từ mẹ
ựã ựược nghiên cứu rất nhiều Việc tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo ựược
Trang 31kháng thể thụ ñộng tốt cho vịt con Theo Asplin (1958)[16], dùng virus viêm gan vịt type I nhược ñộc qua phôi gà, tiêm bắp cho vịt giống vào thời ñiểm 2 -
4 tuần trước khi lấy trứng ñem ấp sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con Reuss (1959)[52] cho biết tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo ñược kháng thể thụ ñộng cho ñàn vịt con Rispens (1969)[53] khuyến cáo người chăn nuôi nên tiêm vacxin hai lần cho ñàn vịt giống cách nhau ít nhất 6 tuần Vịt mẹ sẽ có khả năng truyền kháng thể thụ ñộng cho vịt con trong vòng 6 tháng sau lần tiêm vacxin thứ hai Ở vịt con, hàm lượng kháng thể thụ ñộng sẽ giảm dần trong hai tuần ñầu sau khi nở [59] Ở vịt mẹ, hàm lượng kháng thể phải ñạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ ñộng hoặc 1/32 trong phản ứng trung hoà mới có thể bảo hộ cho vịt con khỏi bị mắc bệnh [27]
Ngoài ra, miễn dịch thụ ñộng ở vịt con với bệnh viêm gan vịt còn ñược tạo ra bằng cách dùng huyết thanh miễn dịch của vịt khỏi bệnh hoặc kháng thể từ lòng ñỏ tiêm cho vịt con [53]
2.4.2 Miễn dịch chủ ñộng
Là loại miễn dịch thu ñược khi con vật bị mắc bệnh nhưng có ñủ sức chống lại bệnh và khỏi bệnh hoặc là miễn dịch mà vịt có ñược sau khi tiêm vacxin Những vịt sống sót sau khi mắc bệnh ñều có miễn dịch chắc chắn với virus của type gây bệnh Tạo miễn dịch chủ ñộng cho ñàn vịt bằng cách sử dụng các loại vacxin nhược ñộc và vacxin vô hoạt Vacxin sau khi vào cơ thể sẽ ñi ñến các cơ quan miễn dịch như hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể ñặc hiệu
Trong kháng thể dịch thể dịch thể chống virus viêm gan vịt type I thì kháng thể 7S nhiều hơn kháng thể 19S (kháng thể 7S mẫn cảm với Cystein, còn 19S lại kháng với Cystein) [45]
Theo Asplin (1970)[18], vịt ñược tiêm vacxin có thể tạo ñược miễn dịch chủ ñộng chống lại bệnh Sử dụng vacxin viêm gan vịt nhược ñộc tiêm cho vịt lúc 2 - 3 ngày tuổi và tiêm nhắc lại bằng vacxin vô hoạt vào thời ñiểm 22 tuần tuổi sẽ tạo ñược lượng lớn kháng thể trung hoà [28] Trong huyết thanh của vịt khỏi bệnh có
Trang 32kháng thể trung hoà Ở vịt 2 ngày tuổi, kháng thể trung hoà xuất hiện ở vịt con sau 4 ngày tiêm vacxin nhược ñộc viêm gan vịt type I [21]
2.5 CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
2.5.1 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt ñộ, sử dụng ñặc ñiểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym DNA-polymerase chịu nhiệt, có hai ñoạn ngắn DNA làm mồi và dùng các ñoạn DNA mạch ñơn làm khuôn
ñể tổng hợp nên sợi mới bổ sung Vì vậy, ñể khởi ñầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp ñoạn mồi oligonucleotide (có ñộ dài từ 6 - 30 nucleotit) ðoạn này gắn kết với DNA khuôn tại ñiểm khởi ñầu sao chép và ñược enzym DNA-polymerase ñiều khiển tổng hợp một ñoạn DNA ñặc thù Các sợi DNA mạch ñơn làm khuôn ñược tạo ra theo cách ñơn giản là nâng nhiệt ñộ lên trên 90oC(92 - 98oC) cho mạch xoắn kép DNA bung ra
Cả hai sợi DNA ñều ñược dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các ñoạn mồi (gọi là oligonucleotide hay primer) ñược cung cấp ñể bám vào vị trí tương ứng cho cả hai sợi Trong kĩ thuật PCR, các ñoạn mồi ñược chọn nằm ở hai ñầu ñoạn DNA cần nhân lên sao cho các sợi DNA tổng hợp mới ñược bắt ñầu tại mỗi ñoạn mồi và kéo dài về phía ñoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có ñộ dài giới hạn giữa hai ñoạn mồi này ðộ dài sản phẩm PCR có thể vài trăm cho ñến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit Như vậy, sau mỗi chu kỳ các ñiểm bám cho các ñoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới ñược tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại ñược nâng nhiệt ñộ lên thích hợp sao cho các sợi ban ñầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau ñó còn ñược dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước: gắn ñoạn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các ñoạn
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kì của phản ứng tính theo lí thuyết sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai ñoạn mồi [10] Như vậy, kết quả là một ñoạn DNA ñịnh trước ñược nhân lên với số lượng rất lớn
Ví dụ, sau 28 chu kỳ (228) số lượng bản sao DNA của PCR sẽ là: 1.073.741.824
Trang 332.5.2 Phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)
Kĩ thuật RT-PCR (hay còn gọi là phản ứng PCR ngược) là một phản ứng nhân một ñoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lí của phản ứng PCR bao gồm hai giai ñoạn: giai ñoạn thứ nhất là chuyển ñổi một sợi RNA làm khuôn thành cDNA, sau ñó qua giai ñoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuôn ñể tiếp tục thực hiện phản ứng PCR
RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong ñó có Adenine, Guanine, Cytosine, Uracil Chuỗi nucleotit này phải ñược chuyển ñổi thành DNA hai sợi, mà thành phần Uracil ñược thay thế bằng Thymine Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ ñến vai trò của enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase
- RT) Do vậy, giai ñoạn này ñược gọi là giai ñoạn chuyển ngược Khi ñã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR
Do vậy, giai ñoạn này gọi là giai ñoạn chuyển ngược (RT-Reverse Transcription) Khi ñã có cDNA hai sợi làm khuôn, phản ứng tiếp theo là PCR Toàn bộ phản ứng nhân một ñoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai ñoạn nói trên ñược gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngược Thay ñổi nhiệt ñộ ñể phù hợp cho mỗi chu kỳ Có thể sử dụng phản ứng RT-PCR một bước hoặc hai bước
2.5.3 Kĩ thuật ñiện di
Kĩ thuật ñiện di trên thạch agarose là hết sức quan trọng ñối với người làm kĩ thuật di truyền và sinh học phân tử, ñó là cách chủ yếu làm cho các ñoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một ñặc tính là các phân tử axit nucleic ở pH trung tính chúng tích ñiện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic Khi ñặt chúng vào một ñiện trường, các phân
tử axit nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch ñặc biệt khác, các phân tử axit nucleic tuỳ theo kích thước sẽ dịch chuyển với các tốc ñộ khác nhau Loại có phân tử lượng lớn dịch chuyển chậm, loại bé hơn sẽ dịch chuyển nhanh hơn [10]
Có hai loại thạch agarose ñược sử dụng phổ biến trong kĩ thuật ñiện di ñó là thạch agarose và thạch polyacrylamid Thạch agarose ñược dùng ñể thực hiện ñiện
Trang 34di trong máy ñiện di, gel polyacrylamid thường ñược dùng ñể phân tách các phân tử axit nucleic có kích thước nhỏ trong các ứng dụng như xác ñịnh trình tự DNA ðiện di ñược thực hiện bằng cách ñưa các mẫu axit nucleic có trộn chỉ thị màu xanh Bromphenol vào các lỗ giếng của bản thạch và ñặt một ñiện áp vào ñó Các axit nucleic ở trên thạch thường hiển thị khi nhuộm bằng Ethidium Bromide và ñược quan sát dưới ánh sáng tử ngoại Các axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh và ghi nhận lại ñược Kích thước các băng DNA ñược so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker) DNA marker thường ñược dùng nhất là DNA của thực khuẩn thể Lamda, có chiều dài 43 kb, ñược cắt bằng enzym giới hạn
HindIII, tạo 8 phân ñoạn với các chiều dài bao gồm 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,3 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,564 kb; 0,125 kb Nhờ chỉ thị di truyền này mà có thể xác ñịnh ñược ñộ dài của ñoạn axit nucleic cần phân tích [10]
2.5.4 Nguyên lí tách dòng và lưu giữ nguồn gen
Nguyên lí của việc dòng hoá là gắn nối sản phẩm PCR hoặc RT-PCR vào vector tách dòng và chuyển nạp vào tế bào chủ tạo dòng tái tổ hợp
Hình 2.6 Cấu trúc của vector pCR 2.1-TOPO Theo nguyên tắc, một ñoạn DNA ngoại lai (sản phẩm của PCR hoặc RT-PCR)
sẽ ñược cài vào trong hệ gen của một vòng DNA ñã ñược thiết kế sẵn gọi là plasmid
Trang 35mang - vector dẫn truyền (thường dùng vector pCR 2.1-TOPO) tạo thành vector tái
tổ hợp (hình 2.6) Sau ñó, vector tái tổ hợp này sẽ ñược chuyển nạp vào tế bào chủ
thích ứng, thông thường là tế bào E coli, ñể nhân lên với số lượng lớn các bản sao
của DNA ngoại lai Sau khi chuyển nạp, tiến hành chọn lọc tái tổ hợp theo hai cơ chế: Cơ chế X-gal, và cơ chế kháng sinh nhằm loại trừ các vi khuẩn không tái tổ hợp Tách chiết các khuẩn lạc ñơn dòng ñể thu ñược lượng DNA tái tổ hợp và kiểm tra xem ñoạn DNA ngoại lai có ñược nối vào vector hay không bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn [10]
2.5.5 Tầm quan trọng của việc thu nhận, lưu giữ và nghiên cứu ñặc tính phân tử gen kháng nguyên VP1 của virus vacxin viêm gan vịt ñược sử dụng ở Việt Nam
Việc lưu giữ hệ gen virus viêm gan vịt nói chung, ñặc biệt với gen kháng nguyên VP1 nói riêng, là một việc làm hết sức quan trọng vì ñây là những dữ liệu cung cấp thông tin về sự tiến hoá của virus và tương ñồng kháng nguyên - miễn dịch giữa các biến chủng của virus viêm gan vịt, kể cả cường ñộc và vacxin
Với trình tự axit nucleic của vùng gen VP1 ñược phân lập và lưu giữ sẽ là cơ
sở xác lập về dịch tễ học và xác ñịnh mối quan hệ về nguồn gốc tiến hoá và so sánh virus viêm gan vịt lưu hành ở Việt Nam và trên thế giới
Mặt khác, do virus viêm gan vịt có khả năng biến ñổi, ñặc biệt gần ñây xuất hiện nhiều biến chủng sai khác di truyền ñến mức cần phân biệt nhiều genotype khác nhau là genotype A, B, C [36], [61], [62], [63] Các chủng thuộc các genotype khác nhau có thể phân biệt ñược bằng phương pháp PCR/RT-PCR [38] Vacxin nhược ñộc viêm gan vịt hiện ñang ñược sử dụng tại Việt Nam là kết quả ñược tạo ra của quá trình nhược ñộc hoá virus cường ñộc viêm gan vịt trên môi trường không cảm thụ ðây là các chủng vacxin nhập từ nước ngoài vào, hiện ñang ñược sản xuất tại Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương và một chủng khác ñang nghiên cứu kiểm chứng Việc tìm hiểu rõ ñặc tính cấu trúc sinh học phân tử của gen VP1 các chủng vacxin này là hết sức cần thiết
Từ dữ liệu sinh học phân tử của chủng vacxin, việc so sánh sự giống và khác nhau của trình tự nucleotit và axit amin với các chủng cường ñộc của thế giới và
Trang 36của Việt Nam sẽ giúp chúng ta tìm hiểu ựược vùng gen kháng nguyên VP1 sâu sắc hơn, tạo ựiều kiện cho công tác phòng chống bệnh ựạt ựược hiệu quả tốt nhất
2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Từ khi Levine và Hofstad lần ựầu tiên phát hiện ra bệnh viêm gan vịt vào năm
1945, cho ựến nay trên thế giới ựã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh Trước ựây, các công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu về ựặc ựiểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng - bệnh tắch, ựặc tắnh sinh học của virus, chế tạo vacxinẦ sao cho việc phòng chống bệnh viêm gan vịt ựạt hiệu quả cao nhất mà chưa có nghiên cứu sâu sắc về ựặc tắnh sinh học phân tử của hệ gen virus Gần ựây, bệnh viêm gan vịt do virus ựược nhiều tác giả quan tâm, ựặc biệt là virus viêm gan vịt type I (DHV-1) Năm 2007, Tseng
và Tsai ựã xác ựịnh ựược ựầy ựủ hoặc gần như ựầy ựủ hệ gen của 3 chủng virus DHV-1, gồm một chủng ựược phân lập ngoài tự nhiên ở đài Loan (là chủng 03D); một chủng vacxin nhược ựộc của Mỹ (chủng 5886) và một chủng vacxin của nước Anh (chủng H) Cho ựến nay (2008), hệ gen của hàng chục chủng virus viêm gan vịt kể cả cường ựộc cũng như vacxin ựã ựược giải mã và phân tắch Qua phân tắch
sự tiến hóa và phát sinh loài của DHV-1 thì DHV-1 ựược phân loại lại vào trong một chi mới trong họ Picornaviridae, tương tự, DHV-2 và DHV-3 ựược phân loại
lại vào trong họ Astroviridae và ựược ựặt tên lại là Duck Astrovirus (chi Astrovirus)
[29], [46] Dựa vào những ựặc ựiểm riêng biệt của hệ gen như: gen VP0 không bị phân cắt; ba protein 2A không liên quan với nhau; sự tương ựồng thấp về trình tự
axit amin với tất cả những Picornavirus khác và những kết quả của việc phân tắch phát sinh loài mà DHV-1 ựược xếp vào chi Picornavirus tách biệt và ựược coi là
mẫu ựầu tiên của một chi mới [61] Một sự phân tắch khác của Ding và Zhang trên chủng DHV-C80 (là một chủng vacxin thắch ứng trên phôi gà ở Trung Quốc) cũng
ựề nghị nên xếp DHV-1 vào một chi riêng biệt trong họ Picornaviridae [22]
Ở nước ta, có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt và ựặc tắnh sinh học virus viêm gan vịt những vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về ựặc tắnh sinh học phân tử của virus viêm gan vịt Bệnh viêm gan vịt ựược phát hiện lần
Trang 37ựầu tiên vào năm 1978 khi mà một số giống vịt ngoại ựược nhập vào nước ta một cách ồ ạt và ựược nuôi rộng rãi trong dân Vào thời ựiểm này, Trần Minh Châu và
cs ựã ghi nhận bệnh ở đông Anh - Hà Nội [6], nhưng lúc ựó vẫn chưa phân lập ựược mầm bệnh
Từ năm 1979 ựến năm 1983, bệnh xảy ra ở nhiều ựịa phương và làm chết rất nhiều vịt con [9] Năm 1983, Trần Minh Châu và cs ựã phân lập ựược một chủng virus cường ựộc tại một trại nuôi vịt ở Phú Xuyên - Hà Sơn Bình (chủng TT) Khi nuôi cấy virus này trên phôi vịt 12 ngày tuổi, virus gây chết phôi 100%, thời gian chết phôi từ 48 - 96 giờ, phôi có bệnh tắch xuất huyết Virus này ựược giảm ựộc lực bằng cách cấy truyền qua 39 ựời trên phôi gà và tạo ựược chủng virus nhược ựộc (chủng VN) có lgELD50/0,2ml là 4 - 5 [5] Qua nuôi cấy trên phôi gà, chủng virus này yếu ựi, không gây bệnh cho vịt con [14]
Năm 1985, các tác giả Trần Minh Châu, Lê Thị Nông, Nguyễn đức Tạo ựã xây dựng qui trình sản xuất vacxin từ 3 chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược ựộc:
TN (Hungari), E32 (Pháp) và VN (Việt Nam) Cả 3 chủng virus vacxin ựều an toàn
và có hiệu lực khi sử dụng Khi miễn dịch cho vịt con rồi thử thách với cường ựộc thì bảo hộ ựược 70 - 100% vịt con [4]
Theo Nguyễn Văn Cảm và cs (2001)[3] cho biết, từ tháng 1 ựến tháng 6 năm
2001, qua ựiều tra 12 ổ dịch ở các ựịa phương là Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang, ựã kết luận ựây là những ổ dịch do virus viêm gan vịt gây ra Ổ dịch có tỷ lệ nhiễm trong ựàn lên ựến gần 100%, tỷ lệ chết từ 48 - 90%
Theo Nguyễn đức Lưu và cs (2001)[13], bệnh viêm gan vịt có cơ hội xảy ra nhiều hơn trên các giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta ở các ựịa phương như
Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình, và các tỉnh ựồng bằng sông Cửu Long, gây tổn thất rất lớn cho các ựịa phương này
Nguyễn đức Lưu và Vũ Như Quán (2002)[14] cho biết, bệnh viêm gan vịt do virus ựã xảy ra ở nhiều nơi, gây thiệt hại nặng nề cho người chăn nuôi ở các tỉnh ựồng bằng Nam Bộ
Trang 38Nguyễn Văn Cảm và cs đã nghiên cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan vịt do virus nhằm đưa ra một phương pháp chẩn đốn nhanh và chính xác [3]
Bùi Thị Cúc, 2002[7] nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể và siêu vi thể bệnh viêm gan vịt do virus cho biết: bệnh tích siêu vi thể điển hình là màng nhân của tế bào gan bị thối hố và hoại tử; các glycogen trong tế bào gan bị phá huỷ, đồng thời xuất hiện các tiểu thể hình cầu cĩ bán kính 100 - 300nm
Năm 2004, Nguyễn Phục Hưng đã nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus nhược độc viêm gan vịt DH - EG - 2000 để cĩ thể sản xuất vacxin phịng bệnh [11] ðến năm 2007, Bùi Thanh Khiết đã nghiên cứu qui trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc trên và ứng dụng phịng - can thiệp vào thực tế sản xuất [12]
Ở nước ta, tuy cĩ nhiều biện pháp phịng bệnh nhưng hiệu quả phịng bệnh vẫn chưa cao, hiệu quả khi sử dụng vacxin nhược độc và vơ hoạt cịn nhiều bất cập Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng tới hiệu quả của việc phịng bệnh bằng vacxin
cĩ thể là do những loại vacxin này đơn chủng lại chứa phần kháng nguyên của các chủng nước ngồi nên khơng phù hợp lắm với những chủng virus tại Việt Nam Do vậy, để cĩ những loại vacxin cĩ hiệu quả cao, phù hợp với những chủng virus ở nước ta thì cần cĩ yêu cầu đặt ra là phải cĩ những nghiên cứu về sinh học phân tử
hệ gen của virus viêm gan vịt ở Việt Nam, để tìm hiểu về cấu trúc hệ gen, đặc biệt
là tìm hiểu về cấu trúc của gen kháng nguyên VP1 để từ đĩ cĩ thể tìm ra biện pháp chữa bệnh tốt nhất phù hợp với chủng virus tại Việt Nam
Trang 393 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
ðể ñạt ñược mục tiêu nghiên cứu của ñề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên cứu sau:
- Xác nhận vùng gen VP1 của virus vacxin nhược ñộc viêm gan vịt do Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương sản xuất (kí hiệu: VxXT), và vacxin nhược ñộc viêm gan vịt chủng DH-EG của Ai Cập ñang kiểm chứng (kí hiệu: VxAC)
- Giải trình trình tự vùng gen VP1 của hai chủng virus vacxin nhược ñộc viêm gan vịt hiện có này ở Việt Nam
- So sánh ñối chiếu trình tự nucleotit và trình tự axit amin của hai chủng virus vacxin này với một số chủng virus viêm gan vịt trên thế giới, ñặc biệt là so với các chủng ở Châu Á
- Xác ñịnh phả hệ nguồn gốc của các chủng virus vacxin hiện có này ở Việt Nam
3.2 NGUYÊN LIỆU
3.2.1 Giống virus và chuỗi gen VP1
- Chủng virus ñược dùng làm vacxin viêm gan vịt nhược ñộc do Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương (Hoài ðức - Hà Tây) sản xuất, ký hiệu là VxXT, ở dạng ñông khô phân liều theo tiêu chuẩn
- Chủng vacxin viêm gan vịt nhược ñộc DH-EG-2000 từ Ai Cập do TS.Nguyễn Bá Hiên (Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội) cung cấp, ký hiệu là VxAC, ở dạng nước trứng ñã ñược cấy chuyền trên phôi gà qua nhiều ñời
- Một số chuỗi gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới ñược ñăng ký trong Ngân hàng gen ñược thu nhận và dùng ñể so sánh
3.2.2 Cặp mồi
Chúng tôi sử dụng cặp mồi ñặc hiệu cho chuỗi nucleotit ở hai ñầu của vùng gen VP1 ñể có thể thu nhận ñược ñoạn gen VP1, bao gồm một mồi xuôi và một mồi ngược
Trang 40AAAn VPg
VP1(714 bp)
Mồi xuôiDH3F
Mồi ngượcDH4R
(2106-2819)
(2064-2084) (2810-2830)
(~ 0.8kb)
- Mồi xuôi: Kí hiệu là DH3F
- Mồi ngược: Kí hiệu DH4R
Bảng 3.1 Các ñoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR
Tên mồi Kí hiệu mồi Trình tự mồi (5’ → 3’)
Nhiệt ñộ nóng chảy của mồi (0C) Mồi xuôi DH3F GCCCCACTC TATGGAAAT TTG 54,80C Mồi ngược DH4R ATTTGGTACGATTCAATTTCC 49,60C Cặp mồi dùng ñể nhân ñoạn DNA chứa gen VP1 ñược thiết kế dựa trên trình
tự gen ñặc hiệu của vùng biên xung quanh gen VP1 ở các chủng virus viêm gan vịt
có trong Ngân hàng gen Quốc tế Phản ứng RT - PCR ñược thực hiện ñặc hiệu với cặp mồi DH3F và DH4R ñể nhân ñoạn gen kháng nguyên VP1, có ñộ dài 714 nucleotit từ vị trí nucleotit thứ 2106 ñến 2819 (hình 3.1), tạo nguyên liệu cho quá trình giải trình trình tự chuỗi gen VP1 Các ñoạn mồi sẽ liên kết bổ sung tại các vị trí cần thiết trên hệ gen virus Vị trí vùng gen VP1 và vị trí bám mồi ñược thể hiện theo sơ ñồ sau:
Hình 3.1 Sơ ñồ vị trí bám của mồi ñể thu nhận ñoạn DNA (~0,8 kb) chứa gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã gen VP1 của virus viêm gan vịt bằng cặp mồi DH3F-DH4R (ảnh minh họa)
3.2.3 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm
3.2.3.1 Trang thiết bị
- Máy li tâm ñể bàn (Eppendorf, ðức), máy li tâm lạnh (Eppendorf, ðức)
