các thí nghiệm kỹ thuật lên men

Mục đích Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường trong quá trình sinh tổng hợp protease từ nấm mốc theo phương pháp lên men trên môi trường rắn 2.. Cấy giống và nuôi mốc - Nấm mốc: Asp

BÀI THÍ NGHIỆM 1 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PECTINASE TỪ NẤM MỐC

1 Mục đích

Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu trong quá trình sản xuất pectinase từ nấm mốc theo phương pháp lên men chìm

2 Cơ sở lý thuyết

- Pectin: Nguồn gốc, cấu tạo và tính chất, ứng dụng

- Cơ chế xúc tác của pectinase

- Quá trình sản xuất pectinase từ vVi sinh vật sinh tổng hợp pectinase

- Quy luật của quá trình sinh tổng hợp enzyme

+ Sự cảm ứng bởi cơ chất

+ Sự ức chế enzyme

+ Sự ức chế dị hoá

- Quá Quy trình sản xuất pectinase theo phương pháp lên men chìm

+ Thành phầnChuẩn bị môi trường

+ Điều kiệnPhương pháp lên men

3 Nội dung thí nghiệm

3.1 Chuẩn bị môi trường

Mỗi học viên chuẩn bị 150mL môi trường trong erlen 250mL, thành phần như sau (g/L): + Bột vỏ bưởi (đã sấy khô) 8 (tương đương 1g pectin/L)

Các học viên hiệu chỉnh giá trị pH cuả môi trường tương ứng là 3.5, 4.0, 4.5, 5.0

Tiệt trùng môi trường: 121oC, 15 phút

3.2 Cấy giống

- Nấm mốc: Aspergillus awamori

- Dùng pipette cho 10mL nước cất vào ống giống có chứa các bào tử

- Hút 2mL huyền phù có chứa bào tử cho vào erlen môi trường.

3.3 Nuôi cấy

Các học viên đặt các erlen vao vào tủ lắc điều nhiệt với các thông số như sau:

- Nhiệt độ: 30oC

- Tốc độ lắc: 125rpm

- Thời gian: 72h

3.4 Thu hồi enzym

Sơ đồ thu hồi enzym:

Canh trường → Lọc tách sinh khối → Ly tâm (40C, 6000rpm, 10min) tách huyền phù → Dung dịch enzyme thô.

Xác định hoạt tính enzym

4 Báo cáo kết quả

HOẠT TÍNH PECTINASE 1.1 Định nghĩa

1 đơn vị hoạt độ của enzyme endopolygalacturonase được định nghĩa là lượng enzyme thuỷ phân dung dịch pectin 1%(w/w) ở điều kiện 45oC trong 30 phút để độ nhớt của dung dịch pectin giảm đi 50% so với độ nhớt ban đầu.

1 unit of endopolygalacturonase is equivalent to a determined quantity of enzyme that hydrolyzes 1% pectin solution at 45oC for 30min and the viscosity of this pectin solution decreases 50% of initial viscosity

1.2 Hóa chất

- Pectin: dung dịch 1%(w/w) pectin

- Dung dịch đệm acetate 0.1M acetate, pH 4.5

1.3 Dụng cụ

- Nhớt kế Osvald

- Bể điều nhiệt

1.4 Thực hiện

- Hút 7.5mL dung dịch pectin 1%(w/w) cho vào ống nghiệm

- Cho tiếp 2.5mL enzyme thô vào ống nghiệm

- Đặt ống nghiệm trong bể điều nhiệt: 45oC, 30 phút

- Vô hoạt enzym bằng cách đun sôi ở 100oC trong 5 phút.

- Làm nguội đến 25oC

- Mẫu trắng: thực hiện tương tự nhưng thay 2.5mL enzyme thô bằng 2.5mL nước cất

- Xác định độ nhớt bằng nhớt kế Osvald: xác định thời gian mẫu chảy qua hết thể tích của nhớt kế

Độ nhớt tương đối của enzyme: Ve = Te/Tw

+ Te: thời gian chảy của mẫu enzyme

+ Tw: thời gian chảy của nước cất

Độ nhớt tương đối của mẫu đối chứng: Vc = Tc/Tw

+ Tc: thời gian chảy của mẫu đối chứng

- Tính toán kết quả:

+ Độ giảm độ nhớt: V = (Vc-Ve)*100%

+ Hoạt độ enzyme pectinase: E = (V/d)*(100/n) = V/1.25; U/mL

d=50 (độ nhớt của dung dịch pectin giảm 50% so với độ nhớt của dung dịch ban đầu) n=2.5mL (Thể tích của dung dịch enzyme thô)

BÀI THÍ NGHIỆM 2

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ NẤM MỐC

1 Mục đích

Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường trong quá trình sinh tổng hợp protease từ nấm

mốc theo phương pháp lên men trên môi trường rắn

2 Cơ sở lý thuyết

- Protease: Nguồn gốc, cấu tạo, phân loại, tính chất, ứng dụng

- Cơ chế xúc tác của protease

- Vi sinh vật sinh tổng hợp protease

- Quy luật của quá trình sinh tổng hợp enzyme

+ Sự cảm ứng bởi cơ chất

+ Sự ức chế enzyme

+ Sự ức chế dị hoá

- Quy trình sản xuất protease theo phương pháp lên men bề sâu

+ Chuẩn bị môi trường

+ Phương pháp lên men

3 Nội dung thí nghiệm

3.1 Chuẩn bị môi trường

Mỗi học viên chuẩn bị ? gam môi trường có thành phần như sau (%w/w tính theo chất khô):

+ Cám 82.98 (làm tròn số)

+ Đậu nành xay 4.25

+ Trấu: 12.76

Các học viên hiệu chỉnh độ ẩm môi trường bằng nước cất tương ứng là 40%, 45%, 50%, 55%.

Tiệt trùng môi trường: 121 C, 20 phút o

3.2 Cấy giống và nuôi mốc

- Nấm mốc: Aspergillus oryzae

- Dùng pipette cho 5mL nước cất vào ống giống có chứa các bào tử, dùng que cấy đánh nhẹ cho bào tử phân bố đều trong nước

- Hút 1mL huyền phù có chứa bào tử cho vào môi trường đã được trải đều trên nia tre (khối lượng môi trường tương ứng khoảng 56g).

- Đậy vải lại.

- Nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 39h (Lưu ý giữ ẩm cho môi trường bằng cách ???)

3.3 Thu hồi enzym

Sơ đồ thu hồi enzym:

Canh trường → Trộn đều → Cân → Nghiền sơ bộ → Trích ly (dung dịch đệm pH 6.5, tỷ lệ canh trường/dung môi 1g/8mL, thời gian trích ly, tốc độ khuấy đảo…) → Ly tâm (4 C,0 5 000rpm, 15min) tách huyền phù → Định mức → Dung dịch enzyme thô.

Xác định hoạt tính enzym

4 Báo cáo kết quả

HOẠT TÍNH PROTEASE 1.1 Định nghĩa

1 đơn vị hoạt độ của enzyme protease được định nghĩa là lượng enzyme thuỷ phân được

một lượng cơ chất tạo ra sản phẩm tương đương với 1umol tyrosin ở điều kiện 30o C trong 1 phút

1.2 Hóa chất

- Dung dịch tyrorin chuẩn (1umol/mL) trong dung dịch HCl 0.2N

- Dung dịch caseine 2%: cân chính xác 2g caseine, hòa tan trong 30mL dung dịch NaOH 0.1N, đun nhẹ và khuấy đều cho đến khi caseine tan hết Dùng dung dịch KH2PO4 1/15M để chỉnh pH về 6 – 7, sau đó định mức thành 100mL bằng dung dịch đệm phosphate 1/15M

- Dung dịch A (NaH2PO4 1/15M)

- Dung dịch B (KH2PO4 1/15M)

- Dung dịch đệm phosphate (pH = 7.4): trộn A và B theo tỷ lệ 4:1

- Dung dịch TCA: 10%

- Dung dịch Na2CO3 6%

- Thuốc thử Folin - Ciocalteau

1.3 Dụng cụ

- May quang phổ

- Bể điều nhiệt

1.4 Thực hiện

Quá trình thuỷ phân

- Cho vào ống nghiệm 2mL dung dịch caseine 2%

- Bổ sung vào 1mL dung dịch enzyme thô

- Lắc đều, để thủy phân ở 30 C trong 10 phúto

- Bổ sung 5mL dung dịch TCA 10% để tuả proteine (30o C, 10 phút)

- Lọc (sử dụng giấy lọc ??)

- Lấy 1mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, sau đó bổ sung 1mL thuốc thử Folin - Ciocalteau

và 4mL dung dịch Na2CO3 6%

- Lắc đều, chờ phản ứng tạo màu trong 10 phút ở 30o C.

- Đo độ hấp thu ở bước sóng 750nm

Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng thay 1mL dung dịch enzyme thô bằng 1mL nước cất

Dựng đường chuẩn:

- Dùng dung dịch tyrosin chuẩn pha loãng để lập đường chuẩn (pha loãng bằng dung dịch HCl 0.2N)

Lấy 1mL dung dịch tyrosincho vào ống nghiệm, sau đó bổ sung 1mL thuốc thử Folin -Ciocalteau và 4mL dung dịch Na2CO3 6%

- Lắc đều, chờ phản ứng tạo màu trong 10 phút ở 30o C.

- Đo độ hấp thu ở bước sóng 750nm

Tính toán kết quả:

- Hoạt độ protease trong 1mL dung dịch enzym

H = 8T/τ

T: nồng độ tyrosin trong dung dịch đem đo

τ: thời gian phản ứng (10 phút)

8: số mL toàn bộ hỗn hợp phản ứng (1mL dung dịch enzyme, 2mL dung dịch caseine, 5mL dung dịch TCA).

BÀI THÍ NGHIỆM 3

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE

1 Mục đích

So sánh hiệu quả cố định nấm men trên chất mang Bacterial Cellulose (BC) theo 2 phương pháp: hấp phụ và hấp phụ - ủ.

2 Cơ sở lý thuyết (Học viên tự chuẩn bị)

- Kỹ thuật cố định tế bào

- Chất mang BC

- Cố định tế bào trên chất mang BC: các phương pháp cố định, yếu tố ảnh hưởng

- Ứng dụng của nấm men cố định trên chất mang BC

- Các phương pháp định lượng: hàm lượng ni tơ ammonium, hàm lượng đường khử, mật độ nấm men trên/ trong chất mang

3 Nội dung thí nghiệm

3.1 Chuẩn bị môi trường (phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn)

− Dịch nho được chuẩn bị để làm môi trường nhân giống nấm men (150mL), môi trường cố định nấm men (400mL/học viên - bài TN3) và môi trường lên men chính rượu vang nho (200mL/học viên - bài TN4)

Hình 1 Quy trình thu nhận dịch nho

Bentonite 0,2%

Pectinase 0,1%

Nho

Xử lý enzyme

45 – 50oC, 120ph

Tách cuống Rửa Chà

Gia nhiệt

70oC, 5ph Lọc sơ bộ

Gia nhiệt

70oC, 2ph Lọc chân không Dịch nho

− Kiểm tra pH, hàm lượng chất khô, hàm lượng đường khử, hàm lượng nitơ ammonium ban đầu của dịch nho thu được, dùng (NH4)2SO4 để hiệu chỉnh thông số nitơ ammonium thành

195 ppmN Dịch nho chưa sử dụng được bảo quản trong tủ đông (200mL/phần)

3.2 Chuẩn bị giống nấm men (phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn)

− Nấm men Saccharomyces cerevisiae

− Nhân giống 2 cấp trong môi trường dịch nho

Cấp 1: lấy từ 1 đến 2 vòng que cấy nấm men từ ống giống gốc để cấy vào 10mL môi

trường nước nho (đã hiệu chỉnh hàm lượng nitơ ammonium và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h ở nhiệt độ 30o C.

Cấp 2: cho toàn bộ canh trường nhân giống cấp 1 vào 100mL môi trường nước nho (đã

hiệu chỉnh hàm lượng nitơ ammonium, dùng đường glucose hiệu chỉnh hàm lượng chất khô đến 15o Bx và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h ở nhiệt độ 30o C.

− Ly tâm, thu sinh khối: Sau khi nhân giống, nấm men được đem ly tâm với tốc độ 4000v/phút,

ở nhiệt độ 4 C, thời gian 30 phút để tách sinh khối.0

3.3 Chuẩn bị BC (chuẩn bị nguyên nhóm)

− BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinium

− Quy trình chuẩn bị BC

∗ Sấy nhẹ ở 70 C trong 5’ để làm ráo chất mango

∗ Cắt BC thành những miếng vuông 1x1 cmxcm

∗ Hấp tiệt trùng các miếng BC ở 121 C trong 20 phúto

∗ Làm nguội đến nhiệt độ thường

∗ Lượng chất mang sử dụng là 40g/200mL dịch nho

3.4 Cố định nấm men trên BC (thực hiện riêng từng học viên)

− Thực hiện song song 2 mẫu dùng 2 phương pháp cố định: hấp phụ và hấp phụ - ủ

− Phương pháp hấp phụ (hình 2)

 Chỉnh pH dịch nho dùng để cố định nấm men về các giá trị 3,0 – 4,0 – 5,0 – 6,0 bằng acid lactic 5% và NaOH 5%

 Lượng dịch nho sử dụng cho một thí nghiệm là 200mL / erlen 500mL

 Dùng dịch nho đã chuẩn bị ở trên pha loãng sinh khối nấm men sau ly tâm để đạt dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 185.108 tb/mL

 Trộn chất mang BC vào huyền phù giống (40g/200mL)

 Lắc trong tủ lắc tốc độ 200v/ph

 Thời gian cố định 4h45’

 Vớt BC ra khỏi dịch huyền phù nấm men và rửa bằng nước vô khuẩn

 Xác định mật độ tế bào trên 1 đơn vị chất mang (phá mẫu trong máy xay với 200mL nước vô khuẩn, pha loãng, đếm trên buồng đếm Thomas)

− Phương pháp hấp phụ - ủ (hình 3)

 Tiến hành giống phương pháp hấp phụ, 200mL dịch nho / erlen 500mL

 Sau đó, chất mang BC đã cố định nấm men được cho vào trong các erlen vô trùng, ủ trong tủ ấm 30o C trong 2 ngày (48h)

 Xác định mật độ tế bào trên 1 đơn vị khối lượng chất mang BC

Hình 2 Quy trình cố định nấm men trên BC theo phương pháp hấp phụ

Hình 3 Quy trình cố định nấm men trên BC bằng phương pháp hấp phụ - ủ

4 Báo cáo kết quả

− Mật độ tế bào nấm men cố định trên chất mang BC trong 2 trường hợp

Tính hiệu suất cố định

0

n

n

H = (%)

Cho rằng trong thời gian cố định, nấm men trong dịch huyền phù nấm men không tăng sinh khối.

− So sánh, nhận xét, giải thích

PHỤ LỤC: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1 pH: Sử dụng máy đo pH

2 Nồng độ chất khô: Sử dụng khúc xạ kế để bàn, đơn vị đo là o Bx.

3 Nồng độ đường khử (phương pháp của AOAC)

3.1 Hóa chất

Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid

− Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1,6g NaOH trong khoảng 60-70mL nước cất Sau đó cho 30g KNa tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan hoàn toàn.

− Chuyển dung dịch trên vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch.

− Dung dịch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6-8o C), dùng tốt nhất trong 15 ngày.

Dung dịch đường chuẩn

− Dung dịch đường chuẩn là dung dịch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1 (w:w),

có nồng độ là 2g/L.

3.2 Cách tiến hành

Xử lý mẫu

− Acid hữu cơ: trung hòa acid trong mẫu bằng dung dịch NaOH 0,1N.

− Tách tạp chất protein: cho dung dịch Ba(OH)2 0,3N và ZnSO4 5% với tỷ lệ 1:1 vào mẫu → protein sẽ biến tính và tạo tủa Mặt khác, Ba(OH)2 và ZnSO4 phản ứng với nhau cũng tạo kết tủa, cùng với tủa protein, hấp phụ các chất màu, các tạp chất khác và làm trong mẫu

Dựng đường chuẩn

− Pha loãng dung dịch đường chuẩn thành các mẫu có nồng độ khác nhau.

− Cho 1mL dung dịch chuẩn vào ống nghiệm Sau đó bổ sung 1mL dung dịch DNS Lắc đều

− Dùng một miếng nylon sạch bịt kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy ở nhiệt

độ 100 C trong thời gian 5 phút.o

− Làm nguội nhanh dung dịch, cho thêm 10mL nước cất và lắc đều cho đến khi dung dịch không còn phân lớp.

− Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 540nm.

− Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.

− Từ các kết quả đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A)

Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm

− Pha loãng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu ≤ 2g/L.

− Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu và 1mL dung dịch DNS, lắc đều Sau đó tiến hành tương tự như trên.

− Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ đường khử có trong mẫu nghiên cứu.

4 Hàm lượng nitơ vô cơ (phương pháp phân tích của AOAC)

4.1 Hoá chất

Dung dịch phenol: trộn 11mL phenol lỏng ( ≥ 89%) và định mức thành 100mL bằng ethanol 95% Dung dịch này chỉ dùng trong 1 tuần.

Sodium nitroprusside 0,5%w/v: hoà tan 0,5g sodium nitroprusside vào trong 100mL nước Dung dịch này dùng trong 1 tháng.

Alkaline citrate: hòa tan 200g trisodium citrate và 10g NaOH trong nước cất → định mức thành 1L.

Sodium hypochlorite 5%: đây là dung dịch có bán sẵn trên thị trường Dung dịch này dùng trong 2 tháng.

Dung dịch oxy hóa: trộn 100mL dung dịch alkaline citrate với 25mL sodium hypochlorite Dung dịch này chỉ dùng trong 1 ngày.

Dung dịch chuẩn N 1g/L: hòa tan 4,7143g (NH4)2HPO4 trong nước cất và định mức thành 1L

Dung dịch chuẩn N 10mg/L: hút 10mL dung dịch chuẩn N 1g/L và định mức thành 1L

Từ dung dịch chuẩn N 10mg/L pha loãng thành 5 dung dịch chuẩn: 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.

4.2 Cách tiến hành

Cho 25mL mẫu vào erlen 50mL, thêm vào đó: 1mL dung dịch phenol, 1mL dung dịch sodium nitroprusside, 2,5mL dung dịch oxy hóa.

Bao erlen bằng màng plastic, để ở nhiệt độ phòng (22 - 27o C) ở nơi có ánh sáng nhẹ trong vòng ít nhất là 1h Dung dịch bền màu trong vòng 24h.

Dựng đường chuẩn: tiến hành tương tự như trên với các dung dịch chuẩn 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.

Cũng tiến hành tương tự với mẫu nước cất để hiệu chỉnh máy về 0 Đo màu ở bước sóng 640nm.

BÀI THÍ NGHIỆM 4

LÊN MEN RƯỢU VANG BẰNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN BC

1 Mục đích

Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men trong quá trình lên men chính rượu vang nho bằng nấm men cố định

2 Cơ sở lý thuyết (Học viên tự chuẩn bị)

- Kỹ thuật lên men rượu vang

- Lên men rượu vang bằng nấm men cố định trên chất mang BC

- Các phương pháp định lượng: mật độ tế bào nấm men, đường khử, cồn

3 Nội dung thí nghiệm

3.1 Chuẩn bị môi trường

− Dịch nho đã được chuẩn bị ở bài TN3 được rã đông, hấp tiệt trùng, làm nguội

− Lượng dịch nho dùng để lên men là 200mL, lên men trong erlen 500mL

3.2 Chuẩn bị giống nấm men

− Naám men Saccharomyces cerevisiae đã cố định trên BC bằng phương pháp hấp phụ

− Mật độ nấm men ban đầu cấy vào dịch lên men là 5x10 tb/mL6

3.3 Lên men chính rượu vang nho

− Tiến hành lên men với các thông số

 Lượng dịch nho: 200mL

 Thay đổi hàm lượng đường khử ban đầu bằng glucose: 200 – 240 – 280 – 320g/L

 Hàm lượng N ammonium: 195 ppmN

 Mật độ nấm men ban đầu: 5x10 tb/mL6

 Nhiệt độ lên men: 25 Co

 Thời gian lên men: 120 h

− Lấy mẫu định kỳ mỗi 24h, xác định mật độ tế bào trong dịch lên men (trong BC và ngoài dịch lên men), pH dịch lên men

− Sau thời gian lên men, xác định hàm lượng đường sót, lượng cồn tạo thành.

4 Báo cáo kết quả

− Vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ tế bào và pH dịch lên men theo thời gian lên men

− Xác định tốc độ sử dụng đường trung bình:

τ

∆

= S

KS (g/L/h)

− Xác định độ lên men: So

S

∆

=

α

− Xác định tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình:

τ

∆

= P

KP (g/L/h)

− Xác định hiệu suất sinh tổng hợp cồn: η =

180 / S

46 / P

∆

∆ (mol ethanol/mol glucose) Trong đó, ∆ S = So – S : tổng lượng đường sử dụng g/L

So : hàm lượng đường ban đầu, g/L