CƠ CHẾ XÚC TÁC VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE

2.2. Cơ chế Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng cơ chế chung như sau: E + S → ES → ES’ + P1 → E + P2

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ

KHOA SINH HỌC

CƠ CHẾ XÚC TÁC VÀ ỨNG DỤNG

CỦA ENZYME PROTEASE

MSV:16S3011004 Lớp : Sinh 2

Huế, 10/2017

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong thế kỷ XXI đã chứng kiến sự phát triển chưa từng có của sinh học phân

tử và công nghệ sinh học, đặc biệt là các ứng dụng của enzyme Việc nghiên cứu

về enzym có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với khoa học nói riêng và với toàn

xã hội nói chung Enzyme đã trở thành một công cụ thực nghiệm quan trọngkhông chỉ trong y học mà còn trong công nghiệp hóa học, chế biến thực phẩm vànông nghiệp Nó được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau như tổng hợp hóachất đa tính năng, các chất giặt tẩy và các chất làm sạch kính áp tròng…Một trongnhững lĩnh vực đáng quan tâm nhất của enzym học hiện đại là việc ứng dụng cácchất ức chế enzym để làm các loại thuốc cho con người và động vật Cùng với sựphát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme sảnxuất ra ngày càng nhiều Hằng năm lượng Enzyme sản xuất trên thế giới đạt

trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷUSD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong

ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%)

Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide trong phân tửprotein Nó được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưcông nghiệp chế biến thực phẩm chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát,làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lýphế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm ), y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc

da, công nghiệp sản xuất xà phòng , chất tẩy rửa và chiếm khoảng 60% thịtrường enzyme Chế phẩm enzyme này có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhaunhư thực vật, động vật và vi sinh vật Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, đa số cácchế phẩm enzyme này được thu nhận từ vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạkhuẩn do có nhiều ưu điểm vượt trội như chu kỳ phát triển 280 ngắn, môi trườngnuôi cấy rẻ, dễ điều khiển… Vì vậy, có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu

sống Quá trình thu nhận các chế phẩm protease phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhưtính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật, điều kiện thu nhận Vì vậy, tùy từng

trường hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp để thu nhận cácchế phẩm protease phù hợp với mục đích sử dụng Hiện nay, trên thế giới, các chếphẩm protease đã được thương mại hóa và được đưa vào ứng dụng một cách rộngrãi Tuy vậy, trong thời gian gần đây, trên thế giới, nhiều nhà khoa học vẫn tiếptục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định các tính chất của chế phẩmthu Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về protease vi sinh vật, tuy nhiênchỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫncòn hạn chế.Enzyme Protease có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống củacon người,động vật Để giúp mọi người hiểu rõ về cấu trúc,cơ chế xúc tác cũngnhư ứng dụng của Enzyme Protease,em chọn đề tài “CƠ CHẾ XÚC TÁC VÀỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE” làm tiểu luận.

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Tìm hiểu cơ chế phản ứng và ứng dụng của enzyme protease trong các lĩnh vựctrong đời sống Từ đó, giúp moi người hiểu rõ hơn về enzyme protease để ứngdụng trong đời sống

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu của đề tài là Enzyme Protease

-Phương pháp nghiên cứu trong bài tiểu luận đươc dùng chủ yếu là phương pháp nghiên cứu lý thuyết, tổng hợp nhằm làm rõ vấn đề được nghiên cứu và giúp người đọc có cai nhìn tổng quát hơn về loại enzyme này

PHẦN II:NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE

1.1.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME HIỆN NAY

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai tròxúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, các nghiên cứu vềenzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thựcnghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiêncứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạchkhác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quangiữa cấu trúc và hoạt tính sinhhọc của enzyme, khả năng ứng dụng enzym trong thực tế Nghiên cứu vềcông nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạngcủa lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sảnxuất amylase Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid

từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lênmen rượu bằng enzyme cố định trên cột Cũng đã có những nghiên cứu sửdụng peroxydase, cyt-P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chấtđộc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một

số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một sốbệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ

em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà Đây là một đóng góp rất thiết thực

và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta

1.1.2 Tình hình nghiên cứu về enzyme protease hiện nay

Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi

công nghệ gen và bảo vệ môi trường, protease đã có những đóng góp rất tolớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người Hiện nay trênthế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang pháttriển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzymeprotease Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu

còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lạiđây.Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao (giá trị buôn bán187.2 triệu USD) do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trongsản xuất Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzymechưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% Vìvậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằmthu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết Trong những năm gần

đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạtkhoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), vàprotease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp(60%)

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE

1.2.1 Đặc điểm

- Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷphân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptitđến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng cókhả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

1.2.2 Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36 x 48 x 36AO vàmạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạtđộng nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằmbên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn chiếm20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.Hoạt tính của papain dựa trên

hai tâm hoạt động là Cys25 và His159 Khoảng pH hoạt động của papainkhá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất Khi cơ chất là casein thì hoạttính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là

50 – 57 độ C

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của protea

1.2.3 Cấu trúc tâm hoạt động của Protease (Papain)

- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogenbậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũngliên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen

- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các aminoacid là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của Protease (Papain)

+ Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗipolypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4nhóm:

+ Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trongtrung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúctác của enzyme Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như

chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme

vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN Các serine proteinasethường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chấttương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng.Các cysteinproteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chấtrộng

+ Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trongtrung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy

ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metalloproteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnhdưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:+ Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng itthấy ở vi khuẩn

+ Protease trung tính: pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quảdứa

- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộcnhóm Protease tên là renin Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có

đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính reninnhư ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.

1.2.3.2 Nguồn thực vật:

Có 3 loại protease thực vật như: Bromelain, Papain và Ficin Papain thuđược từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từquả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant)

Hình 1.4 Nguồn thu enzyme protease từ thực vật

1.2.3.3 Nguồn vi sinh vật:

Enzyme Protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ

khuẩn gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium,

Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men.

* Vi khuẩn

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B.mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống

thuộc chi Clostridium Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt

động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH

5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Chúng được sinh ra nhiều bởi B subtilis,

B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử

từ 20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng

pH rộng 7-12

Hình 1.5 Bacillus

* Nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae,

A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum) Các loại

nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trungtính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủyphân protein ở pH 2,5-3

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti

cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trongsản xuất pho mat

Hình 1.6 Nấm mốc

* Xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vikhuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có

khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S.

1948, nhà lý hóa học Linus Pauling đã đề xuất rằng, enzyme làm tăng tốc độđược là nhờ sự ổn định của trạng thái chuyển tiếp của phản ứng hóa học khi

tương tác với vị trí enzyme hoạt động Năm 1965, Monod, Wyman vàChangeux đã phát triển học thuyết về sự chuyển hoạt tính enzyme để giảithích các quan sát trước đó.

2.2 Cơ chế

Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhaunhưng chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theocùng cơ chế chung như sau:

Trong đó:

E: Enzyme ; S: Cơ chất ; ES: Phức chất enzyme – cơ chất

ES’: Phức chất trung gian enzyme – cơ chất acyl hóa (Acyl enzyme)

Hình 2.2 Mô hình “chìa khóa và ổ khóa” của Pisher giải thích cơ chế tác

dụng của cơ chất và enzyme

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của chymotrypsin

2.2.1 Giai đoạn 1: Acyl hóa

Cơ chất kết hợp với enzyme tạo phức trung gian ES Sau khi tạo thànhphức hợp ES, cacbon trong nhóm cacbonyl của liên kết peptide dễ bị phâncắt (ví dụ: trên vị trí P1) bởi serin ở trung tâm hoạt động, qua đó tạo thànhmột chất trung gian tứ diện (tetrahedral) với một trung tâm oxyanion trêncacbon cacbonyl làm nhớ lại trạng thái chuyển tiếp của phản ứng Trạngthái chuyển tiếp này được làm bền bởi các tương tác liên kết hydro đặc hiệugiữa các gốc trong túi trung tâm hoạt động và trung tâm oxyanion của cơchất

+ Trong subtilizin, liên kết hydro này được tạo thành từ nitơ của serin 195

trong bộ khung (ai nhân trung tâm hoạt động) và của serin 155 chuỗi bên

+ Trong chymotrypsin, các liên kết hydro này được tạo thành từ nitơ của

gốc serin ái nhân và một glyxin ở trung tâm hoạt động

Trong sơ đồ hình 2.3:

- Các gốc Ser-195 và His-57 trực tiếp tham gia trong phản ứng cắt đứt liên

nguyên tử C của nhóm -CO- trong liên kết peptide, do đó liên kết đôi giữa

C và O của -CO- trở thành liên kết đơn, O2 tích điện âm (gọi là oxyanion).Các nguyên tử liên kết với C của -CO- săp xếp như một khối bốn mặt, do

đó được gọi là phức trung gian tứ diện tức thời (trạng thái chuyển tiếp), sau

tức thời còn có sự tham gia của hai nhóm -NH- của mạch chính enzyme

2.2.2 Giai đoạn 2: Deacyl hóa

của giai đoạn acyl hóa Enzyme bị khử acyl do sự tác dụng ái nhân củaphân tử nước đi vào trung tâm hoạt động của enzyme từ một khoang dođích đến của sản phẩm peptide đầu tiên Phản ứng khử acyl xảy ra cùng với

sự tạo thành trong quá trình acyl hóa và gắn liền với sự làm bền liên kết Hvới enzyme.Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từserine cho nhóm amin để tái sinh lại enzyme

Trong sơ đồ hình 2.3:

-Sản phẩm amine đang liên kết với His-57 bằng liên kết hydrogen sẽkhuyếch tán ra ngoài Thế vào đó là H2O His-57 lấy H+ của H2O Ion OH-

được tạo thành tấn công C của -CO- đang gắn với Ser-195 để tạo thành

Ser-195, đồng thời giải phóng P2 (phần acid của cơ chất) P2 khuếch tán rangoài

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính xúc tác của enzyme

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Tốc độ của phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ của enzyme

có trong dung dịch khi nồng độ cơ chất là xác định Mối liên hệ giữa vận tốcphản ứng và nồng độ enzyme được thể hiện thông qua biểu thức:

V= k[E]

[E]: Nồng độ enzyme

Hình 2.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng

- Do tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme (khi cơ chất đầy đủ)nên nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càngnhiều bấy nhiêu Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng sẽ

- Trong điều kiện thừa cơ chất tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc

- Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạthóa thì tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với[E] đó

2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES

Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S

v1 = k1[E][S]

v-1 = k-1[ES]

v2 = k2[ES]

Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:

k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S]

(k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2)

Gọi E0 là nồng độ ban đầu:

[E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] (3)

Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:

(k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S]

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten

của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng doenzyme xúc tác càng lớn

Hình 2.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính

protease

Nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme xảy ra theo ba

enzyme-cơ chất (ES) Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độphản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

đầu sẽ bị tách ra, tốc độ phản ứng đạt cực đại và nó hoàn toàn không phụ

này là đúng khi phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất

2.3.3 Ảnhhưởng của nhiệt độ

Bản chất của enzyme là protein Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng đến cấu trúccủa chúng Tốc độ ảnh hưởng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt

độ nào đó mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc Đa số enzyme bị mất hoạttính ở nhiệt độ >700oC, vì thế nên khi vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản