phân lập và xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn salmonella tại một số trang trại lợn nuôi theo quy mô công nghiệp ở miền bắc

Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh ñộc tố ñường ruột Stn, yếu tố xâm nhập InvA của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR.... Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm của các chủng Salmonella phâ

BỘ GIÁO DỤC VÀ Đ Đ ĐÀO TẠO

TRĐĐĐỜNG ĐĐĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


-

NGUYỄN MẠNH PHƯƠNG

PHÂN LẬP VÀ XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI

KHUẨN SALMONELLA TẠI MỘT SỐ TRANG TRẠI LỢN

NUÔI THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Ở MIỀN BẮC

Chuyên ngành : THÚ Y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Bá Tiếp

Hµ néi - 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất cứ công trình nào khác

Các tài liệu tham khảo, trích dẫn ñều có nguồn gốc rõ ràng

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Mạnh Phương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn sợ giúp ựỡ của các thầy cô giáo Viện đào tạo Sau ựại học và Khoa Thú y Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã giành nhiều thời gian, công sức giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện ựề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Nguyễn Bá Tiếp Bộ môn Giải phẫu Ờ Tổ chức Khoa Thú y trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, PGS.TS Cù Hữu Phú trưởng Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú y Quốc gia, Th.S Văn Thị Hường Bộ môn

Vi trùng Ờ Viện Thú y Quốc gia, B.S Natipong Lampa giám ựốc Phòng thắ nghiệm Công ty C.P Việt Nam ựã tận tình giúp ựỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn Xin chân thành cám ơn các cán bộ công nhân viên chức Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú y Quốc gia, các cán bộ công nhân viên chức Phòng thắ nghiệm Công ty C.P Việt Nam ựã tạo ựiều kiện giúp ựỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện ựề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia ựình, bạn bè, ựồng nghiệp luôn ựộng viên, giúp ựỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tác giả

Nguyễn Mạnh Phương

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

Phần IðẶT VẤN ðỀ 1

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Mục ñích nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học của ñề tài 2

Phần IITỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 3

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 5

2.2 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella 7

2.2.1 ðặc ñiểm hình thái 7

2.2.2 Tính chất nuôi cấy 8

2.2.3 ðặc tính sinh hoá 9

2.2.4 Sức ñề kháng của vi khuẩn Salmonella 9

2.2.5 ðặc ñiểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella 10

2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella 11

2.2.7 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella 13

2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn 17

2.3.1 Thể nhiễm trùng huyết do S.choleraesuis chủng kunzendorf 17

2.3.2 Thể viêm ruột do S typhimurium 19

2.4 Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn 21

2.4.1 Phòng bệnh 21

2.4.2 ðiều trị bệnh 21

Phần IIIðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu 23

3.1.1 ðối tượng 23

3.1.2 ðịa ñiểm 23

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 23

3.3.1 Mẫu thí nghiệm 23

3.3.2 Các loại môi trường thông thường và ñặc hiệu dùng ñể nuôi cấy, phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella 24

3.3.3 Các loại hóa chất 24

3.3.4 Các loại kháng huyết thanh chuẩn ñể ñịnh typ vi khuẩn Salmonella 24

3.3.5 Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR 24

3.3.6 Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 25

3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella 25

3.4.3 Phương pháp giám ñịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 27

3.4.4 Phương pháp xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella 29

3.4.5 Phương pháp xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh 31

3.4.6 Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh (ñộc tố ñường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR 32

3.4.7 Kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược bằng phương pháp tiêm truyền qua ñộng vật thí nghiệm 34

3.4.8 Phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị 35

Phần IVKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các trang trại nuôi lợn công nghiệp ở miền Bắc 36

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu nước: 40

4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu cơ quan của lợn nghi mắc bệnh 43

4.4 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hóa của các chủng Salmonella phân lập ñược 46

4.5 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 50

4.6 Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm của các chủng Salmonella phân lập ñược với một số loại kháng sinh 52

4.7 Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược 54

4.8 Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 56

4.9 Kết quả một số phác ñồ ñiều trị tiêu chảy do Salmonella 59

Phần VKẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 62

5.1 Kết luận: 62

5.2 ðề nghị: 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng

sinh 32

Bảng 3.2 Trình tự các cặp mồi và kích thước sản phẩm xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược 33

Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các trang trại 36

Bảng 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong mẫu phân 37

Bảng 4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu nước 41

Bảng 4.4 Kết quả phân lập Salmonella từ mẫu nước có xử lý chlorine và mẫu nước không xử lý chlorine 42

Bảng 4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạng 45

của lợn nghi mắc bệnh 45

Bảng 4.6 Kết quả xác ñịnh hình thái, tính chất bắt màu, ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược……… 48

Bảng 4.7 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 50

Bảng 4.8 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 51

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 53

Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược bằng phương pháp tiêm truyền qua chuột nhắt trắng 54

Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng 57

vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 57

Bảng 4.12 Các phác ñồ thử nghiệm ñiều trị tiêu chảy do Salmonella 60

Bảng 4.13 Kết quả thử nghiệm một số phác ñồ 61

ñiều trị tiêu chảy do Salmonella 61

DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH

Hình 4.1 So sánh tỷ lệ phân lập ñược Salmonella từ các trang trại lợn có triệu

chứng tiêu chảy ở các tỉnh 37

Hình 4.2 So sánh kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong mẫu phân 38

Hình 4.3: Lợn bị nhiễm Salmonella biểu hiện tím tai, tím vùng bụng dưới 39

Hình 4.4: Lợn bị tiêu chảy do Salmonella phân vàng, như nước 39

Hình 4.5 So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nguồn nước uống 41

Hình 4.6 So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nước của các 42

trang trại không xử lý nước bằng chlorine ở các tỉnh 42

Hình 4.7: Mổ khám lợn tiêu chảy nghi do Salmonella 44

Hình 4.8: Ruột xuất huyết, có màng giả 44

Hình 4.9 So sánh tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạngcủa lợn nghi mắc bệnh 45

Hình 4.10: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường CHROM 47

Hình 4.11: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường DHL 47

Hình 4.12 Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI và môi trường LIM 49

Hình 4.13 So sánh tỷ lệ các chủng Salmonella phân lập ñược 51

Hình 4.14 & 4.15: Mổ khám chuột chết sau khi tiêm canh trùng Salmonella 55

Hình 4.16 So sánh tỷ lệ dương tính với một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella kiểm tra bằng phương pháp PCR 57

Hình 4.17 Sản phẩm PCR xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố ñường ruột và yếu tố xâm nhập với ñối chứng tương ứng ở giếng 5 (259 bp và 521 bp); các ñối chứng âm (giếng 6&7); các mẫu dương tính với Stn (giếng 1,3,4) và với InvA (1,2,3,4); giếng 8, thang chuẩn 1000 bp 58

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Agronomique pour le Developpement

Phần I ðẶT VẤN ðỀ

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Chăn nuôi công nghiệp tác ñộng tích cực ñến quá trình nhiễm trùng và phát bệnh truyền nhiễm Thực tế cho thấy trong các trang trại vật nuôi chỉ mắc một số ít loại bệnh ðây là kết quả của quy trình tiêm vacxin, hạn chế sự phát triển và tiếp xúc với vật chủ trung gian truyền bệnh, sử dụng thuốc ñiều trị và các quy trình khác Tuy vậy, tính kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh là nguyên nhân làm giảm hiệu quả ñiều trị của thuốc, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và gây thiệt hại kinh tế (EMEA, 2006)

Vi sinh vật gây bệnh có khả năng biến ñổi trong phạm vi từng loài vật chủ hay do tương tác giữa vật chủ với chính bản thân vi sinh vật ñó Có nhiều chỉ tiêu ñánh giá mức biến ñổi của vi sinh vật theo các yếu tố không gian và thời gian Những chỉ tiêu thường ñược quan tâm hơn cả gồm thành phần loài, các typ, subtyp, ñặc tính sinh hóa, ñộc lực, khả năng ñề kháng với các tác nhân hóa học ñặc biệt là thuốc sát trùng và kháng sinh Nhiều thay ñổi ñược tạo ra do biến ñổi di truyền của bản than vi sinh vật Các biến ñối của vi khuẩn và virus theo thời gian ñã và ñang thách thức các chiến lược nghiên cứu, sản xuất và sử dụng vacxin cũng như kháng sinh trong chăn nuôi mà hậu quả cuối cùng là dịch bệnh vẫn sảy ra, gây tổn thất kinh tế (Baxendale, 1996) Ảnh hưởng dây chuyền mang tính tuần hoàn sẽ tác ñộng làm thay ñổi ñặc tính sinh học của vật nuôi và sức khỏe con người

Một trong những nhóm ñối tượng vi sinh vật gây bệnh ñược quan tâm là các vi khuẩn gây hội chứng tiêu chảy Mặc dù chuồng trại ñược thiết kế khoa học hơn (chuồng kín, có hệ thống ñiều hòa không khí…) và biện pháp phòng bệnh cũng ñược chú trọng hơn, nhưng hàng năm hội chứng tiêu chảy mà trong

ñó có nguyên nhân là do vi khuẩn Salmonella vẫn thường xuyên xảy ra và gây

thiệt hại không nhỏ ñến năng xuất chăn nuôi Xuất phát từ vấn ñề trên, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập và xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella tại một số trang trại lợn nuôi theo quy mô công nghiệp ở Miễn Bắc”

1.2 Mục ñích nghiên cứu

- Phân lập chủng Salmonella tại các trang trại nghiên cứu

- Xác ñịnh các ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella và vai trò của

Salmonella trong hội chứng tiêu chảy trên ñàn lợn nghiên cứu

- Thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị

1.3 Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài

- Bước ñầu nghiên cứu về các chủng Salmonella gây bệnh trên ñàn lợn

thịt nuôi theo phương thức chăn nuôi công nghiệp

- Thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị ñể tìm ra phác ñồ ñiều trị hiệu quả nhất

1.4 Ý nghĩa khoa học của ñề tài

- Kết quả nghiên cứu của ñề tài bổ sung, làm phong phú thêm lý luận cơ

sở về căn bệnh Salmonella

- Bổ sung các biện pháp ñiều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn thịt nuôi công

nghiệp có nguyên nhân do Salmonella, góp phần giải quyết các vấn ñề mà thực

tiễn sản xuất ñặt ra

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1885, vi khuẩn Salmonella lần ñầu tiên ñược phát hiện bởi Salmon

phân lập từ lợn mắc bệnh dịch tả; lúc ñó người ta cho rằng vi khuẩn này là

nguyên nhân gây bệnh dịch tả với cái tên Bacillus suipestifer Cho ñến năm

1903, khi Schweinitz và Dorset xác ñịnh ñược nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn

là do virus thì Bacillus suipestifer chỉ ñược coi là nguyên nhân gây bệnh thứ

phát (Selbitz, 1995)

Năm 1888, Gaertner A và Jena ñã xác ñịnh ñược nguyên nhân gây viêm ruột của người do ăn phải thịt bò chết ở Frankenhausen, bang Thuringen (ðức)

là vi khuẩn Bacillus enteritidis (hiện nay gọi là S enteritidis)

Năm 1891, Jensen C.O ñã phân lập ñược S dublin từ bệnh phẩm của bê

bị tiêu chảy Cũng vào năm ñó, S typhimurium ñược phát hiện ở vùng

Greiswald và Breslau

Tất cả các bệnh do Salmonella gây ra lúc ñầu ñược ñặt tên chung là Phó

thương hàn “Para-typhus”, cho ñến năm 1914, có 12 loài vi khuẩn ñược mô tả

và xếp vào giống Salmonella

Năm 1926, những công bố của White về cấu trúc kháng nguyên của

Salmonella ñã mở ñầu một thời kỳ mới của các nghiên cứu về giống vi khuẩn

này Sau ñó Kauffmann cũng rất thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về vi

khuẩn Salmonella (Selbizt, 1995)

Năm 1934, Kauffmann và White ñã thiết lập ñược bảng cấu trúc kháng nguyên ñầu tiên và ñặt tên là bảng phân loại Kauffmann-White Từ ñó ñến nay,

bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella vẫn luôn ñược bổ sung

Năm 1972, vi khuẩn Salmonella ñã ñược tìm thấy có trong phân lợn với

tỷ lệ 9,9% số mẫu; năm 1973, tiếp tục phát hiện Salmonella trong hạch màng treo ruột lợn ốm là 7.3% Tại Mỹ năm 1984 ñã phát hiện Salmonella trong máu lợn chết là 4,3% Năm 1989, Hungari công bố tỷ lệ mẫu phân lợn có Salmonella

tới 48% (Wilcock và Schwartz, 1992)

Năm 1993 ñã có 2375 serovar Salmonella ñược ñịnh danh (Selbizt, 1995)

Năm 1997, số serovar ñã lên ñến 3000 (Plonait và Birkhardt, 1997) ðến năm

1998 lại thêm 14 serovar khác ñược công nhận bổ sung vào bảng cấu trúc kháng

nguyên Như vậy, giống Salmonella luôn luôn thu hút sự chú ý của các nhà

chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật và y học (ðỗ Trung Cứ, 2004)

Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002) cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn

con theo mẹ là 4,5%, lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%

Tác giả cũng cho biết S typhimurium ñược phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau

cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%

Kishima và cs (2008) công bố tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi khuẩn

Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường tại Nhật Bản giữa năm 2003

và năm 2005 là 3,1%

Các nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho các loại vật nuôi

khác nhau cũng ñược nhiều tác giả công bố Selbizt (1995), Laval (2000) ñều

cho biết bệnh phó thương hàn cấp tính ở lợn con do S choleraesuis chủng

kunzendorf và bệnh viêm ruột mãn tính do S typhimurium gây ra Ở trâu bò,

bệnh chủ yếu do các loài S dublin và S entertidis gây ra Ở cừu, do S abortus

ovis, S montevideo, S dublin, S anatum gây ra Ở ngựa do S abortus equi gây

ra, còn ở gia cầm và chim do S pullorum, S gallinarum, S typhimurium và S

enteritidis gây ra

Theo Selbizt (1995), hệ gen (genome) của vi khuẩn ñã ñược công bố Cho ñến nay ít nhất 750 gen ñã ñược xác ñinh, trong ñó có 680 gen ñã có trong bản

ñồ gen vi khuẩn này

2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Ở Việt Nam, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người

và gia súc cũng ñã ñược bắt ñầu nghiên cứu từ lâu Ngay từ những năm 1951 – 1953, Viện Pasteur Sài Gòn ñã phân lập ñược 6 chủng ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu) Cũng ở Sài Gòn, trong thời gian này ñã phân lập

ñược 35 chủng từ 360 lợn, trong ñó có 23 mẫu là S cholereasuis (Nguyễn

Quang Tuyên, 1996)

Năm 1963, Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội kiểm tra tại lò sát sinh Lương Yến thấy trong 172 mẫu phân của công nhân ở ñây thì có 111 trường hợp nhiễm, tỷ lệ dương tính khoảng 64,53% (ðỗ ðức Diên, 1999) Nguồn tàng trữ

Salmonella chủ yếu là ñường tiêu hóa của người và ñộng vật mắc bệnh Ở người

có các loài S typhi, S paratyphi A, S paratyphi B, S paratyphi C Hai loài S

choleraesuis, S enteritidis chủ yếu ở ñộng vật nhưng cũng có khả năng gây

bệnh cho người

Kết quả nghiên cứu tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Bắc do Nguyễn

Thị Nội và cộng sự thực hiện (1989) cho thấy 37,5% lợn nhiễm Salmonella

Nhóm tác giả này ñã nghiên cứu và chế tạo thành công vacxin ña giá Salsco phòng bệnh ỉa chảy cho lợn con Vacxin ñã ñược áp dụng ñể phòng bệnh có hiệu quả ở nhiều trại chăn nuôi lợn, tỷ lệ lợn bị tiêu chảy giảm từ 30 – 50%, tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy giảm xuống còn 10 – 20%

Kết quả phân lập và xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn của Lê Văn Tạo (1993) cho thấy 50% các chủng phân lập ñược thuộc S

choleraesuis; 12,5% S enteritidis; 6,25% S typhimurium và số còn lại thuộc các

serotyp khác

Trần Xuân Hạnh (1995) ñã phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S paratyphi ở lợn 6 – 16 tuần tuổi là

2,8% ðặc biệt, vi khuẩn S choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh và 2,8% ở lợn

bình thường

Kết quả nghiên cứu của Phùng Quốc Chướng (1995) ở Tây Nguyên, mùa

khô lợn mắc bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra là 20,03%, thấp hơn trong mùa

mưa (28,66%) Theo Nguyễn Thị Oanh (2003) nghiên cứu ở ðăk Lăk cho kết

quả cũng tương tự : mùa mưa tỷ lệ mắc Salmonella trên lợn là 20,72% cao hơn

của mùa khô (13,26%)

Tạ Thị Vịnh và cs (1996) ñã kiểm tra 75 mẫu phân lợn khoẻ và 65 mẫu phân lợn bệnh tại một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây cũ) và Gia Lâm (Hà Nội)

cho thấy: Tỷ lệ nhiễm Salmonella là 30 – 56% ở lợn khoẻ trong giai ñoạn 22 –

60 ngày tuổi Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn mắc hội chứng tiêu chảy cao hơn

lợn bình thường và tăng dần theo lứa tuổi : 1 – 21 ngày tuổi: 70% ; từ 22 – 60 ngày tuổi : 75%, Trên 60 ngày : 86%

Hồ Văn Nam và cs (1997) ñã tiến hành gây viêm ruột cho 12 lợn sau cai sữa bằng cách cho uống nước muối và sau 10 giờ cho uống thêm 5ml canh trùng

ruột ở giai ñoạn nhiễm trùng Xét nghiệm vi khuẩn 12 lợn trên, 100% bệnh phẩm lấy ở ruột ; 85,71 – 100% bệnh phẩm là hạch lâm ba, gan, lách có

Salmonella cả thể cấp tính và mãn tính

Cù Hữu Phú và cs (2000), nghiên cứu Salmonella trong hội chứng tiêu

chảy ở lợn 35 ngày ñến 4 tháng tuổi nuôi xung quanh khu vực Hà Nội, cho biết

80% mẫu phân lợn tiêu chảy có nhiễm Salmonella Xác ñịnh ñặc tính sinh học, khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột của các chủng Salmonella phân lập ñược ;

các tác giả ñã chế thử nghiệm autovacxin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn, kết quả ñạt 89,22% lợn ñược phòng bệnh sau 4 tháng tiêm phòng

Theo Nguyễn Bá Hiên (2001), tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các ñàn lợn,

ngoại thành Hà Nội cao nhất là lợn trên 60 ngày tuổi (88,23%), thấp nhất là lợn

từ 1 – 21 ngày tuổi (73,68%)

Kết quả nghiên cứu của Hoàng Thị Phi Phượng và Trần Thị Hạnh (2005),

cho biết thức ăn ô nhiễm Salmonella ảnh hưởng trực tiếp tới lượng vi khuẩn thải

ra theo phân, lượng vi khuẩn thải ra có tương quan thuận với lượng vi khuẩn ăn vào và ảnh hưởng ñến khả năng sinh trưởng của lợn, làm giảm mức ñộ tăng trọng và tăng lượng thức ăn tiêu tốn của lợn

2.2 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae Giống Salmonella gồm 2 loài: S enterica và S bongori gồm trên 2000 serotyp

theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và ñôi khi các kháng nguyên vỏ (kháng nguyên

K) Gần ñây, loài S enterica ñã ñược phân thành 6 phân loài ñó là: S enterica

subsp enterica, S enterica subsp salamae, S enterica subsp arizonae, S enterica subsp diarizinae, S enterica subsp houtenae, S enterica subsp indica

Trong ñó phân loài S enterica subsp enterica gồm phần lớn các chủng Salmonella

là những tác nhân gây bệnh cho người và ñộng vật (Quinn và cs, 2002)

2.2.1 ðặc ñiểm hình thái

Vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hai ñầu tròn, có kích

thước 0,4 – 0,6 x 1,0 – 3,0 µm, bắt màu Gram âm, không hình thành nha bào và

giáp mô ða số loài Salmonella (trừ S gallinarum và S pullorum) có từ 7 ñến

12 lông (flagella) xung quanh thân nên chúng có khả năng di ñộng mạnh

Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella ñều có các cấu

trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili Chúng có kích thước chừng 0,01 – 0,03 x 1,0 µm Số lượng fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250 – 400 cái vươn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào Fimbriae làm cho vi khuẩn có khả năng bám dính vào các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc

Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm thông thường ; bắt màu Gram

âm (bắt màu ñều toàn thân hoặc hơi ñậm ở hai ñầu)

2.2.2 Tính chất nuôi cấy

Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi

cấy trên các môi trường dinh dưỡng thông thường Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp

là 37oC, nhưng có thể phát triển ñược ở nhiệt ñộ từ 6 – 42oC Nuôi cấy ở 43oC

có thể loại trừ ñược tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển ñược pH thích hợp

cho vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển ñược ở pH từ 6

– 9 Salmonella gây bệnh ở gia súc sinh trưởng tốt trong ñiều kiện hiếu khí, kém

hơn ở ñiều kiện kỵ khí

Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường nước thịt, môi trường BPW và môi trường RV : sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn ñục nhẹ, sau 18 ñến 24 giờ thấy canh trùng ñục ñều, trên mặt môi trường có màng mỏng, ñáy ống nghiệm có cặn

Trên môi trường thạch DHL : sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S), có màu vàng nhạt Các chủng sinh

H2S thì giữa khuẩn lạc có màu ñen

Trên môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa

Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella : sau 24 giờ nuôi cấy, vi

khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng

Trên môi trường thạch TSI : vi khuẩn Salmonella do sản sinh alkaline nên

phần thạch nghiêng có màu ñỏ (pH = 7,3), ñáy ống nghiệm màu vàng (pH = 6,8)

do vi khuẩn chỉ lên men ñường Glucose Phần giữa ống nghiệm có màu ñen do

vi khuẩn sản sinh ra khí H2S Nếu ñể lâu (quá 24 giờ), màu ñen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần ñáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng) Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi ñẩy thạch khỏi ñáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002)

Trên môi trường LIM (Lysine Indole Motility) : vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt Trên môi trường Malonate : vi khuẩn không phát triển nên không làm ñổi màu môi trường

2.2.3 ðặc tính sinh hoá

Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số loại ñường nhất ñịnh Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi các loại ñường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, arabinoza, sorbitol và levuloza Một số loài (S

typhi, S typhiuis, S choleraesuis, S enteritidis) cũng lên men các ñường

nhưng không sinh hơi Hầu hết các vi khuẩn Salmonella ñều không lên men

lactoza và saccaroza

ða số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy gelatin,

một số không phân giải urê, không sản sinh Indol Phản ứng catalaza dương tính Phản ứng oxidaza âm tính Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S paratyphi

A, S typhisuis, S choleraesuis)

Trong quá trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella thì ñặc tính

sinh hóa có ý nghĩa rất quan trọng ðây là bước không thể bỏ qua khi xét

nghiệm vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng

2.2.4 Sức ñề kháng của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt ñộ và các chất sát trùng mạnh Ở

nhiệt ñộ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ ở nước trong và 9 giờ ở nước ñục có thể diệt ñược

vi khuẩn (Laval, 2000) Cũng theo Laval (2000), vi khuẩn Salmonella sống ñược

lâu trong ñiều kiện lạnh ; chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở ñiều kiện môi trường có ñộ pH ≤ 5 chúng chỉ sống ñược trong thời gian ngắn

Trong nước thường Salmonella khó sinh sản, nhưng có thể tồn tại một

tuần, trong nước ñá tồn tại ñược 2 – 3 tháng

Vi khuẩn Salmonella có thể tồn tại trong chất ñộn chuồng tới trên 30 tuần,

có thể sống ở trong ñất với ñộ sâu 0,5cm trong thời gian 2 tháng Ở sàn gỗ,

tường gỗ trong ựiều kiện ắt ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (đào Trọng

đạt và cs (1995) Trong nước tù ựọng, ựồng cỏ ẩm thấp S typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100

ngày, trong thịt ướp muối từ 6 Ờ 8 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

2.2.5 đặc ựiểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi, phân bố ở khắp nơi

trên thế giới, vì vậy các nghiên cứu về cách truyền lây của vi khuẩn này ựược

nhiều nhà khoa học nghiên cứu Một ựặc ựiểm dịch tễ quan trọng của Salmonella

là trạng thái mang trùng và thải trùng của gia súc

Một nguồn bệnh ựặc biệt quan trọng là gia súc mang vi khuẩn Salmonella

nhưng không biểu hiện lâm sàng Những con này có thể thải mầm bệnh ra ngoài

môi trường trong vài tháng Gia súc nhiễm bệnh thải vi khuẩn Salmonella vào

trong phân và bệnh xảy ra do tiếp xúc trực tiếp hay ô nhiễm phân vào thức ăn,

nước uống hay chuồng trại gia súc Lợn nhiễm S choleraesuis thường biểu hiện

các dấu hiệu lâm sàng từ 36 Ờ 48 giờ sau khi nhiễm trùng và có 103 Ờ 106 ựơn

vị vi khuẩn trong 1 gram phân vào giai ựoạn bệnh cao nhất Phần lớn những lợn nhiễm tự nhiên sau khi khỏi bệnh, có thể loại thải hoàn toàn vi khuẩn trong khoảng thời gian 9 Ờ 12 tuần sau khi nhiễm trùng Như vậy trạng thái mang trùng kéo dài là một trong các nguyên nhân dẫn tới sự nhiễm khuẩn môi trường

và tạo cơ hội cho vi khuẩn nhiễmsự tái nhiễm tiếp theo của những ựộng vật mới ựưa vào trại

Vi khuẩn Salmonella có thể xâm nhập vào cơ thể vật chủ theo thức ăn,

nước uống vào ựường tiêu hóa hay do tiếp xúc Bình thường, vi khuẩn tồn tại trong ống tiêu hoá mà không gây bệnh Chỉ khi nào sức ựề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máum nội tạng và gây bệnh Bệnh phó thương hàn chỉ gây thành dịch ựịa phương, dịch bệnh phụ thuộc vào cơ cấu ựàn, tình hình vệ sinh thú y, chế ựộ chăm sóc nuôi dưỡng và ựặc ựiểm dịch tễ học của cơ sở ựó (Phan Thanh Phượng, 1988; Nguyễn Như Thanh, 2001; Laval , 2000)

Theo Phan Thanh Phượng (1988), tỷ lệ lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra

thường tăng lên vào thời kỳ lợn cai sữa, vì lúc ñó cơ thể lợn con thay ñổi, dễ nhiễm bệnh Nguyễn Như Thanh (2001) cũng cho biết: vi khuẩn gây ra bệnh phó thương hàn cho lợn con từ 2 – 4 tháng tuổi với tỷ lệ chết khoảng 25%, có khi lên ñến 95%; bệnh có thể ở lợn lớn với thể mạn tính và ít gây chết Lợn con trước cai sữa có tỷ lệ bị bệnh thấp hơn do ñược bảo hộ nhờ kháng thể có trong sữa ñầu của lợn mẹ Nguy cơ mắc bệnh tăng dần theo lứa tuổi, ñặc biệt là sau cai sữa, khi mà khả năng miễn dịch chủ ñộng chưa thể bù ñắp kịp thời ñể thay thế miễn dịch thụ ñộng (Laval, 2000)

2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella hết sức phức tạp, bao

gồm 3 loại chính:

Kháng nguyên O (O – Antigen) còn gọi là kháng nguyên thân

Kháng nguyên H (H – Antigen) hay kháng nguyên lông

Kháng nguyên K (K – Antigen) còn gọi là kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên thân O (O – Antigen)

Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc Lipopolysaccharide là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn Gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat stable) và kháng cồn, bị biến tính khi sử lý bằng formaldehyde Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính:

- Polysaccharide không có nhóm hydro, không mang tính ñặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (smooth) sang dạng R (rough) dẫn ñến giảm ñộc lực của vi khuẩn (Selbitz, 1995)

- Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết ñịnh tính kháng nguyên và ñặc trưng cho từng serotyp

Kháng nguyên O ñược xem như là một nội ñộc tố (endotoxin) mà nó ñược cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp Glyco – polypeptide có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn Theo CIRAD (2006), kháng nguyên O của vi khuẩn

Salmonella cĩ 67 loại chính, được chia thành hơn 50 nhĩm, số cịn lại đĩng vai

trị phụ

Kháng nguyên lơng H (H – Antigen)

- Kháng nguyên lơng H là protein nằm trong thành phần lơng của vi

khuẩn, là loại kháng nguyên khơng chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn

và axit yếu (Nguyễn Như Thanh va cs, 2001) Kháng nguyên H gồm cĩ 2 pha:

Pha 1: cĩ tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên được biểu thị bằng chữ mẫu la tinh thường: a,b,c,d, ,z

Pha 2: Khơng cĩ tính đặc hiệu, gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay chữ cái Latinh viết thường như e,n,x, Tuy nhiên, trong từng tế bào vi khuẩn riêng biệt luơn luơn chỉ xuất hiện từng pha, bởi vậy mà

trong chẩn đốn, để đạt được một cơng thức kháng nguyên hồn chỉnh cho

Salmonella phải thay đổi pha Cĩ các lồi Salmonella như S typhisuis, hoặc S enteritidis thì chỉ tạo 1 pha

Kháng nguyên H khơng quyết định yếu tố độc lực của vi khuẩn, cũng như khơng cĩ ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phịng bệnh, nhưng nĩ cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc xác định giống lồi của vi khuẩn

Kháng nguyên vỏ (K – Antigen hay Vi – Antigen)

Theo Quinn (1995), kháng nguyên vỏ chỉ cĩ ở một số lồi như S typhi,

S paratyphi S dublin cũng cĩ thể mang kháng nguyên vỏ, kháng nguyên K cĩ thể

làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo tác giả, nếu đun sơi huyễn dịch của

các lồi Salmonella này trong 10 – 12 phút sẽ phá hủy được kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên cĩ khả năng ngưng kết

kháng thể O khi phát triển nhiều Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là:

S.typhi và S.paratyphi C, ký hiệu kháng nguyên hay Vi trong cơng thức đứng

sau kháng nguyên O Theo sơ đồ của Kauffmann – White; cơng thức kháng

nguyên của S.paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S.typhi là: 9, 12, Vi: c,d

Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên

H là 2 loại kháng nguyên cĩ ý nghĩa quan trọng trong cơng tác chẩn đốn

2.2.7 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella

Salmonella là vi khuẩn sống hoại sinh trong đường tiêu hĩa của người và

gia súc Bình thường, vi khuẩn khơng gây bệnh, đến khi cơ thể yếu hoặc do yếu

tố nào đĩ bất lợi làm giảm sức đề kháng của cơ thể thì vi khuẩn Salmonella tăng sinh rất nhanh (bội nhiễm) và gây bệnh Quá trình tác động gây bệnh của

Salmonella cĩ sự tham gia của các yếu tố khơng phải là độc tố và các yếu tố là

độc tố

2.2.7.1 Các yếu tố khơng phải là độc tố

Kháng nguyên O:

Chất lượng thành phần hĩa học, cấu trúc kháng nguyên O đều ảnh

hưởng tới độc lực của vi khuẩn Salmonella Kháng nguyên này là yếu tố độc lực

giúp vi khuẩn chống lại khả năng phịng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào Kháng nguyên O kích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phịng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn

Kháng nguyên H:

Kháng nguyên H khơng cĩ ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phịng bệnh, cũng khơng quyết định yếu tố độc lực, tuy vậy nĩ cĩ vai trị bảo vệ cho vi khuẩn khơng bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào đại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận (Weinstein và

cs, 1984)

Kháng nguyên K:

Bản chất hĩa học của kháng nguyên K là polysaccharide, nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào

(Nguyễn Như Thanh, 2002)

Yếu tố bám dính

Khả năng bám dính của vi khuẩn Salmonella lên tế bào nhung mao ruột

là bước khởi ñầu quan trọng trong quá trình gây bệnh Yếu tố bám dính của

Salmonella là Fimbriae typ 1

Khi yếu tố bám dính Fimbriae typ 1 của Salmonella có ñiện tích ion bề

mặt trái với ñiện tích ion bề mặt tế bào nhung mao ruột thì ñiểm tiếp xúc có lực hút và vi khuẩm bám dính lên bề mặt của tế bào

Quá trình bám dính xảy ra theo 3 bước:

Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này ñòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ñộng

Bước 2: Là quá trình hấp phụ vi khuẩn lên nhung mao ruột, phụ thuộc vào ñặc tính bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và ñược thực hiện theo hướng thuận nghịch với sự tương hỗ của những tác ñộng khác nhau

Bước 3: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các ñiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào

Khả năng bám dính là yếu tố quan trọng của vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ Những vi khuẩn có ñộc lực cao có khả năng bám dính tốt hơn các

vi khuẩn có ñộc lực thấp

Khả năng xâm nhập:

Khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của ñường

ruột là ñặc tính của một số chủng Salmonella có ñộc lực Các biến chủng

Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không

có ñộc lực

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác ñộng làm tăng

hàm lượng Ca2+ nội bào, hoạt hóa actindepolimeriring enzymes, làm thay ñổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến ñổi màng tế bào, dẫn ñến hình chân giả bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Sau ñó

Salmonella ñược xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số

lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh ñộc tố ñường ruột (enterotoxin), làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ

Khả năng tổng hợp sắt:

ðây là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống ñỡ của vật chủ do bị thiếu sắt Vi khuẩn Salmonella

có phản ứng với sự thay ñổi cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị

ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein màng ñiều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cường một cách rõ rệt

Khả năng kháng kháng sinh:

Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh ñể phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc, gia cầm, ñã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid kháng kháng sinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường

Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên nhiều lần Khả năng kháng kháng sinh có thể thay ñổi, phụ thuộc vào ñịa phương, thời ñiểm làm kháng sinh ñồ và loại vật nuôi

Theo Tô Liên Thu (2005), trong 20 chủng Salmonella phân lập từ thịt lợn ñược thử 9 loại kháng sinh cho thấy: Salmonella kháng lại các kháng sinh thông

thường như Streptomycin, Ampicilin, Chloramphenicol bị kháng lại với tỷ lệ > 30%, nhiều chủng có ñặc tính ña kháng, có chủng kháng lại 8 loại kháng sinh

Trên ñây là 7 yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố của vi khuẩn

Salmonella Các yếu tố này bằng những cơ chế tác ñộng khác nhau, phương

thức tác ñộng khác nhau, ñã tạo ñiều kiện bất lợi cho cơ thể vật chủ, ñồng thời

chúng lại tạo ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Salmonella gây bệnh Chính vì

thế các yếu tố không phải là ñộc tố ñóng vai trò hết sức quan trọng trong quá

trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella Vì vậy, việc nghiên cứu các yếu tố này

là hết sức cần thiết, góp phần quan trọng trong việc phòng chống bệnh do vi

khuẩn Salmonella gây nên

2.2.7.2 Các yếu tố là ñộc tố

Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố là những tác nhân

gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các

yếu tố gây bệnh là ñộc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết ñịnh quá trình sinh bệnh

Các yếu tố gây bệnh là ñộc tố của Salmonella bao gồm: nội ñộc tố (endotoxin),

ngoại ñộc tố ñường ruột (enterotoxin) và ñộc tố tế bào (cytotoxin)

ðộc tố ñường ruột (Enterotoxin): ðộc tố ñường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: ðộc tố thẩm xuất nhanh và ñộc tố thẩm

xuất chậm

ðộc tố thẩm xuất nhanh (Rapid permeability factor: RPF) có cấu trúc,

thành phần giống với ñộc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (Heat Stabile Toxin:

ST) ST có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt ñộ thấp, có thể bảo quản ở - 20oC RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu

mô của ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1 – 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO

ðộc tố thẩm xuất chậm (Delayed permeability factor: DPF) có cấu trúc,

thành phần giống ñộc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (Heat Labile

Toxin: LT) Nó thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18 – 24 giờ, có thể kéo dài 36 – 48 giờ DPF bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptide và một số hợp chất khác, phân tử lượng 40.000 – 50.000 dalton

Nội ñộc tố (Endotoxin)

Nội ñộc tố ñóng vai trò quan trọng gây nên những biến ñổi bệnh lý do

Salmonella gây ra, nhất là trong giai ñoạn nhiễm trùng huyết Thành phần chủ

yếu của nó là Lipopolysaccharide

Nội ñộc tố là Lipopolysaccharide ñược tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Gan, thận, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa,cơ và hệ thống miễn dịch là ñích tấn công của nội ñộc tố Lipopolysaccharide còn tác ñộng lên quá trình trao

ñổi chất và các bào quan

Lipopolysaccharide còn góp phần tăng ñộc lực của vi khuẩn, phá hủy thành mạch, hủy hoại tế bào biểu mô ruột, gây sốt, tắc nghẽn mạch máu, rối loạn tuần hoàn và phản ứng shock là hậu quả tác ñộng của Lipopolysaccharide do vi khuẩn sản sinh

ðộc tố tế bào (Cytotoxin):

Thành phần của Cytotoxin không phải là Lipopolysaccharide (Non – Lipopolysaccharide) ðặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp protein của tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO ða phần ñộc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt ñộ.Và ñặc tính quan trọng của Cytotoxin làm tổn thương tế bào biểu mô

Trên ñây là 3 loại ñộc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella,

chúng là các tác nhân trực tiếp, quyết ñịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn

2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn

Mầm bệnh sau khi nhiễm vào ñường tiêu hoá, nhanh chóng ñi vào hệ lâm

ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ ñó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, làm cho

lá lách sưng to, lúc ñầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội ñộc tố, gây viêm hoại tử gan và hạch

Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu:

Thể nhiễm trùng huyết do S.choleraesuis chủng kunzendorf gây ra và thể viêm ruột do S typhimurium

2.3.1 Thể nhiễm trùng huyết do S.choleraesuis chủng kunzendorf

Bệnh phó thương hàn lợn thể nhiễm trùng máu xảy ra chủ yếu ở lợn sau

cai sữa do S choleraesuis chủng Kunzendorf gây nên (Laval, 2000) với các triệu

chứng lâm sàng ñiển hình như bỏ ăn, ủ rũ, thích nằm tập trung lại với nhau ở góc chuồng tối hay chui vào ổ rơm, thân nhiệt tăng cao 41 – 42oC Mí mắt sưng mọng có nốt tím bầm, viêm kết mạc Khi bị biến chứng, gây viêm phổi, ho khan,

có dịch ñờm Xuất huyết lấm tấm dưới da, tụ lại thành những vết ñỏ thẫm trên

da bụng và tai Sau 3 – 4 ngày bị mắc bệnh, lợn ỉa chảy có màu vàng Trong các

ổ dịch, tỷ lệ lợn bệnh chết ở mức cao, tỷ lệ những con ốm không cố ñịnh, thường dưới 10% trong tổng ñàn

Hiện tượng ỉa chảy xuất hiện sau 2 – 3 ngày, rồi kéo dài cho ñến khi lợn chết hoặc khỏi bệnh Phân bài xuất nhiều lần trong ngày, sau ñó phân chảy ra liên tục, phân có màu vàng, vàng xám, vàng nâu ở lợn con, còn ở lợn trưởng thành phân nhão, phân nước có lẫn máu Lợn gầy sút nhanh (Laval, 2000).Trên

da lợn trưởng thành mắc bệnh cũng xuất hiện các mảng da bị ñỏ, hoặc tím bầm

ở vùng bụng, tai, bẹn,… sau ñó xuất hiện chứng viêm phổi, lợn ho, thở dốc Những lợn như vậy thường bị chết do chứng viêm phổi thứ phát 15 ngày sau khi

bị bệnh Tỷ lệ lợn chết ở lợn bị bệnh thể á cấp tính khoảng 40 – 45% Lợn bị bệnh thường mang trùng và ñều ñặn thải mầm bệnh ra ngoài theo phân, nhưng khó phát hiện một cách chính xác (Laval, 2000)

Bệnh tích ñại thể:

Khi mổ khám lợn bệnh, những bệnh tích ñại thể quan sát ñược bao gồm: Các vết tím xanh ở rìa tai, trên bề mặt da bụng, bẹn, chân và ñuôi; nhồi huyết ở lớp niêm mạc dạ dày; lách sưng to nhưng nhẹ hơn gan, khi cắt ngang thấy tổ chức lách có màu tím Gan sưng to,tụ máu,trên bề mặt gan xuất hiện những nốt hoại tử nhỏ màu trắng, tế bào gan cứng lại Phổi bị cứng và xung huyết tràn lan

Bệnh tích vi thể:

Dấu hiệu biến ñổi bệnh tích vi thể là do Salmonella gây ra là ở hạch

lympho màng treo ruột: Sưng, xung huyết, xuất huyết và có ñiểm hoại tử màu xám, trên bề mặt gan thấy xuất hiện ñiểm hoại tử mô bào Những biến ñổi bệnh

tích vi thể ở lợn do Salmonella gây ra là không hề trùng lặp với bất cứ bệnh nào

khác ở lợn

Chẩn đốn:

Chẩn đốn bệnh phĩ thương hàn thể nhiễm trùng máu do S choleraesuis

chủng Kunzendorf gây nên khơng thể chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng đơn lẻ,

vì các triệu chứng lâm sàng của bệnh giống như nhiều triệu chứng nhiễm trùng khác

ở lợn như bệnh nhiễm trùng do Streptoccocus, bệnh đĩng dấu lợn

2.3.2 Thể viêm ruột do S typhimurium

Bệnh phĩ thương hàn thể viêm ruột thường do các serotyp S typhimurium

gây ra ở lợn con từ sau cai sữa đến khoảng 4 – 6 tháng tuổi Các thể bệnh hay gặp là cấp tính hoặc mãn tính (Laval, 2000)

Triệu chứng:

Triệu chứng lâm sàng xuất hiện từ từ, một trong những triệu chứng đầu tiên và quan trọng là ỉa chảy Thời kỳ nung bệnh thường từ 3 – 4 ngày Phân ban đầu nhão sau đĩ chuyển sang thể nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy Lợn ốm

bỏ ăn, thường uống nhiều nước ðợt sốt đầu tiên kéo dài chừng một tuần, tiếp theo một thời kỳ khơng sốt mấy ngày, rồi lại tiếp tục sốt Ở một số lợn ốm thấy

bị viêm khớp, chân bị què, đứng khơng vững, đi xiêu vẹo Ngồi triệu chứng tiêu chảy, lợn ốm cịn bị viêm phổi, lợn ho, thở gấp, nước mũi chảy nhiều Hầu hết lợn bệnh bình phục nếu được điều trị kịp thời, nhưng chủ yếu chuyển sang thể mãn tính kéo dài vài tháng Tỷ lệ lợn chết dao động từ 40% – 50% Số con cịn sống sĩt chậm lớn, cịi cọc Những lợn khỏi bệnh thường mang trùng và thải mầm bệnh ra ngồi mơi trường (Laval, 2000)

Bệnh tích đại thể:

Bệnh tích thường thấy ở ruột, nhất là ruột già Trong thể cấp tính, niêm mạc ruột thấm máu tràn lan, khi cắt ra trơng giống như mỡ và cĩ thể cĩ màng giống như sợi huyết phủ ở trên, lách sưng to và dai như cao su

Trong thể mạn tính, bệnh tích đặc biệt là thối loét ở niêm mạc ruột Những mụn loét to hay nhỏ, màu vàng xanh hoặc xám, chứa đầy một thứ bã

đậu, xung quanh cĩ bờ đỏ và nhẵn Van hồi manh tràng bị loét cúc áo, cĩ phủ một lớp màng (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002)

Bệnh tích vi thể:

Sự hoại tử nơng hay sâu trên bề mặt của lớp tế bào biểu mơ ruột là những bệnh lý vi thể đặc trưng của thể viêm ruột; cĩ trường hợp thấy nổi gồ lên khỏi niêm mạc xung huyết của ruột những hạt trịn như hạt đậu màu trắng vàng Phần đầu lơng nhung trong hồi tràng bị teo ngắn lại ða số trường hợp thấy mảng peyer bị loét dưới đáy như phủ một lớp tổ chức hoại tử màu vàng trắng, niêm mạc dạ dày cĩ điểm chảy máu rải rác, cĩ một số loét nhỏ tập trung ở bờ cong nhỏ Gan xung huyết, trên bề mặt gan cĩ thể thấy những nốt u nhỏ (áp xe) mang tính đặc trưng cho thể bệnh khơng giống với điểm hoại tử trong thể nhiễm trùng huyết

Chẩn đốn:

+ Chẩn đốn lâm sàng: Ở thể viêm ruột của bệnh phĩ thương hàn, căn cứ vào các triệu chứng điển hình như viêm ruột và dạ dày ở lợn con từ sau cai sữa đến 4 tháng tuổi ðồng thời, dựa vào kết quả nuơi cấy, phân lập vi khuẩn trên mơi trường pepton và kiểm tra di động trên mơi trường thạch và xét nghiệm huyết thanh học

+ Chẩn đốn phân biệt với bệnh hồng lỵ, chứng viêm ruột do

Campylobacter (PHE), bệnh viêm ruột hoại tử, bệnh viêm dạ dày ruột

(Transmission Gasto Enteritis – TGE), bệnh tiêu chảy ở lợn do E coli Một số tác nhân gây tiêu chảy do vi rút như Rotavirus và Coronavirus gây viêm ruột, bệnh dịch tả lợn, các loại ký sinh trùng như cầu trùng Coccidia

- Ở bệnh phĩ thương hàn, thân nhiệt lợn ốm vẫn giữ cao (41 – 42oC) trong suốt thời gian lợn bị ỉa chảy, điều đĩ hồn tồn khác với bệnh hồng lỵ Hiện tượng tím tái nhiều khu vực trên da lợn bị bệnh phĩ thương hàn cũng khác với lợn bị bệnh hồng lỵ Ở lợn bị bệnh hồng lỵ, phân cĩ màu xám, xám – đen, đen, đen nâu, hiện tượng này khơng cĩ ở lợn bị bệnh phĩ thương hàn Lách ở lợn bị

bệnh hồng lỵ khơng bị sưng và khơng cĩ những biến đổi đặc trưng Màng niêm mạc ruột ở lợn bị bệnh hồng lỵ thường phủ một lớp biểu bì hoại tử, hiện tượng này khơng cĩ ở lợn bị bệnh phĩ thương hàn

2.4 Biện pháp phịng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn

2.4.1 Phịng bệnh

Phịng bệnh phĩ thương hàn cho lợn, nhất là ở những nơi chăn nuơi lợn tập trung quy mơ lớn và chăn nuơi lợn nái cĩ nhiều lợn con là một việc quan

trọng, vì đặc điểm dịch tễ của căn bệnh là vi khuẩn Samonella khơng dễ dàng

khống chế Cĩ 2 bước để phịng bệnh hiệu quả:

- Thực hiện an tồn sinh học trong chăn nuơi: là thực hiện các biện pháp kiểm sốt, hạn chế mầm bệnh xâm nhập vào trang trại như biện pháp quản lý vật nuơi cùng vào – cùng ra, làm hệ thống sát trùng thường xuyên khử trùng khu vực chăn nuơi; kiểm sốt chất lượng nguồn thức ăn và nước uống; tiêu diệt chuột, ruồi, gián; làm hệ thống biogas xử lý phân và nước thải

- Tiêm phịng vac-xin: Cĩ nhiều loại vac-xin để phịng bệnh do

Salmonella gây ra như vacxin nhược độc chủng TS-177, vacxin bổ trợ keo phèn

hay vacxin nhũ hĩa bổ trợ dầu Vacxin chống một số chủng phổ biến là

S.typhimurium, S.choleraesuis

2.4.2 ðiều trị bệnh

Hiệu quả chữa bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các biện pháp phịng bệnh tổng hợp như vệ sinh thú y, chăm sĩc, nuơi dưỡng, chẩn đốn bệnh kịp thời

- Sử dụng kháng huyết thanh: Kháng huyết thanh phĩ thương hàn được

chế bằng cách gây tối miễn dịch cho bị đực thiến bằng canh trùng vi khuẩn S

choleraesuis chứa độc tố được vơ hoạt bằng formol Tiêm bắp 30 – 60ml cho

lợn dưới 45 ngày tuổi; 50 – 80ml cho lợn 45 ngày tuổi trở lên Phương pháp này trong thực tế ít được sử dụng vì giá thành cao

- ðiều trị bằng kháng sinh: Cho đến nay, việc dùng kháng sinh chữa bệnh phĩ thương hàn cần chú ý loại trừ các loại kháng sinh đã bị vi khuẩn kháng

ñược nhiều tác giả thông báo như Streptomycin, Ampicillin Cũng phải loại trừ các kháng sinh vi khuẩn mẫn cảm nhưng ñã bị cấm sử dụng như Chloramphenicol, Furazolidon,… Hiện nay có nhiều loại kháng sinh mà các công ty, xí nghiệp thuốc thú y trong và ngoài nước sản xuất dùng cho ñiều trị bệnh phó thương hàn như Ampisure, Nor-100, Zinabrime Làm kháng sinh ñồ cho từng trại ñể ñánh giá và chọn loại kháng sinh ñiều trị có hiệu quả nhất ñược khuyến cáo Ngoài ra cần chú ý kết hợp với bổ sung muối và ñiện giải, chống mất nước cho lợn ốm

Phần III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng

- Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược

3.1.2 ðịa ñiểm

- ðịa ñiểm lấy mẫu: Các trang trại chăn nuôi lợn ở một số tỉnh Miền Bắc

- ðịa ñiểm tiến hành các xét nghiệm và thí nghiệm:

+ Phòng thí nghiệm công ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam

+ Phòng thí nghiệm bộ môn Vi trùng – Viện Thú y.Quốc Gia

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mẫu xét nghiệm (mẫu

phân, mẫu nước, mẫu cơ quan) từ lợn và các trang trại có lợn bị tiêu chảy ở 6 tỉnh miền Bắc

- Xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nguồn nước uống ở khu vực chăn nuôi

- ðịnh danh vi khuẩn phân lập ñược

- Xác ñịnh ñộc lực và các yếu tố gây bệnh của Salmonella phân lập ñược

- Thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị

3.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

3.3.1 Mẫu thí nghiệm

Mẫu thí nghiệm là phân và phủ tạng (hạch amidan, gan, lách, hạch màng

treo ruột và hồi tràng) của lợn ốm và chết bị tiêu chảy có các triệu chứng của

bệnh do vi khuẩn Salmonella

Mẫu nước uống của lợn ở các trang trại

3.3.2 Các loại môi trường thông thường và ñặc hiệu dùng ñể nuôi cấy, phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella

Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường chế sẵn ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức của các hãng Eiken, Oxoid, Biorad, Merk

- Môi trường nước thịt: dùng ñể kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn

- Môi trường BPW, RV: dùng ñể tăng sinh vi khuẩn Salmonella

- Môi trường thạch thường: dùng ñể kiểm tra hình thái, màu sắc khuẩn lạc

của vi khuẩn Salmonella

- Môi trường thạch máu (Blood Agar Base): dùng ñể giữ giống và kiểm

tra khả năng dung huyết của vi khuẩn Salmonella

- Môi trường thạch DHL: là môi trường ñặc biệt dùng ñể nuôi cấy, phân

lập vi khuẩn Salmonella

- Môi trường TSI: dùng ñể giám ñịnh khả năng sinh H2S và lên men ñường glucose

- Môi trường LIM: dùng ñể giám ñịnh khả năng sinh Indol và khả năng di

ñộng của vi khuẩn Salmonella

- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng ñể ñịnh typ và giữ giống vi khuẩn

3.3.3 Các loại hóa chất

- Các loại ñường: Glucoza, Mantol, Lactoza, Sorbitol, Dextroze, Sucroze, Galactoze, Manitol, Arabinoze ñể thử phản ứng lên men ñường

- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader

- Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)

3.3.4 Các loại kháng huyết thanh chuẩn ñể ñịnh typ vi khuẩn Salmonella

Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật

Bản sản xuất) dùng ñể ñịnh typ kháng nguyên O và H của vi khuẩn Salmonella

3.3.5 Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR

- Gồm Primer, Taq-DNA polymerase, dNTPs, ñệm phản ứng, ñệm ñiện di

TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm ñiện di (Gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide)

- Các chủng vi khuẩn dùng làm ñối chứng dương gồm: S choleraesuis, S

typhimurium, S enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp

3.3.6 Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm

ðĩa petri, lam kính, ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, ống hút, que cấy, ñèn cồn, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, lò vi sóng, kính hiển vi……

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu

- ðối với mẫu phân: mẫu phân từ lợn bị tiêu chảy ñược lấy bằng cách dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng của những con có triệu chứng tiêu chảy Thường phân có màu vàng, lẫn chất nhầy, có mùi thối ñặc biệt Mẫu ñược cho vào các ống vô trùng, bảo quản lạnh 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm

- ðối với những lợn sau cai sữa bị tiêu chảy nặng hoặc chết có các triệu chứng ỉa chảy phân có mùi thối ñặc biệt, vùng da bụng, quanh tai và bẹn có những

ñốm ñỏ hoặc tím bầm, tiến hành mổ khám tại chỗ rồi lấy bệnh phẩm từ gồm gan,

lách, hạch ruột, chất chứa ruột non Các mẫu ñược ñựng trong túi nilon vô trùng chuyên dùng (ñể riêng rẽ) Máu tim ñược hút vào xi – lanh, bảo quản ở 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm Tổng số lợn mổ lấy mẫu là 24 con

- ðối với mẫu nước: chúng tôi tiến hành lấy 200ml nước từ nguồn nước uống dùng trong chăn nuôi của trại (nước giếng khoan, nước giếng ñào, nước ao chứa) Nước ñược ñựng trong các chai thủy tinh vô trùng, bảo quản lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm

3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella

ðược tiến hành dựa trên cơ sở quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn của Khoa Thú y ứng dụng và sức khỏe cộng ñồng, trường ðại học Nông nghiệp

và thú y Obihiro, Nhật Bản, với một số cải tiến ñể phù hợp với ñiều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam Quy trình ñược tóm tắt ở sơ ñồ sau

Sơ ñồ 2.1 Quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella

từ các mẫu phân và phủ tạng

Bệnh phẩm (Phân, máu tim, gan, lách, hạch ruột, dịch ruột)

BPW (370C/ 18- 24 h)

LIM

C/ 18- 24 h)

TSI (370C/ 18- 24 h)

Kiểm tra

hình thái

Giữ giống vi khuẩn

RV (420C/ 18- 24 h)

mẫn cảm kháng sinh

Xác ñịnh các yếu tố ñộc lực

3.4.3 Phương pháp giám ñịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược

3.4.3.1 Kiểm tra hình thái học

Dùng phương pháp nhuộm Gram

- Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím

- Vi khuẩn Gram âm bắt màu ñỏ

3.4.3.2 Kiểm tra khả năng di ñộng

+ Kiểm tra di ñộng bằng phương pháp cấy vi khuẩn vào môi trường thạch bán cố thể

+ Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy ñầu nhọn vô trùng lấy vi khuẩn sau ñó cấy chích sâu vào giữa ống thạch bán cố thể, ñến gần ñáy ống thì rút ra,

ñể tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ

+ ðọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng di ñộng thì dọc theo ñường cấy

vi khuẩn sẽ mọc lan ra

3.4.3.3 Phản ứng chuyển hóa ñường

+ Thành phần:

Nước cất :1000 ml

Peptone :15 g

Andrade :10 ml

+ Cách pha: Trộn ñều hỗn hợp trên, khuấy cho tan hết rồi cho vào mỗi ống

nghiệm ñã có sẵn 1 ống duyn – ham 5ml Hấp vô trùng 121oC trong 15 phút, ñể nguội Pha các loại ñường: glucose, saccarosea, lactose, galactose, maltose, mannit, manitol, fructose, oxylose, aribinose với nồng ñộ cuối cùng là 10%, hấp ướt 110oC trong 30 phút hoặc 100oC trong 30 phút/ngày ( hấp 3 ngày liên tiếp)

+ Tiến hành: Dùng pipet vô trùng nhỏ vào mỗi ống 100µl ñường (mỗi ống

1 loại ñường) Kiểm tra vô trùng trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ Sau ñó, nhỏ 100µl canh trùng, ñể tủ ấm 370C/24 giờ

+ ðọc kết quả: Nếu vi khuẩn lên men sinh hơi thì phần môi trường trong

ống duyn – ham sẽ bị ñẩy ra ngoài

Nếu vi khuẩn lên men ñường, môi trường ñổi sang màu hồng ñậm

Nếu vi khuẩn không lên men ñường, môi trường không ñổi màu

3.4.3.5 Phản ứng sinh H2S

+ Nguyên lý: Một số vi khuẩn có khả năng phân giải axitamin có chứa lưu huỳnh và làm sản sinh H2S ðể xác ñịnh khả năng sinh H2S người ta cấy vi khuẩn vào trong môi trường có chứa Pb(CH3COO)2

3.4.3.7 Phản ứng Catalaza:

+ Phương pháp làm: Lấy 1 phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ mơi trường thạch đặt lên trên 1 phiến kính đĩ, nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% (Hydrogen peroxidaza)

+ ðọc kết quả: Nếu cĩ hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính Nếu khơng thấy cĩ hiện tượng sủi bọt là phản ứng âm tính

3.4.4 Phương pháp xác định serotyp của vi khuẩn Salmonella

Xác định serotyp của các chủng Salmonella phân lập được bằng các phản

ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Co., Ltd Tokyo, Nhật Bản) đối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lơng H Trên cơ sở kết quả thu được, tiến hành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White (Popoff, 2001)

3.4.4.1 Xác định nhĩm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đa giá nhĩm O

Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (Rapid Slide

Aglutination) để xác định nhĩm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella ðây

là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể được sử dụng rất phổ biến trong phịng thí nghiệm để chẩn đốn và giám định các loại vi khuẩn

+ Lấy một ít khuẩn lạc Salmonella cần định typ đã được cấy trên

thạch TSI hoặc thạch thường, hịa với mỗi giọt nước muối sinh lý đã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên