báo cáo thí nghiệm kỹ thuật lên men

Khoảng một nữa các đơn vị rhamnosyl của RGImang các chuỗi bên như là arabinan, arabinogalactan và galactan Carpita, 199011 Hình 1.4 Loại bỏ liên kết [14]-glycoside bằng pectate và pect

MỤC LỤC

Danh mục các bảng 4

Danh mục các hình 6

BÀI THÍ NGHIỆM 1 9

1.1 Mục đích 9

1.2 Cơ sở lý thuyết 9

1.2.1 Pectin 9

1.2.2 Cơ chế xúc tác của pectinase 15

1.2.3 Vi sinh vật sinh tổng hợp pectinase 20

1.2.4 Ứng dụng của pectinase trong CNTP 26

1.2.5 Quy luật của quá trình sinh tổng hợp enzyme 29

1.2.6 Quy trình sản xuất pectinase theo phương pháp lên men chìm 36

1.3 Nội dung thí nghiệm 39

1.3.1 Chuẩn bị môi trường 39

1.3.2 Cấy giống 39

1.3.3 Nuôi cấy 40

1.3.4 Thu hồi enzyme 40

1.3.5 Xác định hoạt tính enzyme 40

1.4 Kết quả và bàn luận 41

1.5 Tài liệu tham khảo 43

BÀI THÍ NGHIỆM 2 47

2.1 Mục đích 47

2.2 Cơ sở lý thuyết 47

2.2.1 Protease 47

2.2.2 Cơ chế xúc tác của protease 69

2.2.3 Vi sinh vật tổng hợp protease 72

2.2.4 Quy luật của quá trình sinh tổng hợp enzyme 74

2.2.5 Quy trình sản xuất protease theo phương pháp lên men bề sâu 77

2.3 Nội dung thí nghiệm 80

2.3.1 Chuẩn bị môi trường 80

2.3.2 Cấy giống và nuôi mốc 80

2.3.3 Thu hồi enzyme 80

2.3.4 xác định hoạt tính enzyme 81

2.4 Kết quả và bàn luận 82

2.5 Tài liệu tham khảo 85

BÀI THÍ NGHIỆM 3 88

3.1 Mục đích 88

3.2 Cơ sở lý thuyết 88

3.2.1 Cấu trúc Cellulose vi khuẩn 88

3.2.2 Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn 91

3.2.3 Các phương pháp cố định vi sinh vật trên chất mang Cellulose vi khuẩn 92

3.2.4 Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trên chất mang cellulose vi khuẩn 93

3.2.5 Thuận lợi và khó khăn của tế bào cố định so với tế bào tự do 94

3.2.6 Ứng dụng vi sinh vật cố định trên cellulose trong sản xuất vang 96

3.3 Nội dung thí nghiệm 112

3.3.1 Chuẩn bị dịch nho 112

3.3.2 Chuẩn bị giống nấm men 112

3.3.3 Chuẩn bị BC 113

3.3.4 Cố định nấm men trên BC 113

3.4 Kết quả và bàn luận 115

3.5 Tài liệu tham khảo 118

BÀI THÍ NGHIỆM 4 121

4.1 Mục đích 121

4.2 Cơ sở lý thuyết 121

4.2.1 Mở đầu 121

4.2.2 Các phương pháp định lượng mật độ tế bào nấm men 126

4.2.3 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp acid dinitrosalicylic 130

4.2.4 Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp chưng cất 131

4.2.5 Tài liệu tham khảo 132

4.3 Nội dung thí nghiệm 133

4.3.1 Chuẩn bị môi trường 133

4.3.2 Chuẩn bị giống nấm men 133

4.3.3 Lên men chính rượu vang nho 133

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Điều kiện tạo gel của pectin 11

Bảng 1.2 Hoạt tính PG ngoại bào và mức giảm độ nhớt tương đối (RVU) do PG tiết ra từ những nấm men nhiệt đới khác nhau* 19

Bảng 1.3 Đặc tính hóa sinh của một số enzym pectinase của nấm men (Blanco, 1999) 20

Bảng 1.4 Sản xuất enzym pectinase từ vi sinh vật trên các nguồn cơ chất và phương pháp khác nhau 21

Bảng 1.5 Aûnh hưởng của glucose lên sự tạo thành PG và PL ngoại bào ở pH 5 và 8 trong môi trường 1% pectin 30

Bảng 1.6 Aûnh hưởng của nguồn carbon khác nhau lên sự hình thành PG bởi A.terreus 32

Bảng 1.7 Kết quả xác định hoạt tính enzyme pectinase thu đượctừ các mẫu có pH khác nhau 38

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của các chế phẩm enzyme công nghiệp (Kilara Arun & Desai Manik, 2002) 59

Bảng 2.2 Hàm lượng những chất phụ gia thường được bổ sung trong các chế phẩm enzyme .60

Bảng 2.3 Mức dao động tối đa các tạp chất có trong enzyme dùng trong thực phẩm ở châu Âu (AMFEP – The Association of Manufacturers of Fermentation Enzyme Products, 2001) .61

Bảng 2.4 Mức tối đa cho phép hàm lượng kim loại nặng và vi sinh vật có trong chế phẩm enzyme từ vi sinh vật 61

Bảng 2.5 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease 70

Bảng 2.6 Ký hiệu các mẫu thí nghiệm 79

Bảng 2.7 Kết quả đo độ hấp thu ở bước sóng 750nm của dung dịch tyrosin chuan 80

Bảng 2.8 Kết quả đo độ hấp thu của các mẫu thí nghiệm 80

Bảng 2.9 Nồng độ tyrosin của các mẫu thí nghiệm 80

Bảng 2.10 Hoạt độ protease trong 1ml dung dịch enzyme 81

Bảng 2.11 Hoạt độ protease trong 1g môi trường 81

Bảng 3.1 Thông số lên men ở 30, 25, 20, 10 và 5oC trong các mẻ lên men liên tiếp với tế bào AXAZ-1 cố định trên DCM 95

Bảng 3.2 Thông số lên men ở 30, 25, 20, 10 và 5oC trong các mẻ lên men liên tiếp với tế bào AXAZ-1 tự do 96

Bảng 3.3 So sánh vang tạo thành bởi tế bào tự do (FC) và tế bào cố định trên DCM (DC) ở các nhiệt độ khác nhau (20, 15 và 10oC) 97

Bảng 3.4 Aûnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng các hợp chất dễ bay hơi trong sản phẩm chưng cất khi sản xuất vang liên tục dùng tế bào cố định trên DCM ở các nhiệt độ khác nhau 101

Bảng 3.5 So sánh chi phí đầu tư và sản xuất (ngàn US $) của qui trình lên men liên tục ở 16oC với qui trình truyền thống dùng nấm men tự do để sản xuất hằng năm 800000L vang .101

Bảng 3.6 Hàm lượng acid hữu cơ chính trong vang trước và sau khi lên men malolactic 107

Bảng 3.7 Hàm lượng đường sót, glycerol và ethanol trong vang trước và sau khi lên men

malolactic 107

Bảng 3.8 Hàm lượng những phụ phẩm dễ bay hơi trước và sau lên men malolactic 107

Bảng 3.9 Số tế bào Acetobacter xylinum trong các mẫu cố định ở các pH khác nhau với 2

phương pháp hấp phụ và hập phụ-ủ 112

Bảng 3.10 Mật độ tế bào Acetobacter xylinum trong các mẫu cố định ở các pH khác nhau

với 2 phương pháp hấp phụ và hập phụ-ủ 112

Bảng 3.11 Hiệu suất cố định Acetobacter xylinum bằng 2 phương pháp hấp phụ và hấp phụ

- ủ 113

Bảng 4.1 Bảng tra độ cồn theo tỉ trọng tương đối 129

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Thành tế bào của hầu hết thực vật có hoa 10 Hình 1.2 Cấu tạo một đơn vị chuỗi pectin 11 Hình 1.3 Cấu trúc chính của pectic polysaccharide (A) Acid polygalacturonic bao

gồm các đơn vị [12]-D-galactopyranosyluronic, bị methylester hóa một phần ởC6 (B) Rhamnogalacturonan I (RGI) chứa các đơn vị disaccharide lặp lại của[12]-L-rhamnosyl-[14]-D-galactosyluronic acid (GaIA) Đơn vị GaIA có thể

bị acetyl hóa ở alcohol bậc hai Khoảng một nữa các đơn vị rhamnosyl của RGImang các chuỗi bên như là arabinan, arabinogalactan và galactan (Carpita, 1990)11

Hình 1.4 Loại bỏ liên kết [14]-glycoside bằng pectate và pectin lyase của phần

homogalacturonan trong phân tử pectin 17

Hình 1.5 Phản ứng deester hóa của pectin xúc tác bởi pectyl methyl- và

acetyl-esterase 18

Hình 1.6 Sơ đồ biểu diễn vùng RGI của pectin chứa các phần GaIA và Rha tuần tự

nghiêm ngặt và sơ đồ biểu diễn hoạt tính của những enzym phân cắtrhamnogalacturonan khác nhau (Mutter, 1997) 19

Hình 1.7 Aûnh hưởng của pH khác nhau ở 37oC (a) và nhiệt độ ở pH 5,5 (b) lên hoạttính của polygalacturonase của chủng S.cerevisiae UCLMS-39 (Ferna´ndez-Gonza

´lez, 2004) 23

Hình 1.8 Aûnh hưởng của nồng độ pectin lên sự sinh tổng hợp PG bởi Aspergillus

sp ATHUM-3482 Điều kiên sinh trưởng: môi trường có pH 3, nguồn nitơ 7g/L(NH4)2HPO4, 30oC 30

Hình 1.9 Sự thay đổi hoạt tính của PG theo thời gian trong quá trình nuôi cấy

A.oryzae trong môi trường chứa cám mì với nồng độ pectin khác nhau: 0g/L, 5g/L, 10g/L, () 20g/L, 30g/L 31

Hình 1.10 Aûnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu đến sự hình thành PG Môi

trường lên men chứa 5 g/L PGA như là chất cảm ứng Nồng độ glucose g/L: 0; 2; 5 Đường nét đứt biểu diễn tiêu thụ glucose trong quá trình lên men 36

Hình 1.11 Hoạt độ pectinase của các mẫu có pH 3.5 (mẫu 1), pH 4.0 (mẫu 2), pH

4.5 (mẫu 3) và pH 5.0 (mẫu 4) 42

Hình 2.1 Quy trình thu nhận protease từ sinh vật, Tanksale Aparna M., 2001 48

Hình 2.2 Cơ chế xúc tác của protease kim loại lên cơ chất protein, Rao Mala B et al, 1998 71

Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của aspartic protease (A) và serine protease (B) Im và +Him lần lượt là imidazole và imidazole đã proton hóa, Rao Mala B et al, 1998 72

Hình 2.4 Aspergillus oryzae 74

Hình 2.5 Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian khi tỷ lệ trấu:bột gạo=7:3, độ ẩm 50%, nhiệt độ ủ 270C ở những mật độ bào tử khác nhau: +: 10 4 bào tử/g cơ chất, 0: 105 bào tử/g cơ chất, : 106 bào tử/g cơ chất 78

Hình 2.6 Hoạt tính protease thay đổi theo thời gian khi mật độ bào tử là 106 bào tử/ g cơ chất, độ ẩm 50% ở những tỷ lệ trấu: bột gạo khác nhau: +: 6:4, 0: 7:3, : 8:2, : 9:1 79

Hình 2.7 Aûnh hưởng của độ ẩm lên hoạt tính protease khi tỷ lệ trấu:bột gạo=7:3, mật độ 106 bào tử/g cơ chất 79

Hình 2.8 Đường chuẩn tyrosin 83

Hình 2.9 Aûnh hưởng của độ ẩm của môi trường đến hoạt độ của protease thu được .84

Hình 3.1 Cấu trúc BC 89

Hình 3.2 Cellulose vi khuẩn (2m) 89

Hình 3.3 Cellulose thực vật (Hổ, 2006) 90

Hình 3.4 Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt 90

Hình 3.5 Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề sâu 91

Hình 3.6 Cấu trúc của cellulose cơ bản, DEAEC và TMAHPC 97

Hình 3.7 Thời gian cố đính tế bào Ký hiệu trắng và đen tượng trưng cho tế vào cố định và tế bào tự do Ký hiệu: o, BC; , DEAEC, ºª, TMAHPC 97

Hình 3.8 Hàm lượng glycerol tạo thành bởi tế bào cố định trên DCM và tế bào tự

do 99

Hình 3.9 Mô hình mới dùng bình lên men MFBT dạng liên tục và gián đoạn với dung tích 11000L cho lên men cồn bằng nấm men cố định trên DCM ở nhiệt độ thường và nhiệt độ thấp 1: bình phản ứng MFBT, 2: thu hồi DCM, 3: đơn vị làm lạnh, 4: bể, 5: bơm nhu động, 6: bơm cung cấp nước, 7-9: bơm, 10: ống tuần hoàn, 11: bơm khí, 12: lọc tiệt trùng, 13: của mở để đưa DCM vào bình phản ứng 103

Hình 3.10 Chuyển hóa acid malic trong vang (pH 3,5) bởi Oenococcus oeni M42 tự do hoặc cố định trên DE, đã được sinh trưởng trong MP Tế bào tự do, °; tế bào cố định trên DE, ª 107

Hình 3.11 Qui trình thu nhận dịch nho 112

Hình 3.12 Cố định tế bào trên BC theo phương pháp hấp phụ 114

Hình 3.13 Cố định tế bào trên BC theo phương pháp hấp phụ – ủ 115

Hình 3.14 Mật độ tế bào Acetobacter xylinum trong các mẫu cố định ở các pH khác nhau với 2 phương pháp hấp phụ và hập phụ-ủ 116

Hình 3.15 Hiệu suất cố định Acetobacter xylinum bằng 2 phương pháp hấp phụ và hấp phụ - ủ 117

BÀI THÍ NGHIỆM 1 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PECTINASE TỪ

Quá trình chín sẽ kèm theo sự thuỷ phân protopectin thành pectin, sau đó kếthợp với sự demethyl hoá dưới tác dụng của enzym và sự depolymer hoá của pectintạo thành pectate và cuối cùng là các loại đường hoà tan và axit

Từ xa xưa, pectin đã là thành phần trong khẩu phần ăn của con người Nhưngmới chỉ trong nửa thế kỉ trước ngành công nghiệp thực phẩm mới nhận biết đượcvai trò quan trọng của phụ gia pectin trong việc đa dạng hoá các sản phẩm thựcphẩm

1.2.1.2 Cấu tạo và tính chất

a, Cấu tạo

Pectin là một heteropolysaccharide được tìm thấy trong phiến giữa và thành tếbào cơ bản của thực vật bậc cao Chức năng của pectin là chất kết dính để giữpolysaccharide khác của thành tế bào, như là cellulose và hemicellulose (nghĩa là

xyloglucan hoặc glucuronarabioxylan) và protein như là glycoprotein giàuhydroxyproline lại với nhau (Hình 1.1) (Wageningen, 2000)

Hình 1.1 Thành tế bào của hầu hết thực vật có hoa

Cấu trúc chính của pectin bao gồm một polymer của D-galacturonic acid, gọilà homogalacturonan (homopolymer của [14]-D-galactopyranosyluronic acid,với một phần các nhóm carboxyl bị methyl hóa, hình 2A) và rhamnogalacturonan I(heteropolymer của [12]-L-rhamnosyl-[14]-D-galactusyluronic aciddisaccharide, hình 2B) (Thakur, 1997) Khác với rhamnogalacturonan I (RGI),rhamnogalacturonan II phức tạp hơn (RGII) được xác định trong thành cơ bản củathực vật (Darvill, 1978) và đóng vai trò quan trọng như là phân tử báo hiệu cho sựphát triển của thành tế bào hơn là polymer cấu trúc (Carpita, 1990) RGI chủ yếuđảm trách cho sự phức tạp về cấu trúc và hóa học của cơ chất pectic

Hình 1.2 Cấu tạo một đơn vị chuỗi pectin

Hình 1.3 Cấu trúc chính của pectic polysaccharide (A) Acid polygalacturonic bao gồm các

đơn vị [12]]-D-galactopyranosyluronic, bị methylester hóa một phần ở C6 (B) Rhamnogalacturonan I (RGI) chứa các đơn vị disaccharide lặp lại của [12]]-L-rhamnosyl- [14]]-D-galactosyluronic acid (GaIA) Đơn vị GaIA có thể bị acetyl hóa ở alcohol bậc hai Khoảng một nữa các đơn vị rhamnosyl của RGI mang các chuỗi bên như là arabinan, arabinogalactan và galactan (Carpita, 1990)

Phân tử pectin được phân nhánh tại phần rhamnogalacturonan bằng chuỗi bênnhư là arabinan, galactan hoặc arabinogalactan, được liên kết bằng liên kết [14]vào rhamnose Ở chuỗi bên chính, những đơn vị arabinose được tạo liên kết [15] và đơn vị galactose được kết hợp bởi liên kết [14] Ngoài những phân tửđường trung tính này, chuỗi bên của pectin có thể chứa D-xylopyranose, D-glucopyranose và L-fucopyranose, trái lại trong RGII cũng có D-apiose, 2-O-methyl-D-xylose và 2-O-methyl-L-fucose Trong RGI, đầu acid galacturonic

thường bị acetyl hóa ở vị trí C2 và C3, nhưng sự acetyl hóa cũng thấy ở vùnghomogalacturonan.

Phân tử lượng của các loại pectin tách từ nguồn quả khác nhau thay đổi tronggiới hạn rộng rãi Ví dụ từ nguồn táo, mận thu được pectin có phân tử lượng từ25.000-35.000, trong khi đó pectin lấy từ cam có phân tử lượng là 50.000

Tên gọi pectin dùng để chỉ các chuỗi polygalacturonic methyl hoá 100% Têngọi acid pectinic để chỉ chất được methyl hoá thấp hơn 100% Tên gọi acid pecticchỉ acid polygalacturonic hoàn toàn không chứa nhóm methoxyl Trong thực tiễn thìtên pectin dùng để chỉ cả acid pectinic và pectin Tỉ lệ methyl hoá được biểu hiệnbằng chỉ số methoxyl Sự methyl hoá hoàn toàn tương ứng với chỉ số methoxylbằng 16,3% còn các pectin tách ra từ thực vật thường có chỉ số methoxyl từ 10-12% Chiều dài của chuỗi acid polygalacturonic có thể biến đổi từ vài đơn vị tớihàng trăm đơn vị acid galacturonic Theo một vài dẫn liệu cho thấy một số nhómhydroxyl có thể bị axetyl hoá

Có 2 cách phân loại:

Theo % nhóm methoxyl có trong phân tử

- HMP (High Methoxyl Pectin): DE > 50% hay MI > 7%

- LMP (Low Methoxyl Pectin): DE < 50% hay MI < 7%

Chỉ số methoxyl (MI): biểu hiện tỉ lệ methyl hoá là phần trăm khối lượngnhóm methoxyl (- OCH3) trên tổng khối lượng phân tử

Chỉ số ester hoá (DE) thể hiện mức độ ester hoá của pectin là phần trăm vềsố lượng của các gốc acid galacturonic được ester hoá trên tổng số lượng gốc acidgalacturonic có trong phân tử

Theo khả năng hoà tan trong nước

- Pectin hoà tan: Methoxyl polygalacturonic

- Pectin không hoà tan: Protopectin-dạng kết hợp giữa pectin và araban ở thànhtế bào

b, Tính chất

- Dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng, hơi xám, hơi nâu

- Có khả năng tạo gel bền.

Các pectin và acid pectinic là những keo háo nước nên có khả năng hydrathoá cao nhờ sự gắn các phân tử nước vào các nhóm hydroxyl của chuỗipolymetylgalacturonic Ngoài ra trong các phân tử pectin có mang điện tích âm nênchúng có khả năng đẩy lẫn nhau do đó làm giãn mạch và làm tăng độ nhớt củadung dịch Khi làm giảm độ tích điện và hydrat hoá sẽ làm cho các sợi pectin xíchlại gần nhau và tương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa phalỏng ở bên trong

Khả năng tạo gel phụ thuộc chủ yếu vào 2 yếu tố: chiều dài của chuỗi pectinvà mức độ methyl hoá

- Chiều dài của phân tử quyết định độ cứng của gel: Nếu phân tử pectin quángắn thì nó sẽ không tạo được gel mặc dù sử dụng với liều lượng cao còn quá dàithì gel tạo thành rất cứng

- Mức độ methoxyl hoá quy định cơ chế tạo gel: Tuỳ thuộc vào chỉ số methoxylcao (>7%) hoặc thấp hơn (3-5%) ở phân tử pectin mà các kiểu kết hợp giữa chúngsẽ khác nhau trong việc tạo gel

Khi pectin có chỉ số methoxyl cao mức độ hydrat hoá có thể giảm thấp nhờthêm đường còn độ điện tích sẽ hạ đi nhờ thêm ion H+ Khi đó liên kết giữa cácphân tử pectin với nhau chủ yếu nhờ các cầu hydro giữa các nhóm hydroxyl Kiểuliên kết này không bền do đó các gel tạo thành sẽ mềm dẻo do tính di động củacác phân tử trong khối gel, loại gel này khác biệt với gel thạch và gelatin

Khi chỉ số methoxyl thấp có nghĩa là tỷ lệ các nhóm – COO- cao các liên kếtgiữa những phân tử pectin sẽ là liên kết ion qua các ion hoá trị hai đặc biệt là Ca2+.Có thể tạo gel khi dùng một lượng canxi dưới 0,1% miễn là chiều dài phân tửpectin phải đạt mức độ nhất định Khi đó gel được hình thành ngay cả khi khôngthêm đường và acid

- HMP tạo gel bằng liên kết hydro

Điều kiện tạo gel: Đường >50%, pH = 3-3.5, Pectin 0.5-1%

Đường có khả năng hút ẩm, vì vậy nó làm giảm mức độ hydrat hoá của cácphân tử pectin trong dung dịch

pH acid trung hoà bớt các gốc COO-, làm giảm độ tích điện của các phân tử

Vì vậy các phân tử có thể có thể tiến lại gần nhau để tạo thành liên kết nộiphân tử và tạo thành gel Liên kết hydro được hình thành giữa các phân tử pectincó thể là hydroxyl–hydroxyl, carboxyl-carboxyl, hydroxyl-carboxyl Kiểu liên kếtnày không bền do đó các gel tạo thành sẽ mềm dẻo bởi tính linh động của các phântử trong khối gel.

Cấu trúc gel phụ thuộc vào hàm lượng đường, hàm lượng acid, hàm lượngpectin, loại pectin và nhiệt độ

30%-50% đường thêm vào pectin là saccharose do đó cần duy trì pH acid để ởnhiệt độ cao chẳng hạn khi đun nấu sẽ gây ra quá trình nghịch đảo đường ngăn cảnsự kết tinh đường tuy nhiên cũng không nên dùng quá nhiều acid vì pH quá thấp sẽgây nghịch đảo đường gây kết tinh glucose và hoá gel nhanh tạo nên vón cục Khidùng lượng pectin vượt quá lượng thích hợp sẽ gây ra gel quá cứng do đó khi dùngmột nguyên liệu có chứa nhiều pectin cần phân giải bớt pectin bằng cách đun lâuhơn

Khi sử dụng một lượng cố định bất cứ một loại pectin nào ở pH, nhiệt độ thấp,hàm lượng đường cao thì gel tạo thành càng nhanh

- LMP tạo gel bằng liên kết với ion Ca2+

Điều kiện tạo gel: Khi có mặt Ca2+, ngay cả ở nồng độ < 0.1%, không cầnđường và acid

Ở LMP, tỉ lệ các nhóm COO- cao do đó các liên kết giữa những phân tửpectin sẽ được tạo thành qua cầu nối là các ion hoá trị (II), đặc biệt là Ca2+

Cấu trúc gel phụ thuộc vào nồng độ Ca2+

Đặc điểm của gel là đàn hồi

Bảng 1 Điều kiện tạo gel của pectin

DE pH Đường Ion hoá trị II Tốc độ tạo gel

1.2.1.3 Ứng dụng

Pectin là tác nhân tạo gel quan trọng được sử dụng để tạo ra cấu trúc gel chothực phẩm, chủ yếu là những thực phẩm có nguồn gốc từ rau quả Khả năng tạo gelcủa nó còn được sử dụng ở thực phẩm cần có sự ổn định nhiều pha, trong sản phẩmcuối hoặc ở một giai đoạn tức thời trong quy trình sản xuất

Phân tử pectin dài và dễ vướng vào nhau làm dung dịch có độ nhớt nên pectincó khả năng tạo đặc Tác dụng tạo đặc của pectin được sử dụng chủ yếu ở nhữngloại thực phẩm mà quy định không cho phép sử dụng những loại gum có giá thànhrẻ hơn hay những thực phẩm cần có hình dáng thật tự nhiên

Pectin là thành phần quan trọng của thực phẩm bởi vì làm giảm cholesterolcủa bữa ăn nhưng việc sử dụng nó như phụ gia trong sản phẩm thịt đã bị giới hạn vìchúng có tác động tiêu cực đối với những đặc tính cơ học Gần đây việc sử dụngLMP amin hoá trong sản phẩm tái cấu trúc cá đã được đưa ra vì chúng có thể cảitiến những đặc tính cơ học của gel cá ở mức độ không đáng kể Mục đích của việcnày là để xác định hiệu quả của LMP amin hoá và không amin hoá với sự hiệndiện của ion Ca2+ lên đặc tính cơ học của sản phẩm tái cấu trúc cá Ciclopsetta

chittendenni – một loại cá của Mêhicô được thu nhận từ những ngư dân ở

Matamoros, Tamaulipas Hai loại pectin khác nhau (LMP-35 không amin hoá vàLMP amin hoá) tại 4 nồng độ khác nhau 0 (kiểm soát), 1, 2 và 3% với 4 nồng độCaCl2 (0 kiểm soát, 0.2, 0.4, 0.6) được thu nhận Cá ở dạng paste Pate cá nấu ở

400C trong 30 phút và nấu ở 900C trong 15 phút Hiệu quả của việc xử lý dựa trênkhả năng giữ nước, phân tích sơ bộ kết cấu, kiểm tra kĩ độ chắc Độ cứng và lựcphá vỡ được gia tăng khi sử dụng 1% LMP 35% và 0.4% canxi Nồng độ pectin caohơn làm suy yếu cấu trúc gel Những kết quả thu được thể hiện LMP amin hoáđược thêm vào với CaCl2 thì thích hợp cho việc tạo ra sản phẩm cá với đặc tính cơhọc cao hơn và chứa đựng dinh dưỡng tăng thêm giá trị: kết cấu có lợi cho sức khoẻvà canxi

Pectin có thể được trộn với những phụ gia thực phẩm được chấp nhận khác vàdùng trong những sản phẩm đặc trưng

1.2.2 Cơ chế xúc tác của pectinase

Pectinase hay là enzym thủy phân pectin, được sản sinh bởi một số vi khuẩn,nấm men, nấm mốc, protozoa, côn trùng, giun tròn và thực vật (Whitaker, 1991) để

phân hủy (để thu nhận nguồn carbon) hoặc để hiệu chỉnh (trong quá trình làm chínquả) pectin heteropolysaccharide Chúng có thể phân loại tùy theo loại liên kết màchúng tấn công, thành esterase xà phòng hóa cơ chất, và depolymerase.Depolymerase có thể phân nhỏ hơn dựa trên cơ chế loại bỏ liên kết thành nhómhydrolase và nhóm lyase (khử ) Pectinase có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau,nhưng cơ bản có thể phân thành một nhóm đặc hiệu homogalacturonan và mộtnhóm đặc hiệu rhamnogalacturonan Ngoài những enzym phân cắt mạch pectinchính, enzym “phụ”, tấn công trên chuỗi bên của pectin, cần thiết để phân cắt hoàntoàn phân tử pectin Tuy nhiên có một nhóm enzym khác phân cắt pectin được địnhnghĩa bởi một số tác giả Những enzym này được gọi là protopectinase chuyểnnhững protopectin không tan thành pectin hòa tan (Wageningen, 2000).

1.2.2.1 Những enzym phân cắt homogalacturonan (Wageningen, 2000)

A niger sản sinh một số enzym hoạt động trên phần homogalacturonan của

phân tử pectin Chúng bao gồm pectin methyl- and acetyl-esterase (EC 3.1.1.11 và

EC 3.1.1.6), endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC3.2.1.67), pectate lyase (EC 4.2.2.2) và pectin lyase (EC 4.2.2.10) Pectin lyase cóthể sử dụng pectin bị methylester hóa có trong tự nhiên, còn pectin methylesterasethì cần thiết để tạo ra pectin (pectate) có mức độ methylester hóa thấp, thành cơchất cho polygalacturonase và pectin lyase

Trong khi endo và exopolygalacturonase thủy phân đặc hiệupolygalacturonate hoặc pectin có mức độ ester hóa thấp; một nhóm khác củapolygalacturonase, endopolymethylgalacturonase, tấn công vào pectin methylesterhóa cao (Whitaker, 1991) Tuy nhiên, những nhà nghiên cứu khác không bao giờ cóthể chứng minh hoạt tính của enzym trên cơ chất này, mà hầu hết có nguồn gốc dosự có mặt của hoạt tính pectin methylesteras và pectin lyase nhiễm vào.

b, Pectin và pectate lyase

Lyase xúc tác phân cắt khử của liên kết [14]-glycoside giữa đầu acidgalacturonic (methylester hóa) trong pectin hoặc pectate để oligosaccharide Δ4,5không bão hòa ở đầu không khử của sản phẩm (hình 3)

Pectinlyase là enzym duy nhất có khả năng depolymer phân tử pectin màkhông cần hoạt động trước của các enzym khác (Taragano cùng cộng sự, 1997).(Debing, 2006)

Hình 1.1 Loại bỏ liên kết [14]]-glycoside bằng pectate và pectin lyase của phần homogalacturonan trong phân tử pectin

Pectate lyase có trong những loài nấm khác nhau, như là A nidulans (Ho,1995), Colletotrichum gloeosporioides (Templeton, 1994) và Mycosphaerellapinodes (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/ghf_28.html); trong thực vật như làNicotina tabacum (Rogers, 1992) và Lycopersicon esculentum (Wing, 1990) Tuynhiên gen mã hóa pectate lyase vi khuẩn và sản phẩm của nó chủ yếu là gây bệnh,

như là E chrysanthemi và E carotovora Pectin lyase thường hoạt động ở pH thấp

hơn 8,0 và pectate lyase ở pH 8-10 Pectate lyase thường phải đòi hỏi có ion Cađể xúc tác Trong khi cơ chất tốt nhất cho pectin lyase là pectin có mức độ esterhóa cao thì pectate lyase thường hoạt động trên pectate hoặc pectin có mức độester hóa thấp (20-50%) (Whitaker, 1991).

c, Pectin methyl- và acetyl-esterase

Pectin methylesterase (PME) hoạt động trên pectin để loại bỏ nhóm methoxyltừ nhóm carbonyl của đơn vị galacturonate và acetyl ester hóa loại bỏ nhóm acetyltừ vị trí C2 và C3 trong galacturonate tạo ra alcohol bậc hai và acetate (hình 4) Cảhai hoạt tính enzym này đều cần thiết để tạo ra cơ chất mà có thể được tiêu thụ bởinhững enzym depolymer hóa pectin Hoạt động kết hợp giữa pectinesterase vàpolygalacturonase là cần thiết để phân cắt pectin (Debing, 2005) Gen mã hóaPME được trích ly từ những nấm khác nhau như là A niger (Khanh, 1990; Kester,2000), A aculeatus (Christgau, 1996) và A oryzae (Kitamoto, 1999), thực vật và vikhuẩn

Hình 1.1 Phản ứng deester hóa của pectin xúc tác bởi pectyl methyl- và acetyl-esterase

1.2.2.2 Enzym phân cắt rhamnogalacturonan I

Những enzym này đại diện cho một nhóm pectinase được hình thành gần đâymà được mô tả bởi Schols cùng cộng sự (Schols, 1995) Cho đến bây giờ, 4 enzymvới hoạt tính đặc hiệu lên phần RGI của phân tử pectin được trích ly từ Aspergillus,như là rhamnogalacturonan hydrolase (RGhydrolase) từ A aculeatus (Schols, 1990;

rhamnogalacturonan lyase (Rgpectin lyase) từ A aculeatus (Kofod, 1994; Mutter, 1996), rhamnogalacturonan rhamnohydrolase (Rgrhamnohydrolase) từ A aculeatus

(Mutter, 1994) và rhamnogalacturonan galacturonohydrolase

(RG-galacturonohydrolase) từ A aculeatus (Mutter, 1998) Tất cả enzym này hoạt động

trên đơn vị của RGI chứa các phân tử acid galacturonic (GaIA) – rhamnose (Rha)tuần tự một cách nghiêm ngặt RG-hydrolase và RG-lyase là những enzym hoạttính endo, RG-hydrolase phân cắt liên kết GalARha, trong khi RG-lyase cắt liênkết Rha-GalA, để lại GalA không bão hòa Δ4,5 ở đầu không khử RG-rhamnohydrolase và RG-galacturonohydrolase là những enzym exo, tương ứng giảiphóng Rha hoặc GalA bão hòa từ đầu không khử của RGI (hình 5) RG-galacturonohydrolase không có khả năng phân cắt đầu GalA không bão hòa từ đầukhông khử

Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn vùng RGI của pectin chứa các phần GaIA và Rha tuần tự nghiêm

ngặt và sơ đồ biểu diễn hoạt tính của những enzym phân cắt rhamnogalacturonan khác nhau (Mutter, 1997)

1.2.2.3 Những enzym phụ

Vùng RGI của pectin được phân cắt ở Rha bởi những chuỗi bên của arabinan,arabinogalactan và galactan Hơn nữa, pectin được tạo liên kết ngang đến cácthành phần khác của thành tế bào thông quan liên kết ester của acid ferulic và acidcoumaric và những nhóm chức hydroxyl ở C2 và C6 của arabinose và galactosetrong chuỗi bên Những enzym phân cắt cấu trúc của pectic ở các vị trí này, đượcgọi là enzym phụ, bao gồm α-arabinofuranosidase, endoarabinase, β-galactosidase,endogalactanase và feruloyl và coumaroyl esterase (Vries, 1999)

1.2.3 Vi sinh vật sinh tổng hợp pectinase

Pectinase công nghiệp dùng trong công nghiệp thực phẩm thường từ nấm, đặc

biệt từ những loài của giống Aspergillus (chẳng hạn A.niger, A.wentii và A.oryzae) và Rhizopus (Acun˜a-Argu¨elles cùng cộng sự, 1995) Enzym pectinase từ nấm

thường chứa một hỗn hợp enzym thủy phân pectic và cũng luôn chứa xylanase,cellulase và hemicellulase Tuy nhiên, trong một số trường hợp, chỉ có một loạienzym thủy phân pectic được đòi hỏi Trong các loài nấm sản sinh pectinase,

Aspergillus niger là loài sử dụng nhiều nhất (Ismail, 1996; Castilho cùng cộng sự,

2000) Nhiều pectinase công nghiệp từ A.niger có hoạt tính PG thấp A.niger cũng

tiết ra pectinmethylesterase tạo ra methanol có độc tính Chi phí sản xuất của PG từ

A.niger cao nếu cần enzym tinh khiết Ngoài ra, loài Trichoderma cũng được ghi

nhận là sản sinh enzym thủy phân pectin như là T.lignorum (Mabrouk cùng cộng sự, 1979) và T.reesei (Haltmeir cùng cộng sự, 1983)

Mặc dù enzym thủy phân pectic có thể được sản xuất từ nấm men nhưngkhông rộng rãi Rất ít loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp pectinase, chủ yếu

là giống Saccharomyces, Kluyveromyces, Cryptococcus, Rhodotorola, và Candida

(Luh và Phaf, 1954; Vaugn cùng cộng sự, 1969; Winborne và Richard, 1978; Limcùng cộng sự, 1980; Federici, 1985; Barnby cùng cộng sự, 1990)

Schwan cùng cộng sự (1997) nghiên cứu khả năng tiết enzym thủy phânpectin từ nấm men phân hủy thịt ca cao Kết quả cho thấy hầu hết nấm men đượctìm thấy ở 36h đầu tiên của lên men ca cao, là thời gian thịt quả bị phân hủy, ngoại

trừ K thermotolerans chỉ xuất hiện vào cuối giai đoạn lên men Hoạt tính thủy phân pectin được xác định ở một số loài nấm men như là K.marxianus, S.cerevisiae

var chevalieri, K.marxianus, C.rugopelliculosa và K.thermotolerans Những giống

còn lại kiểm tra cho thấy không có hoạt tính pectinase ngoại bào Tế bào sinhtrưởng trong môi trường cơ bản chứa 1% w/v glucose và 1% w/v pectin ở 30oCtrong 5 ngày Enzym pectinolytic được tạo thành chỉ trong giai đoạn sinh trưởngexpo Cả bốn loài đều có hoạt tính PG ngoại bào (bảng 5) PME và pectic lyasekhông kiểm tra thấy có trong canh trường Khi 1% w/v pectate được dùng làm cơchất, hoạt tính cao hơn 3 lần so với khi dùng 1% w/v pectin Do đó cho thấy pectatethích hợp dùng làm cơ chất hơn để sản sinh những enzym này

Hầu hết pectinase được cảm ứng bởi pectin và phụ thuộc vào sự ức chế dị

hóa, tuy nhiên PG của K.marxianus rất khác thường bởi vì sự sinh tổng hợp PG là

cơ bản và không bị ức chế bởi carbohydrate Sản sinh tối đa ở hàm lượng glucose10% w/v glucose đưới điều kiện yếm khí

Silva cùng cộng sự (2005) nghiên cứu khả năng tiết enzym thủy phân pectintừ nấm men có trong trái cây nhiệt đới Kết quả cho thấy trong 300 giống nấm mentrích từ trái cây nhiệt đới, chỉ có 21 (7%) có hoạt tính polygalacturonase dương tínhvà 7 trong số đó có hoạt tính pectin lyase dương tính (Bảng 5) PME không tìm thấytrong những canh trường nấm men này Giống IC-50 và IC-54 chỉ tiết PG khi dùngglucose làm nguồn carbon, trong khi SL-140 tiết enzym khi galactose làm nguồn

carbon Galactose là nguồn carbon tốt hơn glucose cho giống S.cerevisiae được biến

đổi gen để sinh tổng hợp polygalacturonase (Jia, 2000)

Nấm men Stephanoascus smithiae (giống FT-01, 168, 36 và 147), Pichia sp.

(FT-28) (Bảng 5) cũng có khả năng tiết pectin lyase trong môi trường pH 7.0 chứapectin (85% ester hóa) Mặc dù nhiều tác giả cho rằng nấm men chỉ tiết PG,Gainvors (Gainvors, 1994) cũng kiểm tra thấy có hoạt tính pectin lyase trong nấm

men S.cerevisiae trích ly từ dịch lên men rượu vang.

Có sự đa dạng rất lớn giữa các loài nấm men liên quan với trái cây (Morais,1995; Fleet, 2003) hoặc thịt trái cây (Trindade, 2002) Dường như một số giống cóhoạt tính pectinolytic để tối ưu cho sự sinh trưởng của nó (Gainvors, 1994) Hoạttính pectinolytic ở nấm men là một phương tiện làm tăng khả năng sống khi phảitiêu thụ nguồn carbon đơn giản hơn (Trindade, 2002), nhưng một số tác giả(Blanco, 1994, 1999) cho rằng chức năng của những enzym này chưa được biết rõ.Nấm men từ ca cao tiết ra polygalacturonase thậm chí nếu chúng không có khảnăng sử dụng pectin hoặc acid galacturonase như là nguồn carbon chính (Schwan,1997) Có thể là nấm men có trong một số trái cây nhiệt đới sản sinh ra pectinaseđể phân hủy pectin có trong cùi quả để tiêu hóa đường ở mạch nhánh của pectinnhư là rhamnose, galatose và arabinose

Bảng 1 Hoạt tính PG ngoại bào và mức giảm độ nhớt tương đối (RVU) do PG tiết ra từ

những nấm men nhiệt đới khác nhau*

* Canh trường được sinh trưởng trong môi trường chứa 1% (w/v) glucose + 1% (w/v) pectin dưới điều kiện hiếu khí trong 3 ngày.

** Hoạt tính PG tương đương mol acid galacturonic giảm phóng trong 1 phút trên 1 g protein tổng

*** Đơn vị độ nhớt tương đối (RVU) được định nghĩa như là lượng enzym cần để làm giảm 50% độ nhớt ban đầu trong 1 phút Sự giảm độ nhớt được xác định dùng dung dịch 3,2% (w/v) acid polygalacturonic ở 25 o C.

****Giá trị trung bình của hoạt tính PG theo sau những ký tự giống nhau là sai lệch không có nghĩa dùng Tukey test (5%)

Bảng 2 Đặc tính hóa sinh của một số enzym pectinase của nấm men (Blanco, 1999)

Blanco cùng cộng sự cho biết rượu vang lên men dùng S.cerevisiae có hoạt

tính PG thì qui trình làm trong sẽ dễ dàng hơn và thời gian lọc sẽ giảm đến 50%trong một số trường hợp

Hình 2.1 Aûnh hưởng của pH khác nhau ở 37 o C (a) và nhiệt độ ở pH 5,5 (b) lên hoạt tính của polygalacturonase của chủng S.cerevisiae UCLMS-39 (Ferna´ndez-Gonza´lez, 2]004])

Nhiều loại vi khuẩn như là B polymyxa (Nagel và Vaughn, 1961), Erwinia

spp (Tanabe và Kobayashi, 1987), E.carotovo ra (Tanabe cùng cộng sự, 1986), Ps.syringae (Magro cùng cộng sự, 1994) được biết là có khả năng sản sinh enzym

thủy phân pectin

Bởi vì hầu hết những loài sản xuất pectinase nhiều là nấm và vi khuẩn và pHtối ưu cho hoạt tính của enzym nằm trong vùng trung tính hoặc acid (Fombouts,1980), nên ứng dụng của enzym bị hạn chế Nhiều enzym ngoại bào được sản xuất

bởi vi khuẩn ưa kiềm cho thấy pH cao lên đến 10 (Horikoshi, 1982) Nhiệt độ tối ưu

cũng như độ bền nhiệt cũng cao Chẳng hạn pH tối ưu cho pectinase từ Bacillus sp.

NTT33 ưa kiềm và Bacillus firmus từ 10 đến 11, và nhiệt độ cho hoạt động từ

60-70oC (Cao, 1992) Điều này là mở rộng ứng dụng của enzym pectinase từ vi khuẩn

Bảng 3 Sản xuất enzym pectinase từ vi sinh vật trên các nguồn cơ chất và phương pháp khác

nhau

Pectinase Vi sinh vật Nguyên liệu

(nguồn carbon)

Phương pháp

Tài liệu tham khảo

1 Endo-polygalacturonase

Exo-polygalacturonase

Pectin liase

Penicillium viridicatum RFC3

Bã mía, cám

mì (1:1, w:w)

Lên men bề mặt

Silva cùng cộng sự (2004)

occitanis CT1

Gruel Lên

men bề sâu

Hadj-Taieb cùng cộng sự (2006)

3 Exo-polygalacturonase Aspergillus

awamori

Bột nho Lên

men bề mặt

Botella cùng cộng sự (2005, 2006)

niger dextrose gạoCám mì, cộng sự (2005)Debing cùng

5 Endo-polygalacturonase Kluyveromyces

marxianus CCT 3172

Môi trường bán tổng hợp Cố địnhtế bào cộng sự (2004,Almeida cùng

Lên men bề mặt

Bai cùng cộng sự (2003)

7 Endopolygalacturonase Saccharomyces

cerevisiae

Môi trường tổng hợp

Lên men bề sâu

Gonzádez (2004)

squamosus Môi trườngtổng hợp thốngHệ

lên men hai pha

Antov (2003)

9 Endopolygalacturonase Colletotrichum

lindemuthianu m

Đậu bean Lên

men bề mặt

Herbert (2003)

10 Polygalacturonase Kluyveromyces

wickerhamii Môi trườngtổng hợp men bềLên

sâu

Moyo cùng cộng sự (2003)

DT7

Môi trường tổng hợp

Lên men bề mặt

Kashyap cùng cộng sự (2002)

niger, Trichoderma viride

men ở dạng slurry- state

cộng sự (2001)

13 Endopolygalacturonase,

Exo-polygalacturonase

Penicillium occitanis đột biến

Môi trường tổng hợp

Lên men bề mặt

Hadj-Taieb cùng cộng sự (2002)

14 Endopolygalacturonase,

Exo-polygalacturonase stolonifer,Rhizopus

Aspergillus awamori

Bột mì thô + pectin men bềLên

sâu

Blandino cùng cộng sự (2001)

15 Endopolygalacturonase,

Exo-polygalacturonase squamosusPolyporus Dịch trích củcải đường thốngHệ

lên men hai pha

Antov cùng cộng sự (2001, 200),

16 Polymethylgalacturonas

e Aspergillusniger Glucose, tinhbột, hoặc bột

đậu nành

Cố định tế bào trong gel alginate

Pashova cùng cộng sự (1999)

17 Polymethylgalacturonas

e

Aspergillus niger

Pectin táo Cố định

tế bào trong gel alginate

Angelova cùng cộng sự (1997)

18 Polygalacturonase Nấm men Pectin,

glucose men bềLên

sâu

Schwan cùng cộng sự (1997)

niger Cám mì + bãcủ cải đường men bềLên

mặt

Dinu cùng cộng sự (2007)

men bề mặt

Botella cùng cộng sự (2005)

21 Polygalacturonase

Lyase Thermoascusaurantiacus Vỏ cam, vỏcủ cải

đường, cám mì

Lên men bề mặt

Martins cùng cộng sự (2001)

22 Endopolygalacturonase

Exopolygalacturonase stolonifer,Rhizopus

Apergillus awamori

Bột cám mì Lên

men bề sâu

Blandino cùng cộng sự (2001)

23 Endopolygalacturonase

Exopolygalacturonase squamosusPolyporus Nước thải từdịch trích củ

cải đường

Hệ thống lên men hai pha

Antov cùng cộng sự (2001, 2000)

niger

Đậu nành, cám mì

Lên men bề

Castilho cùng cộng sự

mặt (1999,1998)

25 Exopolygalacturonase

kiềm

Bacillus subtilis RCK

Cám mì Lên

men bề mặt

Gupta cùng cộng sự (2007)

26 Polygalacturonase Pleurotus

ostreatus

Bã cà chua Lên

men bề sâu

Freixo cùng cộng sự (2007)

27 Polygalacturonase Aspergillus

sojae ATCC 20235

Kê nghiền Lên

men bề mặt

Ustok cùng cộng sự (2006)

28 Exo-polygalacturonase Aspergillus

awamori

Bã nho Lên

men bề mặt

Botella cùng cộng sự (2006)

29 Polygalacturonase Aspergillus

niger Vỏ cam Cố địnhtế bào

trong gel alginate

Nighojkar cùng cộng sự (2004)

30 Pectinase thô Aspergillus

niger, Trichoderma viride

Vỏ chanh Lên

men ở trạng thái slurry

Gregorio cùng cộng sự (2001)

31 Polygalacturonase bền

nhiệt Sporotrichumthermophile

Apinis

Dịch chiết nấm men và pectin

Lên men bề sâu

Kaur cùng cộng sự (2003)

32 Polygalacturonase Kluyveromyces

wickerhamii

Môi trường tổng hợp

Lên men bề sâu

Moyo cùng cộng sự (2002)

1.2.4 Ứng dụng của pectinase trong CNTP (Khandelwal, 2003)

Trong những năm vừa qua, pectinase được dùng trong nhiều qui trình côngnghiệp thông thường như là công nghiệp dệt, sợi thực vật, trà, cà phê, trích ly dầu,xử lý nước thải, nguyên liệu chứa pectin, v.v Chúng cũng được dùng để tinh sạchvirus (Salazar, 1999) và trong sản xuất giấy (Reid, 2004; Viikari, 2001), tuy nhiênchưa được thương mại hóa

1.2.4.1 Công nghiệp rau quả

a, Trích ly nước trái cây

Ứng dụng lớn nhất của pectinase là trích ly và làm trong dịch quả Xử lý thịtquả với pectinase trước khi ép giúp cải thiện hiệu suất thu dịch ép và chất màu(Charley, 1969) Phân hủy pectin bằng enzym giúp dịch ép dễ chảy và có đặc tínhthích hợp cho ép (Beltman cùng cộng sự, 1971) Xử lý thịt quả với pectinase cũng

cho thấy tăng thể tích dịch quả từ chuối, nho và táo (Kaur, 2004) Pectinase kết hợpvới những enzym khác như là cellulase, arabinase và xylase cũng được dùng làmtăng hiệu quả ép cho trích ly dịch ép (Gailing, 2000)

b, Làm trong dịch ép

Pectin là tăng độ nhớt và tính đục của dịch quả Hỗn hợp pectinase vàamylase được dùng để làm trong dịch quả Nó là giảm thời gian lọc đến 50%(Blanco, 1999) Thực tế phương pháp dùng enzym được xem là phương pháp lọcbằng enzym Hiệu quả đạt được khi kết hợp PE và Polygalacturonase hoặc chỉdùng PL trong trường hợp dịch táo mà chứa pectin ester hóa nhiều (>80%) (Ishiicùng cộng sự, 1972)

c, Hóa lỏng

Độ nhớt của thịt táo giảm trong quá trình xử lý với pectinase và cellulase Chỉdùng cellulase cho hiệu quả thấp lên pectin và chỉ hòa tan 22% cellulose Kết hợphoạt tính cellulase pectinase giải phóng 80% polysaccharide Hiệu quả tương tự khixử lý màng membrane của múi bưởi (Pilnik và Voragen, 1993)

Chế phẩm chân không của pectinase có ứng dụng thương mại để làm mềm vỏquả citrus để tách vỏ Kỹ thuật này có thể thay thế qui trình cắt vỏ bằng tay(Baker, 1996)

d, Làm mềm quả (cho sản phẩm nhiều thịt quả như là nectar)

Mục đích của xử lý enzym là chuyển mô thành huyền phù những tế bàonguyên vẹn Quy trình này được gọi là làm mềm quả bằng enzym (với hoạt tínhcủa Polygalacturonase hoặc PL) Một ứng dụng thú vị của pectinase là làm mềmphần thịt khoai tây để sản xuất mặt nạ khoai tây dùng liền Vô hoạt enzymendogenous PE là quan trọng trong làm mềm nhiều sản phẩm (Pilnik và Voragen,1993)

e, Làm cứng quả

Trộn đào với pectinmethylesterase và Canxi làm cho trái cây cứng hơn 4 lần.Ngoài ra, kỹ thuật này cũng có thể ứng dụng cho xử lý đồ chua (Baker, 1996)

1.2.4.2 Công nghiệp dệt

a, Xử lý dệt và tẩy sinh học của sợi cotton

Pectinase được dùng cùng với amylase, lipase, cellulase và hemicellulase đểloại bỏ những tác nhân sizing từ cotton theo cách an toàn và thân thiện, thay thếcho soda kiềm độc (Hoondal, 2000).

Tẩy sinh học là một qui trình hiện đại để loại bỏ những tạp chất không phải làcellulose từ sợi với enzym đặc hiệu Pectinase được sử dụng mà không có tác dụngphụ lên sự phân hủy sợi cellulose (Hoondal, 2000)

1.2.4.3 Tách gum từ sợi libe thực vật

Sợi libe là sợi mềm được hình thành bên ngoài sợi xylem, phloem hoặc trụ bì,chẳng hạn như là Ramie và sunn hemp Sợi chứa gum, cần được loại bỏ trước khidùng sản xuất dệt Xử lý tách gum hóa học thì ô nhiễm, độc và không phân hủysinh học Tách gum sinh học dùng pectinase kết hợp với xylanase là một phươngpháp thay thế có tính kinh kế và thân thiện hơn (Hoondal, 2000)

a, Giầm sợi thực vật

Pectinase được dùng để giầm sợi lanh để phân tách thành sợi và loại bỏpectin (Hoondal, 2000)

1.2.4.4 Xử lý nước thải

Công nghiệp xử lý rau quả tạo ra pectin, chứa trong chất thải như là phụphẩm Tiền xử lý nước thải với enzym thủy phân pectin giúp cho loại bỏ nguyênliệu chứa pectin dễ dàng và làm cho nó thích hợp để phân hủy bằng xử lý với bùnhoạt tính (Hoondal, 2000)

1.2.4.5 Lên men cà phê và trà

Xử lý pectinase làm tăng tốc độ lên men trà và cũng phá hủy bọt hình thànhđặc tính của bột trà hòa tan do phá hủy pectin (Carr, 1985) Chúng cũng được dùngtrong lên men cà phê để loại bỏ lớp bao nhầy từ hạt cà phê

1.2.4.6 Công nghiệp giấy

Trong sản xuất giấy, pectinase có thể phân hủy pectin và do đó làm giảm nhucầu cation cho dung dịch pectin và cho dịch trích từ quá trình tẩy trắng peroxide(Reid, 2004)

1.2.4.7 Thức ăn cho động vật:

Pectinase có mặt trong hỗn hợp enzym dùng để sản xuất thức ăn gia súc.Pectinase có tác dụng làm giảm độ nhớt của thức ăn, làm tăng tính hấp thụ chấtdinh dưỡng, giải phóng chất dinh dưỡng, do thủy phân những sợi không bị phân hủysinh học hoặc do giải phóng chất dinh dưỡng bị khóa bởi những sợi này, và làmgiảm hàm lượng cặn (Hoondal, 2000)

1.2.4.8 Tinh sạch virus thực vật

Trong trường hợp những phần tử virus bị giới hạn trong phloem, pectinasekiềm và cellulase có thể dùng để giải phóng virus khỏi mô để cho chế phẩm virustinh khiết (Salazar, 1999)

1.2.4.9 Trích ly dầu

Dầu citrus như là tinh dầu chanh có thể trích ly với pectinase Chúng phá hủyđặc tính nhũ của pectin, mà can thiệp vào việc thu nhận của dầu từ dịch trích vỏcitrus (Scott, 1978)

1.2.4.10 Cải thiện đặc tính màu và độ ổn định của vang đỏ

Pectolytic enzymes được cho vào dịch lên men rượu vang trắng để thúc đẩyquá trình làm trong Một ứng dụng khác của pectolytic enzymes liên quan với kỹthuật thermovinification Trong quá trình gia nhiệt lên đến 50oC trong vài giờ, mộtlượng lớn pectin được giải phóng khỏi nho, điều này không xảy ra trong quy trìnhtruyền thống Do đó cần phải thêm enzym pectinase vào khối dịch gia nhiệt để độnhớt của dịch giảm xuống Hiệu quả khác từ quy trình là tăng trích ly anthocyanin,có thể là do sự phá vỡ cấu trúc tế bào bởi enzym, làm cho sắc tố thoát nhanh hơnvà do đó giúp tăng cường độ màu (Tucker và Woods, 1991; Revilla, 2003)

Các dạng thương mại với pectin lyase như là thành phần chính thì thích hợphơn trong qui trình xử lý rượu vang và dịch quả bởi vì nó tránh việc sản xuấtmethanol

1.2.5 Quy luật của quá trình sinh tổng hợp enzyme

1.2.5.1 Sự cảm ứng bởi cơ chất

Wageningen (2000) đánh giá điều hòa gen mã hóa pectinase trong A niger,

dùng pectin hoặc các thành phần monosaccharide cấu tạo của nó, acid galacturonic và L-rhamnose như là nguồn carbon Acid D-galacturonic được xem là

D-chất cảm ứng cho một số gen mã hóa pectinase bao gồm exoPG (pgx), pectin lyase

A (pelA), pectate lyase A (plyA), pectin methylesterase (pme) vàrhamnogalaturonan lyase A (rglA) Pectin từ củ cải đường có tác dụng cảm ứngmạnh đến rhamnogalacturonan hydrolase A (rghA)

Panayotou cùng cộng sự (1997) nghiên cứu điều kiện sinh trưởng cho

Aspergillus sp.ATHUM-3482 sinh tổng hợp polygalacturonase Kết quả cho thấy

nguồn carbon tối ưu là pectin citrus 3% w/v thu được hoạt tính PG cao nhất là 2,6U/mL (Hình 1.8) Nồng độ pectin cao hơn sẽ làm trể sự sinh trưởng nấm và sinhtổng hợp enzym

Hình 1.1 Aûnh hưởng của nồng độ pectin lên sự sinh tổng hợp PG bởi Aspergillus sp

ATHUM-34]82] Điều kiên sinh trưởng: môi trường có pH 3, nguồn nitơ 7g/L (NH 4] ) 2] HPO 4] , 30 o C.

Teixeira cùng cộng sự (2000) nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự

sinh tổng hợp các loại pectinase khác nhau từ Aspergillus japonicus 586 Giữa các

nguồn carbon, 5% pectin sau 72 h nuôi cấy cho thấy hoạt tính pectinesterase tốtnhất (5,7 U/mL) Khi có mặt cơ chất tương tự, sau khi tăng gấp đôi hoặc giảm mộtnữa nồng độ cuối cùng, hoạt tính PE giảm sau 48h tương ứng 39% và 30% Nhữngkết quả này cho thấy có sự ức chế enzym có lẽ là do sự có mặt của những sảnphẩm phân cắt pectin mà hoạt động như là chất ức chế enzym hoặc những dạngphân tử khác của PE nhạy với thành phần này Hơn nữa, Crotti (1993) cho rằngnồng độ thấp của những cơ chất này không đủ để tăng sự sinh tổng hợp pectinase

trong Penicillin frequentans Trong suốt quá trình lên men, hoạt tính PE tối đa (5,5

U/mL) ở 48h, với 3,2% pectin thấp hơn so với trường hợp 5% pectin Khi có mặt0,5% pectin và 0,5% glucose, giá trị 1,9 U/mL ở 72h là hoạt tính enzym tối đa.

Endo-PG từ A.japonicus 586, khi có mặt pectin và glycerol hoặc khi chỉ có

glycerol trong 120h, có điều kiện tối ưu cho hoạt tính enzym tối đa (tương ứng là0,592 U/mL và 0,565 U/mL) Những kết quả này cho thấy endo-PG cảm ứng bởiglycerol dưới điều kiện phân tích, và điều này chứng minh những kết quả của

Aguilar và Huitron (1990) trong canh trường của Aspergillus sp CH-Y-104]3 Khi chỉ

dùng pectin, hoạt tính exo-PG cao hơn từ canh trường chứa 0,25% pectin (0,474 U/mL) và 0,5% pectin (0,427 U/mL) Trong canh trường dùng 1% pectin, hoạt tínhenzym giảm xuống 0,247 U/mL

Malvessi cùng cộng sự (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi

trường lên sinh tổng hợp PG của A.oryzae Kết quả thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng

của nồng độ chất cảm ứng (pectin) lên quá trình sản xuất endo-PG thể hiện tronghình 10, so sánh giữa môi trường WB không có chất cảm ứng và môi trường chứa 5,

10, 20 hay 30 g/L pectin Khi không có pectin, hoạt tính endo-PG rất thấp, cần phải

có chất cảm ứng để kích thích sự sản xuất ra endo-PG bởi A oryzae CCT394]0 Khi

hàm lượng pectin 5 g/L, hoạt tính endo-PG đạt 125 U/mL sau 120 h cấy giống Giátrị cao nhất là 177 U/mL khi hàm lượng pectin 10 g/L cũng sau 120 h Khi sử dụng

20 g/L pectin, điểm thu endo-PG cao nhất ở 72 h, nhưng ở 96 h không có sự khácnhau có nghĩa giữa 10 và 20 g/L pectin Ở hàm lượng 30 g/L pectin, có sự giảmhoạt tính endo-PG, do có sự tăng độ nhớt môi trường gây khó khăn trong việc duytrì sự đồng nhất của canh trường và sự vận chuyển oxy Giá trị cao nhất đối vớiendo-PG tương ứng với giá trị pH thấp, 3,5 – 4,5

Hình 1.2 Sự thay đổi hoạt tính của PG theo thời gian trong quá trình nuôi cấy A.oryzae trong

môi trường chứa cám mì với nồng độ pectin khác nhau: 0g/L, 5g/L, 10g/L, () 2]0g/L, 30g/L

Vỏ chanh và vỏ quýt sử dụng như một chất cảm ứng cho giá trị hoạt tính caonhất là 50 U/L sau 96 h khi sử dụng hàm lượng 30 g/L Nếu sử dụng hàm lượng caohơn, độ nhớt canh trường tăng mạnh làm giảm hoạt tính enzyme thu được Điều nàycho thấy các chất cảm ứng khác, ít ảnh hưởng đến tính chất động học của môitrường, cần được thử nghiệm vì có giá thành rẻ hơn so với pectin nguyên chất

1.2.5.2 Sự ức chế dị hóa

Một số nghiên cứu cho thấy sự có mặt của pectic trong canh trường sẽ kíchứng hình thành enzym thủy phân pectic (Aguilar, 1990; Jain, 1990a, b), và bị kìmhãm khi glucose, glycerol, sucrose hoặc xylose được thêm vào môi trường

Khi gen GFP được nối với promoter endoPG, điều hòa biểu hiện endoPG cóthể kiểm tra trong bào tử nẩy mầm trên môi trường agar chứa pectin hoặc PGA nhưlà nguồn carbon chính (Akimitsua, 2004) Tuy nhiên, không kiểm tra thấy có huỳnhquang khi nấm sinh trưởng với cellulose như là nguồn carbon chính Không thấyphát huỳnh quang xanh cảm ứng trên môi trường pectin chứa 1% (w/v) glucosehoặc cao hơn, cho thấy biểu hiện endoPG được điều hòa dưới cơ chế ức chế dị hóacarbon, nghĩa là một đoạn gen bị ức chế khi có mặt của nguồn carbon dễ chuyểnhóa như là glucose Ức chế dị hóa carbon của PG nấm cũng được tìm thấy ở

Fusarium oxysporum f sp lycopersici , Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, C carbonumrace và Penicillium expansum Tương tự như các PG khác của nấm, sự

tích lũy bản sao endoPG và hoạt tính của nó cũng bị ức chế ở A.citri khi cho 1 hoặc

Để đánh giá xem sự phát triển khác nhau của A.citric trong phần pectin của

mô vỏ và trong túi dịch ép có phải là kết quả của sự ức chế dị hóa hay không,huyền phù bào tử của thể biến nạp được trải đều trên đĩa pectin hoặc PGA chứa2% (w/v) fructose hoặc sucrose (đường chính trong dịch ép citrus ở nồng độ lên đến5-10% w/v), và không thấy có biểu hiện của gen GFP trên đĩa Thí nghiệm đơngiản này cho thấy nồng độ của những đường này trong dịch ép đủ cao để ức chếbiểu hiện gen endoPG

Gen GFP được dùng làm gen chỉ thị để vạch rõ vùng chứa promoter endoPG

của A.citri với một số đoạn bị mất trong vùng ngược hướng 813bp từ vị trí bắt đầu

dịch mã Trình tự 813bp này chứa vị trí liên kết cho phần tử A ức chế dị hóa(CreA), một chất ức chế zinc finger hoạt động dạng cis liên quan trong sự ức chế dịhóa carbon Đoạn promoter endoPG khuyết vị trí liên kết với CreA với gen chỉ thịGFP được biến nạp vào nấm Cấu trúc GPDL4 bị khuyết đoạn 401 đến 81, có cảmứng cơ chất lẫn ức chế dị hóa, vẫn còn đoạn gen chứa vị trí liên kết với Cre, trongkhi PGPDL5 có cảm ứng cơ chất khuyết đoạn từ 1 đến 84, bao gồm một vị trí liênkết với Cre dẫn tới mất đi sự ức chế dị hóa Huỳnh quanh xanh của PGPDL4 đượccảm ứng bởi pectin trong vỏ nhưng bị ức chế hoàn toàn trong vùng dịch ép Tuynhiên, màu xanh phát huỳnh quang của PGPDL5 trong cả vỏ và dùng túi dịch ép,

một lần nữa cho thấy ức chế của gen endoPG A.citri trong vùng túi dịch quả là do

sự ức chế dị hóa carbon

Botella cùng cộng sự (2006) cũng cho biết khi 6% glucose được thêm vào như

là nguồn carbon, sự hình thành exo-PG của A.awamori tăng đáng kể Tuy nhiên, ở

8% glucose hoạt tính của enzym giảm Mặc dù bột nho chứa dinh dưỡng đầy đủ để

sản xuất enzym exo-PG bởi A.awamori, thêm glucose tới một nồng độ nào đó sẽ

cho hiệu quả dương tính đến tổng hợp enzym, nhưng dư thừa sẽ không tốt

Niture cùng cộng sự (2006) nghiên cứu vai trò của glucose trong sản xuất và

ức chế polygalacturonase và pectate lyase từ nấm Fusarium moniliforme NCIM

1276 Kết quả cho thấy khi tăng nồng độ glucose trong môi trường kết hợp (glucose+ pectin), sinh khối tăng từ 4,1mg/ml ở 0,1% đến 6,4mg/mL ở 1% (Bảng 16) Hoạttính PG tăng khi tăng nồng độ glucose tăng từ 0,1 đến 0,2% Tuy nhiên, ở nồng độglucose cao (0,4-1%), có sự giảm dần hoạt tính của enzym Sự hình thành PL tối đa(27,2µg/mL) cũng như hoạt tính của enzym tối đa (U/mL) khi nồng độ glucose là0,2% và giảm khi nồng độ glucose tăng Do đó sự hình thành những enzym này phụ

thuộc vào cân bằng giữa sự có mặt của cơ chất (pectin) và chất ức chế dị hóa(glucose) Kết quả tương tự cho sinh tổng hợp enzym thủy phân pectin nghiên cứu

bởi Aguilar và Huitron 1987 đối với Aspergillus Aûnh hưởng của sự thay đổi nồng

độ pectin lên sự hình thành PG và PL cho thấy 1% pectin cùng với 0,2% glucose làcần thiết để sinh tối đa cả hai enzym (0,28 U/mL cho PG và 8,1 U/mL cho PL), tráilại nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn 1% pectin đều cho kết quả không tối ưu

Bảng 1 Aûnh hưởng của glucose lên sự tạo thành PG và PL ngoại bào ở pH 5 và 8 trong môi

0.230.1 0.250.3 0.280.01 0.10.01 0.10.01 0.020.001 Not detected

3.60.12 4.00.2 8.10.4 6.20.81 4.30.44 2.00.01 1.60.1Runco cùng cộng sự (2001) nghiên cứu điều hòa sinh tổng hợp

polygalacturonase bởi A.terreus Kết quả cho thấy môi trường lên men chứa 5g/L

fructose, glucose hoặc galactose như là nguồn carbon sẽ tạo thành hàm lượng PGthấp, tương tự kết quả khi dùng glucose 5g/L cộng với nồng độ PGA khác nhau (0,1đến 0,5g/L) Hoạt tính enzym tăng ở nồng độ PGA cao và đạt được tối đa khi nấmđược sinh trưởng trong PGA 5g/L mà không có glucose (Bảng 17)

Teixeira cùng cộng sự (2000) nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự

sinh tổng hợp các loại pectinase khác nhau từ Aspergillus japonicus 586

Kết quả cho thấy hoạt tính PE tạo bởi A.japonicus nhạy với ức chế dị hóa khi

dùng 0,5% glucose hoặc 0,8% saccharose Hoạt tính enzym cao nhất trong trườnghợp này là 0,96 U/mL và 1,61 U/mL tương ứng với sau 48h và 72h

Khi có 0,2% pectin và 0,2% saccharose ở 72h, hoạt tính enzym là 3,1 U/mLcao hơn khi có mặt 0,8% pectin và 0,8% saccharose (2,5 U/mL), trong 96h Nhữnggiá trị này thấp hơn khi có mặt 0,5% pectin

PE từ A.japonicus nhạy cảm với ức chế dị hóa với nồng độ glucose và saccharose cao Trong trường hợp của A niger, không thấy có sự ức chế và Aguilar

và Huitron (1987) cho rằng tăng PE, khi glucose và sucrose có mặt ở hàm lượngthấp cùng với pectin, có lẽ là do glucose và sucrose được chuyển hóa trước khi tiêu

thụ pectin, sản sinh ra đủ nguyên liệu và năng lượng để cảm ứng sinh trưởng nhanhcủa vi sinh vật mà không có sự ức chế nào.

Bảng 2 Aûnh hưởng của nguồn carbon khác nhau lên sự hình thành PG bởi A.terreus

Nguồn carbon Hoạt tính enzym (U/mL) Độ lệch chuẩn

0.0090 0.0009 0.0014 0.0110 0.0070 0.0190 0.0170 0.0300 0.0110 0.0110Aûnh hưởng của nồng độ glucose khác nhau (0,5, 2 và 5g/L) lên hoạt tính PGđược xác định để phân biệt nó với ảnh hưởng của glucose lên sự sinh tổng hợpenzym, giá trị hoạt tính enzym tương tự (0,38 U/mL) cho cả ba mẫu Kết quả nàycho thấy sự giảm hàm lượng enzym khi tăng nồng độ ban đầu của glucose trongmôi trường lên men là do ảnh hưởng âm tính của đường lên sự sinh tổng hợpenzym Tuy nhiên, khi hàm lượng glucose có sẳn giảm do sự sinh trưởng, sự sinhtổng hợp enzym tăng (Hình 7) cho tới 96h Aûnh hưởng sâu hơn của glucose đượcnghiên cứu với nấm được thu trong giai đoạn ổn định để hạn chế ảnh hưởng củasinh trưởng Khi glucose được cho vào giai đoạn đầu của thí nghiệm, sự tạo thành

PG ngừng lại mặc dù chất cảm ứng PGA cũng có mặt Tuy nhiên, sau 6h ủ, nấmđược rửa sạch glucose và cho vào môi trường không chứa glucose, chứa PGA, sựsinh tổng hợp PG bắt đầu lại, do đó cho thấy cơ chế ức chế sinh tổng hợp PG củaglucose

Hình 2.1 Aûnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu đến sự hình thành PG Môi trường lên men

chứa 5 g/L PGA như là chất cảm ứng Nồng độ glucose g/L: 0; 2]; 5 Đường nét đứt biểu diễn tiêu thụ glucose trong quá trình lên men.

1.2.6 Quy trình sản xuất pectinase theo phương pháp lên men chìm

1.2.6.1 Sản xuất polygalacturonase bởi Aspergillus oryzae

Môi trường lỏng chứa cám lúa mì, các muối và nguồn chất cảm ứng (pectin)được thấy là thích hợp để sản xuất các enzyme exo- và endo-polygalacturonase bởi

Aspergillus oryzae CCT3940 Sự kích thích sản xuất các polygalacturonase bởi

pectin tinh khiết thì tốt hơn khi sử dụng vỏ trái cây họ citrus A oryzae phát triển tốt

ở pH khoảng 4 mặc dù pH giảm xuống giá trị 3 thì cần thiết cho sự sản xuấtenzyme Sự giảm hoạt tính tăng dần khi pH gần tới giá trị trung tính Hoạt tính caonhất thu được khi pH ban đầu bằng 4 và giảm xuống khi pH giảm xuống giá trị dưới

3 (159 đơn vị hoạt tính endo-PG/mL ở 83 h và 45 đơn vị hoạt tính exo-PG/mL ở 64h) Giá trị pH và nhiệt độ tốt nhất để sản xuất exo-PG là 4.5/57oC và endo-PG là4.3/40oC

Chủng Aspergillus niger thường được sử dụng nhất để sản xuất các enzyme

pectinase thương mại bởi vì chúng được xếp vào loại an toàn (GRAS), các enzymetách từ chúng có thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm Các chủng nấm mốc

khác sử dụng để sản xuất pectinase gồm Aspergillus oryzae, Penicillium italicum và

Penicillium expansum cũng đã được nghiên cứu Các nghiên cứu trước chỉ ra rằng

A oryzae CCT3940 cho hoạt tính enzyme endo-polygalacturonase cao hơn so với

các chủng A niger.

Các enzyme pectinase là các enzyme cảm ứng do đó cần thiết phải cung cấpvào môi trường lên men pectin hay các nguyên liệu giàu pectin như bã củ cảiđường, bả táo, bả mía hay vỏ trái cây họ citrus Các chỉ số quan trọng khác trongquá trình sản xuất pectinase là giá trị pH, nhiệt độ và nguồn oxy, các chỉ số nàyảnh hưởng mạnh đến quá trình sản xuất

Aspergillus oryzae CCT3940 được cấy trên đĩa thạch agar glycerine và ủ ở

28oC khoảng 5 ngày, sau đó giữ ở 4oC đến khi sử dụng Giống được chuẩn bị lạihàng tháng

Môi trường cám luá mì (môi trường WB) sử dụng làm môi trường cơ bản, gồm(g/L): bột cám mì, 40; citric pectin, 10; dịch chiết nấm men, 0.5; (NH4)2SO4, 5.0;

KH2PO4, 2.5; MgSO4, 0.5; FeSO4.7H2O, 6.3x10-5; ZnSO4, 6.2x10-5; MnSO4, 1.0x10-6.Chỉnh pH tới giá trị 4 trước khi tiệt trùng ở 121oC khoảng 20 phút

1.2.6.2 Sản xuất pectin lyase và pectate lyase bởi giống Debaryomyces nepalensis trong bình phản ứng sinh học.

Ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau như pH, sự khuấy trộn và sự thoáng khíđược nghiên cứu để sản xuất tối đa pectin lyase (PL) và pectate lyase (PGL) bởi

chủng giống nấm men Debaryomyces napelensis trong bình phản ứng sinh học Giá

trị pH, tốc độ khuấy trộn và sự thông khí tối ưu là 7.0, 300 rpm và 1 vvm tương ứng

Dưới điều kiện này, D napelensis sản xuất được 14,200 U/L PL, 12,000 U/L PGL

với năng suất 600 U/L.h và 500 U/L.h tương ứng

Giống D napelensis được duy trì trên đĩa thạch YEPD ở 4oC và thay giốngsau 2 tuần

Môi trường cấy giống bao gồm (g/L) dịch chiết nấm men, 10; peptone, 20;dextrose, 20 Môi trường sản xuất ezyme gồm các thành phần sau (g/L): galactose9.6, dịch chiết nấm men 19, vỏ chanh 24, Na2HPO4 6.0, K2HPO4 3.0, NaCl 5.0,MgSO4 0.1 và FeCl3 1.0

- Lên men

Điều kiện canh trường giống giống như đĩa thạch, tuổi giống cấy và phần trămgiống cấy được tối ưu hóa trước trong phòng thí nghiệm Chuyển giống từ đĩa

thạch YEPD, đã ủ khoảng 32 h trong tủ ấm ở 30 C, sang 100 mL môi trường YEPDtiệt trùng Chỉnh pH của môi trường đến giá trị 7.0 và ủ canh trường trong máy lắcquay với tốc độ 180 rpm và 30oC Canh trường giống để phát triển trong 12 h sauđó lấy 5% chuyển vào môi trường sản xuất trong bình phản ứng sinh học.

Thực hiện lên men trong bình phản ứng sinh học 2.4 L Bình phản ứng sinhhọc có thiết bị phân tích DO và chỉnh pH tự động Vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ

30oC, tốc độ khuấy 300 rpm và thông khí 1 vvm

1.2.6.3 Sản xuất enzyme pectinase kiềm và chịu nhiệt bởi Bacillus pumilus dcsr1 (D.C Sharma, 2005).

a, Chuẩn bị môi trường

Chuẩn bị 50 mL môi trường pectin-yeast extract trong erlen 250 mL với thànhthần như sau:

0.5% pectin từ vỏ chanh

2 mL/L dung dịch các chất vi lượng [0.1 g Al(OH)3, 0.5 g SnCl2.2H2O, 0.05 g

KI, 0.05 g LiCl, 0.8 g MnSO4.2H2O, 0.5 g H3BO3, 0.1 g ZnSO4.7H2O, 0.1 gNiSO4.6H2O, 0.05 BaCl2 và 0.05 g (NH4)6Mo7O24.4H2O /L)]

pH 8.0

b, Phương pháp lên men

Lên men ở 40 oC, tốc độ lắc 250 rpm trong 24 h

1.2.6.4 Sản xuất pectinase từ hoa hướng dương đã tách hạt bởi A.niger DMF 27 và DMF 45 (Sarvamangala R Patil, 2005)

a, Chuẩn bị môi trường

Cơ chất là hoa hướng dương được rửa sạch, nghiền (đến kích thước 300 m)sau đó hấp tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút

Chuẩn bị 100 mL môi trường trong erlen 250 mL với thành phần như sau (g):(NH4)2SO4 0.1;

MgSO4.·7H2O 0.5;

KH2PO4 0.5;

FeSO4·.7H2O 0.0005,

pH 5.0

Thêm 8 g (bột hoa hướng dương) để môi trường có hàm lượng pectin 2%

b, Phương pháp lên men

Cấy giống với tỷ lệ 1x105 tb/mL và lên men ở 30 oC, tốc độ lắc 250 rpm trong

72 h

Sau khi lên men, ủ ở 30 oC khoảng 96 h

1.3 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

1.3.1 Chuẩn bị môi trường

Mỗi học viên chuẩn bị 150 mL môi trường trong erlen 250 mL, thành phầnnhư sau (g/L):

- Bột vỏ bưởi (đã sấy khô) 8 (tương đđương 1 g pectin/L)

Hiệuchỉnh giá trị pH của môi trường tương ứng là 3.5, 4.0, 4.5, 5.0

Tiệt trùng môi trường: 121oC, 15 phút

1.3.2 Cấy giống