Phân lập, xác định đặc tính sinh học của e coli, salmonella gây tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa và thử nghiệm phác đồ điều trị ở một số địa bàn chăn nuôi tại tỉnh hưng yên

3.4 Phương pháp 22 4.1 ðiều tra tình hình dịch bệnh trên ñàn lợn nuôi ở một số huyện tại 4.4 Giám ñịnh ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập 4.6 Xác ñịnh các yếu tố gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


 -

NGUYỄN THỊ MẬN

PHÂN LẬP, XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA E.COLI,

SALMONELLA GÂY TIÊU CHẢY CHO LỢN CON SAU CAI SỮA VÀ

THỬ NGHIỆM PHÁC ðỒ ðIỀU TRỊ Ở MỘT SỐ ðỊA BÀN

CHĂN NUÔI TẠI TỈNH HƯNG YÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


 -

NGUYỄN THỊ MẬN

PHÂN LẬP, XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA E.COLI,

SALMONELLA GÂY TIÊU CHẢY CHO LỢN CON SAU CAI SỮA VÀ

THỬ NGHIỆM PHÁC ðỒ ðIỀU TRỊ Ở MỘT SỐ ðỊA BÀN

CHĂN NUÔI TẠI TỈNH HƯNG YÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô giáo trong khoa Thú y

và viện Sau ðại học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, các thầy cô giáo ñã giảng dạy tôi trong suốt quá trình học và thực tập

ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Nguyễn Thị Hương, TS Sử Thanh Long

ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn gia ñình, anh em, bạn bè ñồng nghiệp ñã tạo ñiều kiện

và ñộng viên giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt chương trình học tập này

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2012

Tác giả luận văn

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2012

Tác giả luận văn

2.3.1 Vi Khuẩn E.coli Vai trò của vi khuẩn E.coli trong hội chứng

2.3.2 Vi Khuẩn Salmonella Vai trò của vi khuẩn Salmonella trong hội

3.4 Phương pháp 22

4.1 ðiều tra tình hình dịch bệnh trên ñàn lợn nuôi ở một số huyện tại

4.4 Giám ñịnh ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập

4.6 Xác ñịnh các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E.coli phân

4.7 Kiểm tra ñộc lực của một số chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella

4.8 Xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi

4.9 Kết quả thử nghiệm phác ñồ ñiều trị tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa 55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AEEC Adherence Enteropathogenic E coli

BEt Ethidium bromide

BHI Brain Heart Infusion

C perfringens Clostridium perfringens

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

DPF Delayed Permeability Factor

E coli Escherichia coli

EPEC Enteropathogenic E coli

ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli

LT Heat-labile toxin

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

OMP Outer membrane protein

PCR Polymerase Chain Reaction

R Rough

RPF Rapid Permeability Factor

ST Heat-stable toxin

TAE Tris - Acetic - EDTA

TGE Transmissible Gastro Enteritis (Bệnh viêm dạ dày ruột

truyền nhiễm) VTEC Verotoxigenic Escherichia coli

DANH MỤC BẢNG

4.2 Kết quả ñiều tra lợn con mắc hội chứng tiêu chảy tại một số xã

4.4 Kết quả xác ñịnh số lượng vi khuẩn E coli và Salmonella có

4.5 Kết quả giám ñịnh ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn

E.coli và Salmonella phân lập ñược 42

4.6 Kết quả xác ñịnh Serotype kháng nguyên O của các chủng vi

4.10 Kết quả xác ñịnh tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi

4.11 Kết quả xác ñịnh tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi

4.12 Kết quả ñiều trị thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị hội chứng tiêu

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ðỒ

3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn ñường ruột (Bộ môn Vi trùng - viện

4.2 Biểu ñồ biểu diễn tỷ lệ vi khuẩn E.coli trong phân của lợn con

4.3 Biểu ñồ biểu diễn tỷ lệ vi khuẩn Salmonella trong phân của lợn

4.7 Biểu ñồ biểu diễn tỷ lệ ñiều trị khỏi hội chứng tiêu chảy ở lợn

1 MỞ ðẦU

1 1 Tính cấp thiết của ñề tài

Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của người dân ñược nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, nhiệm vụ của công tác Chăn nuôi Thú y càng nặng nề hơn, bên cạnh việc tăng nhanh về số lượng, phải hết sức chú trọng việc nâng cao chất lượng ñàn gia súc, gia cầm

Ở nước ta, chăn nuôi lợn chiếm một vị trí quan trọng và luôn chiếm tỷ trọng lớn trong ñàn gia súc, gia cầm Năm 1995 cả nước có 16,3 triệu con lợn, ñến năm

2005 là 27,44 triệu con, 4 tháng ñầu năm 2012 ñàn lợn ñã tăng lên là 26,7 triệu con Sản lượng thịt lợn hơi luôn tăng qua hàng năm, năm 1995 sản lượng là 1.006.000 tấn, ñến năm 2006 ñạt 1.713.000 tấn, 6 tháng ñầu năm 2012 ñạt 1.900.000 tấn (Tổng cục thống kê) Tuy nhiên, một trong những trở ngại lớn trong công tác chăn nuôi nước ta

là vấn ñề dịch bệnh Dịch bệnh thường xuyên xảy ra ñã gây nhiều thiệt hại làm hạn chế sự phát triển, giảm hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi Trong ñó, hội chứng tiêu chảy với ñặc ñiểm dịch tễ hết sức phức tạp ñang gây nên những thiệt hại to lớn, làm giảm năng suất, chất lượng ñàn vật nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng Ở Việt Nam, tỷ lệ lợn mắc hội chứng tiêu chảy rất cao, có ñịa phương 70-80 %, tỷ lệ chết 18-20 % Lợn mắc bệnh nếu không chết cũng còi cọc và chậm phát triển

Hội chứng tiêu chảy xảy ra ở các giống lợn và mọi lứa tuổi nhưng gây hậu quả nghiêm trọng và tổn thất lớn nhất là ở lợn con Hội chứng tiêu chảy do nhiều

nguyên nhân gây ra như vi khuẩn (E.coli, Salmonella), virus (virus gây viêm dạ dày

ruột truyền nhiễm) và các ký sinh trùng (giun ñũa, cầu trùng…) Trong hội chứng

tiêu chảy ở lợn con, E.coli và Salmonella là hai nguyên nhân gây bệnh quan trọng

và rất phổ biến

ðể giảm thiệt hại của hội chứng tiêu chảy do vi khuẩn gây ra và xây dựng biện pháp phòng và ñiều trị bệnh bằng thuốc ñặc trị chúng tôi tiến hành nghiên cứu

ñề tài: “Phân lập, xác ñịnh ñặc tính sinh học của E coli, Salmonella gây tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa và thử nghiệm phác ñồ ñiều trị ở một số ñịa bàn chăn nuôi tại tỉnh Hưng Yên”

1.2 Mục ñích

Phân lập, xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn E coli, Salmonella

ðưa ra ñược biện pháp phòng và ñiều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn sau cai sữa ñạt hiệu quả

1.3 Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài

Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi ñưa ra biện pháp phòng và trị bệnh có hiệu quả, giúp cho thú y cơ sở, các hộ chăn nuôi trong phòng, trị hội chứng tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa, góp phần giảm thiệt hại và tăng thu nhập trong chăn nuôi lợn

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái niệm về hội chứng tiêu chảy

Tiêu chảy là tình trạng bệnh lý ñường tiêu hoá, con vật có hiện tượng ỉa nhanh, nhiều lần trong ngày, trong phân có nhiều nước do rối loạn chức năng tiêu hoá (ruột tăng cường co bóp và tiết dịch) (Phạm Ngọc Thạch, 1996), hoặc chỉ phản ánh ñơn thuần sự thay ñổi tạm thời của phân gia súc bình thường khi gia súc ñang thích ứng với những thay ñổi trong khẩu phần ăn Tiêu chảy xảy ra ở nhiều bệnh và bản thân nó không phải là bệnh ñặc thù (Archie.H, 2000)

Tùy theo ñặc ñiểm, tính chất, diễn biến bệnh, loài gia súc hoặc nguyên nhân chính gây bệnh mà hội chứng tiêu chảy ñược gọi bằng tên khác nhau như bệnh xảy

ra ñối với gia súc non theo mẹ, gọi là bệnh lợn con phân trắng, hay bê nghé phân trắng còn ở gia súc sau cai sữa là chứng khó tiêu hay hội chứng rối loạn tiêu hoá Nếu xét về nguyên nhân chính gây bệnh thì có các tên gọi như bệnh Colibacillosis

do vi khuẩn E.coli gây ra, bệnh phó thương hàn lợn do vi khuẩn Samonella gây ra, bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) do Coronavirus gây ra v.v

Song, với bất kỳ cách gọi nào thì tiêu chảy luôn ñược ñánh giá là hội chứng phổ biến trong các bệnh của ñường tiêu hoá, xảy ra ở mọi lúc, mọi nơi (Archie H, 2000) với các triệu chứng chung là ỉa chảy, mất nước, mất chất ñiện giải, suy kiệt dẫn ñến có thể chết

2.2 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn

Tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý có liên quan ñến nhiều yếu tố, có yếu tố

là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Vì vậy, việc phân biệt rạch ròi giữa các nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn (Lê Minh Chí, 1995)

Có thể liệt kê một số nguyên nhân quan trọng như sau:

Do môi trường ngoại cảnh

Môi trường ngoại cảnh là một trong 3 yếu tố cơ bản gây ra bệnh dịch, mối quan

hệ giữa cơ thể - mầm bệnh - môi trường là nguyên nhân của sự không ổn ñịnh sức khỏe,

ựưa ựến phát sinh bệnh (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Môi trường ngoại cảnh bao gồm các yếu tố như nhiệt ựộ, ẩm ựộ, các ựiều kiện

về chăm sóc nuôi dưỡng, vệ sinh chuồng trại, sự di chuyển, thức ăn, nước uống v.v Khi gia súc bị nhiễm lạnh kéo dài làm giảm ựáp ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào, làm cho gia súc dễ bị nhiễm khuẩn và mắc bệnh (Hồ Văn Nam và

Như vậy, nguyên nhân môi trường ngoại cảnh gây tiêu chảy không mang tắnh ựặc hiệu mà mang tắnh tổng hợp Lạnh và ẩm gây rối loạn hệ thống trao ựổi nhiệt của cơ thể lợn, dẫn ựến rối loạn quá trình trao ựổi chất, làm giảm sức ựề kháng của cơ thể, từ ựó các mầm bệnh trong ựường tiêu hoá có thời cơ tăng cường ựộc lực

và gây bệnh

Nguyên nhân do vi sinh vật

Vi sinh vật bao gồm các loại virus, vi khuẩn và nấm mốc Chúng vừa là nguyên nhân nguyên phát, cũng vừa là nguyên nhân thứ phát gây tiêu chảy

Tiêu chảy do vi khuẩn: Trong ựường tiêu hoá của gia súc có hệ vi khuẩn gọi

là hệ vi khuẩn ựường ruột, ựược chia thành 2 loại, trong ựó vi khuẩn có lợi, có tác dụng lên men phân giải các chất dinh dưỡng, giúp cho quá trình tiêu hoá ựược thuận lợi và vi khuẩn có hại, khi có ựiều kiện thì gây bệnh Một số vi khuẩn thuộc họ vi

khuẩn ựường ruột như E coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella, C perfringensẦ

đó là những vi khuẩn quan trọng, gây rối loạn tiêu hoá, viêm ruột tiêu chảy ở người

và nhiều loài ựộng vật Nguyễn Như Pho (2003) cho rằng, khả năng gây bệnh của

các loại vi khuẩn ñối với lứa tuổi lợn khác nhau ðối với lợn sau cai sữa hoặc giai

ñoạn ñầu nuôi thịt thì tỷ lệ mắc tiêu chảy do Salmonella cao hơn, giai ñoạn từ lúc sơ sinh ñến sau cai sữa thường do E coli, lứa tuổi 6 - 12 tuần thì thường do xoắn khuẩn Treponema hyodysenterriae, còn vi khuẩn yếm khí C perfringens thường

gây bệnh nặng cho lợn con theo mẹ trong khoảng 1 tuần tuổi ñến cai sữa

Tiêu chảy do virus: Virus cũng là tác nhân gây hội chứng tiêu chảy ở lợn, sự xuất hiện của virus ñã làm tổn thương niêm mạc ruột, làm suy giảm sức ñề kháng của

cơ thể và thường gây ỉa chảy ở dạng cấp tính với tỷ lệ chết cao (Phạm Ngọc Thạch, 1996) Khooteng Huat (1995) ñã thống kê có hơn 10 loại virus có tác ñộng làm tổn

thương ñường tiêu hoá, gây viêm ruột ỉa chảy như Enterovirus, Rotavius,

Coronavirus, Adenovirus type IV, virus dịch tả lợn v.v

Tiêu chảy do nấm mốc: Thức ăn khi chế biến hoặc bảo quản không ñúng kỹ

thuật dễ bị nấm mốc Một số loài như Aspergillus, Penicillium, Fusarium… có khả năng

sản sinh nhiều loại ñộc tố, nhưng quan trọng nhất là nhóm ñộc tố Aflatoxin (Aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1)

ðộc tố Aflatoxin gây ñộc cho người và gia súc, gây bệnh nguy hiểm nhất cho con người là ung thư gan, hủy hoại gan, ñộc cho thận, sinh dục và thần kinh Aflatoxin gây ñộc cho nhiều loài gia súc, gia cầm, mẫn cảm nhất là vịt, gà, lợn và các gia súc khác Lợn khi nhiễm ñộc thường bỏ ăn, thiếu máu, vàng da, ỉa chảy, ỉa chảy ra máu Nếu trong khẩu phần có 500 - 700µg Aflatoxin/kg thức ăn sẽ làm cho lợn con chậm lớn, còi cọc, giảm sức ñề kháng với các bệnh truyền nhiễm khác (Lê Thị Tài, 1997)

Tiêu chảy do ký sinh trùng: Có nhiều loại ký sinh trùng gây hội chứng tiêu

chảy ở lợn như: Cầu trùng Eimeria, Isospora suis, Crytosporidium, Ascaris suum,

Trichuris suis… hoặc một số loài giun tròn lớp Nematoda (Ascaris suum, Trichuris suis, Strongloides, Haemonchus, Mecistocirrus…)

Như vậy có thể thấy, có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy, nhưng theo một số chuyên gia chuyên nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở lợn như Nguyễn Thị Nội (1985), Lê Văn Tạo (1993), Hồ Văn Nam (1997) thì dù nguyên nhân nào gây

tiêu chảy cho lợn ñi nữa, cuối cùng cũng là quá trình nhiễm khuẩn, vi khuẩn kế phát làm viêm ruột, tiêu chảy nặng thêm, có thể dẫn ñến chết hoặc viêm ruột tiêu chảy mãn tính

ðến nay, người ta khẳng ñịnh rằng tác nhân vi khuẩn gây hội chứng tiêu

chảy ở gia súc phổ biến gồm 3 loại chính là E.coli, Salmonlla và Clostridium

perfringens (Nguyễn Bá Hiên, 2001)

2.3 Một số vi khuẩn gây bệnh ñường tiêu hoá

2.3.1 Vi Khuẩn E.coli

Vi khuẩn Escherichia coli trước ñây ñược gọi là Bacterium coli commune hay

Bacilus coli communis, lần ñầu tiên phân lập ñược từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm

1885 và ñược ñặt theo tên của người bác sĩ nhi khoa ðức Theodor Escherich (Nguyễn Vĩnh Phước, 1974; Nguyễn Lân Dũng, 1976; Nguyễn Như Thanh và cs, 1997; Lê Văn Tạo, 1997)

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, là họ vi khuẩn thường trực ở trong

ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí (Hoàng Thuỷ Nguyên và cs, 1974), vừa

là vi khuẩn cộng sinh thường trực ñường tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở ñường ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997)

Trong ñiều kiện bình thường, vi khuẩn E.coli khu trú thường xuyên ở phần sau

của ruột, ít khi có ở dạ dày hay ñoạn ñầu ruột non của ñộng vật Khi gặp ñiều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, ñộc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm ñường tiêu hoá và trở thành nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn

ðặc ñiểm hình thái

Vi khuẩn E.coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, có kích thước 2 - 3µm x

0,3 - 0,6µm, ở môi trường nuôi cấy, trong canh khuẩn già xuất hiện những trực

khuẩn dài 4-8µm Trong cơ thể người và ñộng vật, E.coli thường có hình trực

khuẩn, ñứng riêng lẻ, ñôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn vi khuẩn có khả năng di

ñộng do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào, có thể có giáp mô Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu ñều hoặc sẫm ở hai ñầu, khoảng giữa nhạt hơn Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy ñể nhuộm, có thể thấy giáp mô, nhưng khi soi tươi thì thường không nhìn thấy ñược

ðặc ñiểm cấu trúc

Vi khuẩn E.coli ñược chia làm các Serotypee khác nhau dựa vào cấu trúc

kháng nguyên thân O, giáp mô K, lông H và kháng nguyên bám dính F Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học ñã tìm ra ñược 250 Serotypee O, 89 Serotypee K,

56 Serotypee H và một số Serotypee F (Fairbrother.J.M, 1992) Khi xác ñịnh Serotypee ñầy ñủ của 1 chủng vi khuẩn thì phải xác ñịnh ñủ cả 3 loại kháng nguyên nói trên

Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân-Ohne Hauch) ñược coi như là một yếu

tố ñộc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khó tan

Kháng nguyên H (kháng nguyên lông-Hauch) là thành phần lông của vi khuẩn,

có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O Kháng nguyên H không phải là yếu tố ñộc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O Kháng nguyên H của

vi khuẩn không có vai trò bám dính, không có tính ñộc và cũng không có ý nghĩa trong ñáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít ñược quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác ñịnh giống loài của vi khuẩn (Orskov.F, 1978)

Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ bọc-Capsular), còn ñược gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP-Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular) Vai trò của kháng nguyên K chưa ñược thống nhất Có rất nhiều ý kiến cho rằng nó không có ý nghĩa về ñộc lực của vi khuẩn vì thấy rằng ñộc lực của chủng có kháng nguyên K cũng giống ñộc lực của chủng không có kháng nguyên K (Orskov.F, 1978) Tuy nhiên, có ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩa về ñộc lực vì

nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ Tuy vậy, phần lớn các ý kiến ñều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau:

Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O, nên thường ghi liền công thức Serotypee của vi khuẩn là Ox:Ky như O139: K88, O149: K88 v.v

Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác ñộng của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ

Tóm lại, dựa vào kháng nguyên O, ñược chia làm nhiều nhóm, căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H, lại chia làm nhiều type, mỗi type ñều ñược ghi thứ

tự các yếu tố kháng nguyên O, K, H

Kháng nguyên F (kháng nguyên Fimbriae- kháng nguyên bám dính) Hầu hết các chủng gây bệnh ñều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày ñể xâm nhập và gây bệnh, ñồng thời chống lại khả năng ñào thải vi khuẩn của nhu ñộng ruột

Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn thuộc nhóm ETEC

(Enterotoxigenic) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18 và

F41 (Cater.G.R và cs, 1995)

ðặc tính nuôi cấy, sinh vật, hoá học

ðặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh

trưởng ở phổ nhiệt ñộ khá rộng (từ 5 - 400C), nhiệt ñộ thích hợp là 370C và phổ pH rộng (pH từ 5,5 - 8,0), pH thích hợp nhất là từ 7,2 - 7,4

Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường Khi nuôi cấy trên các môi trường, ñể trong tủ ấm ở 37oCvà sau 24 giờ vi khuẩn sẽ phát triển như sau:

Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, ñường kính từ 2 - 3mm Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucous)

Môi trường nước thịt: Phát triển rất nhanh, tốt, môi trường ñục ñều có lắng cặn

màu tro nhạt ở dưới ñáy, ñôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối

Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng gây ra hiện tượng tan máu

Môi trường Simmon citrat: Khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục

Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu ñỏ

Trong môi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím ñen

Trong môi trường SS: Khuẩn lạc có màu ñỏ

ðặc tính sinh hoá

Phản ứng lên men ñường: Vi khuẩn E.coli lên men sinh hơi các loại ñường

Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại ñường Duncitol, Saccarose và Salixin

Hầu hết các chủng vi khuẩn ñều lên men ñường Lactose nhanh và sinh hơi, ñây là

ñặc ñiểm quan trọng ñể dựa vào ñó phân biệt vi khuẩn E.coli và Samonella

Một số phản ứng sinh hoá khác: Phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính

ðặc tính gây bệnh của vi khuẩn

Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn

ðể có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E.coli phải bám dính vào tế bào

nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính như kháng nguyên F Sau ñó, nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột Ở ñó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá huỷ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột, ñồng thời sản sinh ñộc tố ñường ruột Enterotoxin ðộc tố ñường ruột tác ñộng vào quá trình trao ñổi muối, nước, làm rối loạn chu trình này Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng

cơ học, làm nhu ñộng ruột tăng, ñẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tượng tiêu chảy Sau khi ñã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, ñến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn ñến các tổ chức cơ quan Ở ñây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh ñộc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết

Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn

Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli bao gồm khả năng kháng khuẩn,

yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất ñộc tố Các chủng vi khuẩn không có các yếu tố trên thì không có khả năng

gây bệnh

Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta ñã phân loại vi khuẩn thành

các loại sau: Enterotoxigenic (ETEC), Enteropathogenic (EPEC), Adherence Enteropathogenic (AEEC) và Verotoxingenic (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997) Trong

ñó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thường gây hội chứng tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother.J.M, 1992)

Yếu tố kháng khuẩn: Nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV Vì vậy, yếu tố này cũng ñược coi là một trong các yếu tố ñộc lực của vi khuẩn gây bệnh (Smith.H.W và cs, 1967)

Yếu tố bám dính: ðể gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non Hầu hết các chủng ETEC ñều có mang 1 hoặc nhiều các yếu tố bám dính như: F4(K88), F5 (K99), F6(987P), F17, F18, F41, F42 và F165 Ở lợn, các chủng vi khuẩn ETEC gây hội chứng tiêu chảy thường mang các yếu tố bám dính sau ñây:

F4 (K88): F4 hay còn gọi là K88, là một kháng nguyên không chịu nhiệt Bằng

việc sử dụng các kháng huyết thanh ñặc hiệu, Orskov và cs (1964) ñã phân biệt ñược hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac Loại thứ 3 ñược phát hiện bởi Guinee và

Jansen ñược ñặt tên là F4ad (Guinee và cs, 1979) Sợi F4giúp cho vi khuẩn bám ñược vào receptor tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ ñó vi khuẩn có thể xâm nhập cố ñịnh và phát triển ñược ở thành ruột non Yếu tố bám dính F4 ñược mang trong vi khuẩn thuộc nhóm ETEC, gây hội chứng tiêu chảy ở lợn trước

và sau cai sữa (Nagy và cs, 1999)

F5 (K99): F5 trước kia ñược cho là kháng nguyên bám dính của vi khuẩn

E.col, chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng ñược tìm thấy

với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Links và cs, 1985) Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc ñộ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt ñộ và alanine trong môi trường Các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1977)

F6 (987p): Các nhà khoa học cho rằng, fimbriae này ñóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các receptor cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm trải của các tế bào biểu

mô ruột (Dean và cs, 1989, 1994) F6 bám dính ở màng nhầy ñể phân phối ñộc tố

ñường ruột tối ña ñến vật chủ

F18: F18 là tên ñặt cho nhân tố bám dính 8813 Bởi vậy, một loại fimbriae mới ñã ñược ñề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs, 1995) Một nghiên cứu của Nagy và cs (1996) thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học F18ab ít thấy thể hiện ở cả trong ñiều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các

ñặc tính của các chủng ETEC

Một ñặc ñiểm ñáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải

của vi khuẩn E.coli ở lợn sơ sinh trong ñiều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm

(Nagy và cs, 1992), cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cs, 1992) ðiều này ngược với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột Khả năng bám này ở lợn cai sữa nhiều hơn so với lợn sơ sinh Lý do xác ñáng ñể giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab và F18ac

theo tuổi của lợn vẫn chưa ñược làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các receptor ñặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh ñến 21 ngày tuổi Sự thiếu hụt các receptor của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thểgiải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa (Nagy và cs, 1999)

Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn: là một khái niệm dùng ñể chỉ quá trình chưa ñược xác ñịnh một cách rõ ràng mà nhờ ñó vi khuẩn qua ñược hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc ñể xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), ñồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi ñó những

vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua ñược hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua ñược hàng rào này, sẽ bị giữ lại bởi tế bào ñại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella và cs, 1976)

ðộc tố của vi khuẩn: Vi khuẩn sản sinh nhiều loại ñộc tố như Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin Mỗi loại ñộc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra

Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên: Theo ý kiến của nhiều tác giả,

mặc dù các vi khuẩn có nhiều loại kháng nguyên, trong ñó có loại tạo miễn dịch phòng

vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng ñều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ Các kháng nguyên tham gia quá trình trên phải kể ñến là kháng nguyên O, kháng nguyên K,

kháng nguyên F

Yếu tố dung huyết (Hly): ðể phát triển trong cơ thể, vi khuẩn cần ñược cung cấp sắt, hầu hết những chủng gây bệnh thường có khả năng gây dung huyết ðể chiếm dụng sắt của vật chủ, vi khuẩn tiết men Heamolyzin phá vỡ hồng cầu, giải

phóng sắt trong nhân HEM

Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn là: α-haemolysin, β-haemolysin, γ-haemolysin, ε-haemolysin, nhưng quan trọng nhất là kiểu α-haemolysin và β-haemolysin (Ketyle và cs, 1975)

Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn

ðể trị bệnh ñường ruột, người ta sử dụng nhiều loại kháng sinh Kháng sinh

còn ñược trộn vào thức ăn với tỷ lệ thấp ñể phòng bệnh và kích thích tăng trọng Vì vậy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn ñường ruột nói chung và vi khuẩn nói riêng ñang ngày một tăng, làm cho hiệu quả ñiều trị giảm, thậm chí nhiều loại kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn

Sở dĩ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và nói riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh nằm trong plasmid R (Resistance) Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975)

Sử dụng phương pháp kháng sinh ñồ, Lê Văn Tạo (1993) ñã xác ñịnh ñược khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh phân trắng lợn con

và kết luận vi khuẩn có ñược khả năng này là do nhận ñược di truyền dọc và di truyền ngang qua plasmid Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn không còn ñơn thuần là việc lựa chọn kháng

sinh mẫn cảm ñể ñiều trị bệnh do vi khuẩn E.coli gây ra mà là nghiên cứu một yếu

tố gây bệnh của vi khuẩn này

Phạm Khắc Hiếu và cs (1999) ñã tìm thấy chủng vi khuẩn kháng lại 11 loại kháng sinh, ñồng thời chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn qua plasmid

Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (2000) cho thấy, hầu hết các

chủng vi khuẩn E.coli phân lập ñược từ gia súc tiêu chảy có khả năng kháng lại với

nhiều loại kháng sinh như: Chloramphenicol, Sulfadimethoxine, Tetracycline v.v Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng vi khuẩn phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền Bắc, Việt Nam, ðỗ Ngọc Thúy và cs (2002) ñã thu ñược kết quả: Các chủng có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường vẫn dùng ñể ñiều trị bệnh: Amoxicillin (76,42 %), Chloramphenicol (79,25 %), Trimethroprim/Sulfamethoxazol (80,19%), Streptomycin (88,68%), Tetracyclin (97,17%) Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với trên 3 loại kháng sinh là phổ biến (chiếm 90,57%) và kiểu kháng thuốc kháng với các loại kháng sinh: Tetracyclin, Trimethroprim/Sulfamethoxazol, Streptomycin và Chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao

nhất (76,24%) Có thể dùng Amikacin, Apramycin hay Ceftiofur ñể ñiều trị cho lợn con bị tiêu chảy, thay thế cho các loại kháng sinh trước ñây vẫn dùng

Bùi Xuân ðồng (2002) ñã tiến hành thử kháng sinh ñồ với các chủng phân lập ñược từ Hải Phòng và cho kết quả mẫn cảm với các loại kháng sinh Chloramphenicol, Norfloxacin, Ampicilin, còn với các chủng tại Tiền Giang thì Bùi Trung Trực (2004) cho rằng chúng vẫn mẫn cảm mạnh với Norfloxacin và Colistin

Khi thử nghiệm phòng và trị bệnh dung huyết cho lợn con ở Thái Nguyên và Bắc Giang, Nguyễn Thị Kim Lan (2004) ñã kết luận: Vi khuẩn phân lập từ lợn bệnh rất mẫn cảm với kháng sinh Amikacin, kém hơn với Doxycycline, không mẫn cảm với Ampicilin và Cefuroxime

Trương Quang và cs (2006) kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của

các chủng vi khuẩn E.coli gây hội chứng tiêu chảy cho bê, nghé ñã cho thấy các loại

kháng sinh Neomycin, Norfloxacin và Colistin có tác dụng tốt

Như vậy, có thể thấy qua thời gian và ở các ñịa ñiểm khác nhau, tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cũng khác nhau

Vai trò của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu chảy

Trong chăn nuôi lợn, hội chứng tiêu chảy xảy ra ở mọi lứa tuổi và ñã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh Các tác giả trong và ngoài nước ñều nhấn

mạnh vai trò của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu chảy

Theo nhiều nhà nghiên cứu khoảng 20-50% lợn con chết trong những ngày

sơ sinh do E coli gây nên, ñôi khi tỷ lệ chết tới 10% (Niconxki.V.V, 1986)

ðể xác ñịnh vai trò của một E coli gây ra một bệnh nào ñó, cần kiểm tra ñộc lực và các yếu tố gây bệnh mà chủng E coli ñó có ñược Do vậy, kết quả những nghiên cứu về ñộc lực, yếu tố gây bệnh của E coli chính là ñánh giá khả năng gây

bệnh của nó (Lê Văn Tạo và cs, 2003)

Cù Hữu Phú và cs (2004) ñã kết luận, vi khuẩn E coli là nguyên nhân chính gây hội chứng tiêu chảy ở lợn con theo mẹ, các chủng E coli có thể mang tổ hợp các

yếu tố gây bệnh như: LT + STa + STb + K88 + Hly+ (29.29%); LT + STa + STb + Hly- (8.33%)

Khi nghiên cứu về vai trò gây bệnh của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu

chảy ở lợn 1-60 ngày tuổi, tác giả Trương Quang (2005) ñã có kết luận: 100% mẫu

phân của lợn bị tiêu chảy phân lập ñược E coli với số lượng gấp 2,46-2,73 lần (ở

lợn 1-21 ngày tuổi) và 1,88-2,1 lần (ở lợn 22 - 60 ngày tuổi) so với lợn không tiêu

chảy Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E coli phân lập từ lợn bị tiêu chảy có ñộc lực mạnh

và các yếu tố gây bệnh cao hơn rất nhiều so với ở lợn không bị tiêu chảy Cụ thể: yếu tố bám dính: 93,33% so với 33,33%; khả năng dung huyết: 53,33% so với 25,92%; ñộc tố chịu nhiệt (LT): 90% - 11,11%, cả 2 loại ST + LT: 73,33% so với 1,4%, ñộc lực mạnh (giết chết 100% chuột): 90% so với 0%

Tìm hiểu nguyên nhân chủ yếu gây hội chứng tiêu chảy lợn con, Hồ Soái và

cs (2005) ñã nhận xét, 100% mẫu phân lợn tiêu chảy phân lập ñược E coli với số

lượng nhiều gấp 2,37 lần (1- 45 ngày tuổi) và gấp 2,31 lần (45 - 60 ngày tuổi) so với

lợn bình thường không tiêu chảy ðộc lực của vi khuẩn E coli và Salmonella gây

chết chuột từ 50 - 100%, thời gian gây chết 6 -36 giờ ðộc tố gây bệnh của vi khuẩn

Vi khuẩn Salomonella thường ñược ñặt tên theo nơi phân lập ñược như

S.newsport, S.dublin, hoặc theo triệu chứng, bệnh tích gây nên: S.enteritidis, S.cholerasuis Ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu bước ñầu của Lê Văn Tạo và cs

(1997) cho thấy, S.choleraesuis chiếm 50%, S.typhimurium chiếm 6,25%,

S.entertidis chiếm 12,5% và 31,25% thuộc các loại Serotypee khác

ðặc ñiểm hình thái cấu trúc

Là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai ñầu tròn, có kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1 - 3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào, có lông và di ñộng ñược

(trừ S Pullorum-gallinarum) Vi khuẩn bắt màu gram âm

Kháng nguyên vỏ (K-Antigen) chỉ có ở một số loài như S.typhi,

S paratyphi S dublin có thể chứa Vi-Antigen giống như K-antigen của vi khuẩn

Kháng nguyên Vi là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng

thể O khi nó phát triển nhiều, kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 loài S.typhi và

S.paratyphi C, kí hiệu Vi trong công thức ñứng sau kháng nguyên O Theo sơ ñồ

của Kauffmann-White, công thức kháng nguyên của S.paratyphi C: 6, 7, Vi: -1, 5

và S typhi: 9, 12, Vi: c, d

ðặc tính nuôi cấy, sinh hoá

ðặc tính nuôi cấy

Là trực khuẩn vừa hiếu khí, vừa yếm khí, nhiệt ñộ thích hợp cho sự phát triển

là 37oC, ñộ pH = 7,2-7,6 Vi khuẩn có sức chịu ñựng tốt với các ñiều kiện khắc nghiệt Chúng có thể phát triển ñược từ 7-45oC; tồn tại ñược ở trong băng ñá và

ngay cả khi bị sấy khô qua nhiều tuần, tháng và vài năm ở trạng thái tiềm sinh

Vi khuẩn cũng có thể bị diệt bằng nhiệt ñộ, ánh sáng mặt trời, các chất sát trùng thông thường như phenol, formol hoặc crezyl v.v

Trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn ñược nuôi cấy trên các môi trường:

Trên môi trường nước thịt: Làm ñục, sinh cặn ở ñáy ống nghiệm, có màng mỏng và mùi thối

Trên môi trường SS (Shigella): Do không lên men ñường lactose, khuẩn lạc

ở dạng trong hoặc không màu

Môi trường Endo: Khuẩn lạc có màu vàng

Môi trường thạch EMB: Khuẩn lạc có màu ñỏ

ðặc tính sinh hoá

Chuyển hoá ñường: Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi

glucose, mannit, mantose, galactose, levulo, mantol

Tất cả các loài Salmonella không lên men lactose

Cơ chế gây bệnh

Quá trình gây bệnh ở trong ñường tiêu hoá của vi khuẩn Salmonella lần ñầu

tiên ñược mô tả bởi một thí nghiệm trên chuột lang vào năm 1967 (Wilcock.B.P&

Schwartz.K.J, 1992) Thí nghiệm cho thấy, qua một quá trình sinh sản trên bề mặt

thành ruột, vi khuẩn sẽ xuyên qua lớp màng và xâm nhập vào bên trong tế bào biểu

mô, ñặc biệt ở ñoạn hồi tràng Tại ñây, nó gây tổn thương các tế bào biểu mô ruột

Trong giai ñoạn này, vi khuẩn bị thực bào, song các ñại thực bào không phá huỷ

ñược vi khuẩn hoàn toàn Kết quả là sau 24 giờ xâm nhập, vi khuẩn ñã phát triển

trong ñại thực bào và mô lympho ruột ðồng thời với sự phát triển nhanh về số

lượng vi khuẩn là việc xuất hiện thể bệnh cấp tính, sự tập trung các ñại thực bào,

phản ứng viêm tạo thành huyết khối, gây rối loạn tuần hoàn cục bộ vi mạch ở lớp

dưới niêm mạc Hậu quả là dẫn tới hoại tử ở niêm mạc ruột tại ñiểm bị vi khuẩn tấn

công ðặc ñiểm bệnh tích trên có thể coi là 1 trong những dấu hiệu ñặc trưng bệnh

do vi khuẩn Salmonella gây ra

Posposchil A và cs (1990) ñã tiến hành thí nghiệm cho lợn cai sữa uống vi

khuẩn S typhimurium, vi khuẩn phát triển nhanh chóng trong ruột và lan tràn

nhanh ñến các hạch lympho, chỉ cần sau 24 giờ ñã có thể phân lập ñược vi khuẩn

ở trong hạch amidan và hạch dưới hàm Tác giả cũng cho rằng, sự xâm nhập của

vi khuẩn qua lớp niêm mạc ruột ñược coi như là một ñiều kiện tiên quyết cho bệnh

phát triển Với Serotypee S.choleraesuis, số lượng vi khuẩn không phải là một

ñiều kiện tiên quyết, bởi vì trong thực tế chúng luôn xâm nhập vào lớp niêm mạc ruột nhiều hơn so với Serotypee khác, vì vậy quá trình sinh bệnh của chúng luôn bắt ñầu bằng chứng nhiễm trùng huyết và sau 24 - 72 giờ con vật mới xuất hiện triệu chứng tiêu chảy dữ dội

Như vậy, khả năng gây bệnh của vi khuẩn Salmonella cũng giống như với vi khuẩn E.coli ñó là khi gặp ñiều kiện bất lợi, làm giảm sức ñề kháng của con vật thì

vi khuẩn thường trực sẽ tăng ñộc tố và gây bệnh

Khả năng mẫn cảm với kháng sinh

Cũng như vi khuẩn E.coli, vi khuẩn Salmonella cũng kháng với nhiều loại

kháng sinh, mà nguyên nhân là do trong quá trình chăn nuôi, ñiều trị bệnh còn có nhiều thiếu sót về kỹ thuật như dùng thuốc không ñúng liều lượng, không ñủ thời gian… và khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn với nhau

Các tác giả Nguyễn Quang Tuyên (1996), Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho

(1999) cho thấy, vi khuẩn Salmonella mẫn cảm mạnh với Chloramphenicol, mẫn

cảm trung bình với Neomycin và kháng mạnh với Chlotetracyclin, Penicillin, Ampicillin và Sulphonamide với 100% số chủng nghiên cứu

Nghiên cứu của Cù Hữu Phú và cs (1999) cho rằng: Vi khuẩn Salmonella

mẫn cảm mạnh với Neomycin và Nitrofurazolidon với 80-90% số chủng phân lập ñược và kháng mạnh với Penicillin và Ampicillin

Theo Nguyễn Thị Oanh, Phùng Quốc Chướng (2003) cho rằng, vi khuẩn

Salmonella mẫn cảm cao với Ciprofloxacin, Ceftrixazone, Trimethoprim/ Sulfamid

và Nalidixide acid, rất ít hoặc không mẫn cảm với Ampicilin, Erythromycin, Penicillin

Các chủng vi khuẩn Salmonella có ñộ mẫn cảm cao với Furazolidon (100%),

Chloramphenicol (87,5%), và ít mẫn cảm với Penicillin (25%) và hoàn toàn kháng với Tetracyclin (ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên, 2001)

Qua ñó, ta thấy các loại thuốc như Furazolidon, Chloramphenicol,

Nitrofurazolidon là thuốc có tính mẫn cảm cao với vi khuẩn Salmonella Tuy nhiên,

hiện nay theo quy ñịnh của Nhà nước, các loại thuốc này là loại thuốc cấm sử dụng trong phòng và trị bệnh cho vật nuôi Vì vậy, cần có những nghiên cứu tính mẫn cảm

của vi khuẩn Salmonella với các loại kháng sinh khác

Vai trò của vi khuẩn Salmonella trong hội chứng tiêu chảy

Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn con theo mẹ là rất ít gặp Bởi vì,

trong máu của lợn con còn hàm lượng kháng thể cao do sữa ñầu của lợn mẹ cung cấp và có hoạt ñộng bảo hộ cho ñến khi những lợn con cai sữa Lợn sau cai sữa do không còn nguồn cung cấp globulin miễn dịch, nguồn thức ăn và pH ñường ruột thay ñổi, vì thế con con rất dễ bị nhiễm bệnh (Wilcock.B.P, 1978) Bergeland (1980)

Wilcock.B.P, Schwartz.K.J (1992) cho rằng, bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn

Salmonella gây ra chủ yếu cho lợn con sau cai sữa với các triệu chứng ñiển hình là

nhiễm trùng huyết, nhiễm ñộc huyết và viêm ruột ỉa chảy Tác giả còn cho biết, vi khuẩn có thể gây bệnh cho lợn nuôi bởi nhiều Serotypee có trong tự nhiên, nhưng với

hội chứng tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa thì chỉ phát hiện có 2 Serotypee là S

choleraesuis và S typhimurium Trong 2 chủng vi khuẩn Salmonella thường xuyên

gây hội chứng tiêu chảy cho lợn, S choleraesuis ñược phát hiện trên 95%, S

typhimurium khoảng 4% và dưới 1% thuộc về những Serotypee khác (Schwartz.K.J,

1992)

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Nội và cs (1989), có tới 82,8% ñến 100%

số lợn tiêu chảy phân lập ñược vi khuẩn Salmonella gây bệnh

Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Tạo và cs (1993) ñã chỉ ra rằng trong số, 50

mẫu bệnh phẩm từ lợn tiêu chảy, ñã phân lập ñược 16 chủng Salmonella sp, trong ñó

có 8 chủng thuộc S choleraesuis, 2 chủng S enteritidis và 1 chủng S.typhimurium

Nghiên cứu lợn tiêu chảy ở các cơ sở chăn nuôi tập trung của các tỉnh miền

Bắc, Cù Hữu Phú và cs (2000) ñã cho thấy, tỷ lệ phân lập ñược vi khuẩn Salmonella

gây bệnh tới 80% số mẫu xét nghiệm

Cũng như họ vi khuẩn ñường ruột, vi khuẩn Salmonella muốn trở thành gây

bệnh phải hội tụ ñủ 3 ñiều kiện là phải thực hiện ñược chức năng bám dính vào cơ thể vật chủ, sản sinh ñộc tố và có khă năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của nhung

mao ruột ñể nhân lên Yếu tố bám dính của vi khuẩn Salmonella là fimbriae thuộc

Serotypee I (Cholerae Factor Adherence-CFA/I) ðộc tố ñường ruột của vi khuẩn

Salmonella gồm 2 thành phần cơ bản là ñộc tố thẩm xuất nhanh (RPF-Rapid

Permeability Factor - ðộc tố chịu nhiệt) và ñộc tố thẩm xuất chậm (DPF-Delayed Permeability Factor - ðộc tố không chịu nhiệt)

Khi nghiên cứu một số ñặc tính sinh hoá và yếu tố gây bệnh của các chủng

Salmonella phân lập ñược từ bê, nghé bị tiêu chảy, Nguyễn Văn Sửu, Nguyễn

Quang Tuyên, Trần Thị Hạnh (2005) ñã có kết luận: 14/17 (82,35%) chủng

Salmonella phân lập ñược có khả năng sinh ñộc tố thẩm xuất chậm (DPF-Delayed

Permeability Factor - ðộc tố không chịu nhiệt); 8/17 (47,06%) chủng sản sinh ñộc

tố thẩm xuất nhanh (RPF-Rapid Permeability Factor - ðộc tố chịu nhiệt); 5/17 (29,41%) chủng sản sinh cả 2 loại ñộc tố DPF và RPF Cơ chế gây bệnh của các ñộc

tố là làm rối loạn quá trình trao ñổi nước, chất ñiện giải, gây ra hiện tượng bệnh lý nước từ các cơ quan, tổ chức thẩm xuất vào ñường ruột dẫn ñến tiêu chảy

Wilcock.B.P, Schwartz.K.J (1992) [90] cũng cho biết, trong giai ñoạn sớm của bệnh, chứng tiêu chảy là kết quả của sự giảm hấp thu Na+ và tăng tiết dịch có

Cl- Vi khuẩn Salmonella cũng sản sinh ñộc tố ñường ruột Enterotoxin, ngoài việc

phá huỷ lớp niêm mặc ruột, ñộc tố này cũng có tác ñộng gây tiêu chảy

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng và thời gian

ðối tượng nghiên cứu:

Lợn con sau cai sữa từ 21 - 60 ngày tuổi (lợn khỏe mạnh và tiêu chảy)

Vi khuẩn E coli và Salmonella

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 06 năm 2011 ñến tháng 04 năm 2012 ðịa ñiểm nghiên cứu: Tại một số huyện ở tỉnh Hưng Yên

ðịa ñiểm xét nghiệm: Viện Thú y Quốc gia

3.2 Nội dung

- Phân lập, xác ñịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn từ phân lợn tiêu chảy

- Xác ñịnh số lượng vi khuẩn E.coli và Salmonella trong phân lợn tiêu chảy

+ Xác ñịnh yếu tố gây bệnh của chủng vi khuẩn E coli phân lập ñược

+ Kiểm tra ñộc lực của một số chủng vi khuẩn E coli và Salmonella phân lập

ñược trên ñộng vật thí nghiệm

+ Xác ñịnh ñộ mẫn cảm của vi khuẩn E.coli, Salmonella phân lập ñược ñối

với một số loại kháng sinh

- Xác ñịnh hiệu quả ñiều trị của những phác ñồ thử nghiệm trên lợn con sau cai sữa mắc tiêu chảy

3.3 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

Các loại môi trường: Thạch máu, thạch MacConkey, thạch TSI, thạch DHL, thạch

Brilliant Green, nước thịt BHI, nước thịt thường, nước thịt pepton, thạch Simmons citrate và các loại môi trường ñường Glucoze, Lactoze, Mannitol

Hóa chất:

Các loại giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh)

Kháng huyết thanh chuẩn dùng ñịnh type vi khuẩn E coli và Salmonella

phân lập ñược của Nhật và úc

Bộ nhuộm Gram, chỉ thị màu v.v

Dụng cụ: Que cấy, bông cồn, ống nghiệm, hộp lồng, bình tam giác, pipet, cân phân

Mẫu ñược bảo quản trong ñiều kiện lạnh 4oC, theo quy trình bảo quản mẫu của bộ môn Vi trùng, viện Thú y và ñược vận chuyển ngay ñến phòng thí nghiệm ñể tiến hành các xét nghiệm tiếp theo

Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

Các phương pháp nuôi cấy và giám ñịnh vi khuẩn ñược thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của bộ môn Vi trùng, viện Thú y Quốc gia

Mẫu là phân của lợn có triệu chứng tiêu chảy ñược ria cấy lên các môi trường thạch máu, thạch MacConkey và thạch DHL, bồi dưỡng ở tủ ấm 37oC trong

24 giờ Trên các ñĩa thạch sau 18 - 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, có thể quan sát thấy các dạng khuẩn lạc Sau ñó chọn khuẩn lạc ñiển hình, làm tiêu bản trên phiến kính, nhuộm Gram, kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu và tiến hành giám ñịnh bằng các ñặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn Nếu ñược xác ñịnh là thuần khiết thì dùng trong việc xác ñịnh Serotypee và giữ giống ñể tiến hành các thí nghiệm khác

Phương pháp phết kính: Dùng que cấy vô trùng, lấy một giọt nước sinh lý ñể vào phiến kính sạch, dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc ñiển hình vi khuẩn

E.coli, hoà tan phần khuẩn lạc ñã cấy vào giọt nước sinh lý trên phiến kính, cố ñịnh

tiêu bản trên ngọn ñèn cồn bằng phương pháp hơ trao (không ñể tiêu bản sát ngọn ñèn cồn)

Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram:

Bước 1: Nhỏ dung dịch tím Gemxian lên chỗ cố ñịnh vi khuẩn, ñể 1 - 2 phút, rửa sạch bằng nước, vẩy khô

Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol ñể 1 phút, rửa nước, vẩy khô

Bước 3: ðổ cồn axeton chảy qua thật nhanh chỗ phết vi khuẩn ñến khi không còn nhuộm màu nữa, rửa sạch bằng nước, vẩy khô

Bước 4: Nhỏ dung dịch fucsin ñể 1 phút, rửa nước, vẩy khô

Dùng giấy thấm thấm khô nước, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học bằng vật kính dầu với ñộ phóng ñại 100x, quan sát thấy hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn

Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn ñường ruột

(Bộ môn Vi trùng - viện Thú y)

Oxidase âm tính

Thạch máu Thạch MacConkey

E.coli

K pneumoniae

Enterobacter aerogenes

Salmonella Edwardsiella Proteus

Thạch DHL Thạch BG Nước thịt PBW

Thạch DHL Thạch BG

37o 48h/hiếu khí

C/24-37o 48h/hiếu khí

Lên men ñường

Mẫu (Phân)

Xác ñịnh số lượng vi khuẩn E.coli và Salmonella trong 1g phân của lợn tiêu chảy

và lợn bình thường

Mẫu là 1g phân của lợn bị tiêu chảy và lợn bình thường, ñược pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng ñộ 10-1, 10-2, …, 10-8 Lấy 0,1 ml dung dịch ở các nồng ñộ ñã pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn ñều trên bề mặt thạch MacConkey, thạch DHL, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ Mỗi nồng ñộ pha loãng

dùng 3 ñĩa thạch ðếm số khuẩn lạc E.coli và Salmonella mọc trên ñĩa thạch, rồi

tính trung bình cho mỗi nồng ñộ

Số lượng vi khuẩn ñược tính theo công thức:

X = 10 x a x b

Trong ñó:

X là tổng số lượng vi khuẩn có trong 1g phân hoặc chất chứa

a là số lượng vi khuẩn trung bình của 1 nồng ñộ pha loãng

b là hệ số pha loãng mẫu

Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml

Xác ñịnh Serotype kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập ñược

Vi khuẩn E coli:

ðược thực hiện bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Vi khuẩn

E Coli có nhiều Serotype O khác nhau, do vậy bước quan trọng ñầu tiên là xác ñịnh

ñược nhóm Serotype O, sau ñó tiến hành các phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh ñơn giá trong nhóm cần xác ñịnh Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác ñịnh Serotype gồm:

Các chủng E Coli cần ñịnh typ ñược giữ trên thạch máu

Các kháng huyết thanh O chuẩn (ña giá và ñơn giá)

Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính ñược tiến hành như sau:

Nhỏ lên 2 ñầu lam kính sạch, mỗi ñầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que

cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E Coli cần xác ñịnh trên môi trường thạch máu trộn ñều

với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (ñối chứng) Nếu có phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau 1 phút Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì ñược ñánh giá mức ++++ Tuỳ theo khả năng ngưng kết

ñể có thể ñánh giá mức ngưng kết ở các mức ñộ khác nhau +, ++, +++

Phản ứng là âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh ñục ñều như bên ñối chứng

Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh ñơn giá thuộc nhóm ñể xác ñịnh rõ từng Serotype Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều ñơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất

Vi khuẩn Salmonella:

ðược tiến hành ñịnh typ theo phương pháp Kauffmann (1972)

Xác ñịnh nhóm kháng nguyên O bằng huyết thanh ña giá:

Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh với kháng nguyên sống trên phiến kính

(Slide agglutination) ñể xác ñịnh nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella

Phương pháp tiến hành như sau:

Phiến kính sạch ñược chia làm 2 phần Dùng ống hút Pasteur hoặc que cấy

vô trùng, nhỏ mỗi bên phiến kính 1 giọt nước sinh lý Dùng que cấy vô trùng, lấy

một ít khuẩn lạc ñiển hình của chủng vi khuẩn Salmonella cần ñịnh typ ñã mọc trên

môi trường thạch máu, trộn ñều với nước sinh lý ñã nhỏ sẵn ở 2 bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên Sau ñó, tiến hành nhỏ 1 giọt huyết thanh ña giá nhóm O vào huyễn dịch kháng nguyên ñã chuẩn bị ở bên thí nghiệm, còn bên ñối

chứng thì nhỏ 1 giọt nước sinh lý (ñối chứng âm) và trộn ñều Sau 1 - 2 phút ñọc kết quả

Phản ứng dương tính khi có cụm ngưng kết xuất hiện, nước xung quanh trong

ðối chứng âm: hỗn dịch vẫn ñục ñều

Nếu hỗn hợp cả 2 ñầu phiến kính ñều xuất hiện hiện tượng ngưng kết là ngưng kết giả do vi khuẩn tự ngưng kết, phải tiến hành làm lại

Xác ñịnh Serotype kháng nguyên O bằng huyết thanh ñơn giá:

Chọn những chủng Salmonella ñã ngưng kết với huyết thanh ña giá nhóm O,

tiến hành làm phản ứng ngưng kết như trên với tất cả các huyết thanh nhóm O ñơn giá thuộc nhóm ñã ngưng kết Nếu chủng vi khuẩn ngưng kết với huyết thanh O ñơn giá nào thì thuộc Serotype O ñó

Xác ñịnh kháng nguyên H với kháng huyết thanh H ña giá:

Cho vào ống tuyp chứa 2,5ml canh trùng một lượng tương ñương dung dịch Salin và formol ðể ở nhiệt ñộ phòng trong 3 giờ Sau ñó, lấy 1 tuyp vô trùng mới, cho vào ñó 0,25 ml hỗn dịch nói trên, cho thêm vào ñó 0,25 ml kháng huyết thanh

ñã pha sẵn hoặc 1 giọt kháng huyết thanh H ña giá, ñun cách thuỷ 50°C trong 1 giờ ðọc kết quả:

Phản ứng dương tính khi kháng nguyên và kháng huyết thanh kết hợp với nhau, tạo nên những cụm kết tủa bông rõ ở ñáy ống nghiệm

Phản ứng âm tính khi không thấy những cụm bông kết tủa ở ñáy ống nghiệm Xác ñịnh kháng huyết thanh H ñơn giá:

Tương tự như xác ñịnh kháng nguyên O ñơn giá nhưng phải tiến hành làm phản ứng với 2 pha: phase 1 (ñặc hiệu) và phase 2 (không ñặc hiệu)

Xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập ñược

Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ñược kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch và ñánh giá kết quả theo Hội ñồng Quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS) (1999) Phương pháp tiến hành như sau:

Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch ñĩa Muller Hinton

Bước 2: Các chủng vi khuẩn ñược nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở

37oC Lấy 1 khuẩn lạc, hoà vào 1,5 ml nước sinh lý ñể ñạt ñược ñộ ñục 0,5 trong dãy so màu McFarland Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch ñã pha loãng và dàn ñều lên thạch ñĩa Muller Hinton

Bước 3: Dùng máy tự ñộng ñặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) lên mặt ñĩa thạch

Bước 4: Bồi dưỡng ñĩa thạch ở 370C/18 - 24 giờ ðọc kết quả bằng cách ño ñường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn ñể ñánh giá mức ñộ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra

Bảng 3.1 Tiêu chuẩn ñánh giá mức ñộ mẫn cảm và kháng kháng sinh

Tiến hành ựiều trị thử nghiệm

Từ kết quả xác ựịnh khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ựược, chúng tôi ựã tiến hành lựa chọn một số phác ựồ ựể ựiều trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy để ựánh giá ựược hiệu quả một cách khách quan, các phác ựồ ựược thực hiện có sự ựồng ựều tương ựối về các tiêu chắ cơ bản sau:

Số lợn tiêu chảy ở cùng một ựịa phương ựược phân ra làm 3 lô tương ứng với

3 phác ựồ ựiều trị bệnh Trong 3 phác ựồ ựó có sự khác nhau về việc sử dụng thuốc kháng sinh

Số lần và ngày ựiều trị bệnh ựược dùng ựồng ựều trong các phác ựồ

đánh giá hiệu quả của các phác ựồ ựiều trị căn cứ vào sự ổn ựịnh dần trạng thái phân, tình trạng ăn, uống sau 4 - 7 ngày, kể từ khi dùng thuốc

2 1

x x

TN

m m

X X t