ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ và tên sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ KIM NGÂN Tên luận văn: ‘‘Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH

CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO

Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ KIM NGÂN Lớp: DH07TY

Ngành: Thú Y Niên khóa: 2007 – 2012

Tháng 08/2012

HOÀNG THỊ KIM NGÂN

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH

CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác Sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS VÕ THỊ TRÀ AN BSTY ĐẶNG THỊ XUÂN THIỆP

Tháng 08/2012

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ KIM NGÂN

Tên luận văn: ‘‘Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn

Staphylococcus aureus phân lập từ thịt heo”

Đã hoàn thành luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét, đóng góp của hội đống chấm thi tốt nghiệp khoa Chăn Nuôi – Thú Y ngày…………

Giáo viên hướng dẫn

TS VÕ THỊ TRÀ AN

LỜI CẢM TẠ

Suốt đời nhớ ơn cha mẹ

Cha mẹ đã sinh thành, cực khổ cả đời để nuôi nấng dạy dỗ và lo toan cho con

có được ngày hôm nay

Thành kính biết ơn

TS Võ Thị Trà An, BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Lời cảm ơn sâu sắc

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y – Bộ Môn Nội Dược, cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập

Chân thành cảm ơn

Các anh chị phòng Vi Sinh Thực Phẩm, Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị, Chi cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh, BSTY Lê Hữu Ngọc đã giúp đỡ, hướng dẫn, góp ý và tạo mọi điều kiện thật tốt để tôi hoàn thành đề tài

Các bạn trong phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, bạn Minh Thành, chị Tuyền, anh Mẫn, bạn Thanh Thanh, bạn Thắng, bạn Hảo…đã an ủi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực tập

TÓM TẮT

Đề tài “Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn

Staphylococcus aureus phân lập từ thịt heo” được tiến hành tại phòng Kiểm Nghiệm

Thú Sản và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi”, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 02/2012 đến tháng 06/2012

Qua phân lập 122 mẫu thịt heo chúng tôi thu được một số kết quả

Tỷ lệ nhiễm Staphylococcus aureus trong mẫu thịt heo là 43,44 %

Thực hiện kháng sinh đồ trên 53 chủng S aureus phân lập được cho thấy

S aureus có mức độ nhạy cảm cao nhất với ceftazidime, kế đến là chloramphenicol,

oxacillin với tỷ lệ lần lượt là 96,2 %, 75,5%, 45,3 %

Các kháng sinh đã bị S aureus đề kháng là ampicillin, penicillin tỷ lệ là 100

%; tiếp theo là tetracycline tỷ lệ 92,4 %; amoxicillin, cephalexin với tỷ lệ 86,8 % ; clindamycin, kanamycin với tỷ lệ đề kháng lần lượt là 79,2 %, 62,3 %

Các kháng sinh mà S aureus có tỷ lệ nhạy cảm trung gian bao gồm

ciprofloxacin, sulfamethoxazole/trimethoprim, gentamicin với tỷ lệ lần lượt là 79,3%, 73,5 %, 77,4 %

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình, sơ đồ xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về Staphylococcus 3

2.1.1 Hình thái 3

2.1.2 Tính chất 4

2.1.3 Phân loại 4

2.1.4 Các yếu tố độc lực ngoại bào 4

2.2 Giới thiệu về Staphylococcus aureus 5

2.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hóa 5

2.2.2 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố 7

2.2.3 Tính kháng thuốc kháng sinh 8

2.2.4 Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus 8

2.2.4.1 Những triệu chứng thường gặp 8

2.2.4.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm, trong đó có ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus 9

2.3 Những kiến thức cơ bản về kháng sinh 10

2.3.1 Khái niệm 10

2.3.2 Phân loại 11

2.3.2.1 Phân nhóm dựa vào cấu trúc hóa học 11

2.3.2.2 Phân loại theo cơ chế tác động 11

2.3.2.3 Phân loại dựa theo cơ chế kháng khuẩn 11

2.4 Một số kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong thú y 12

2.5 Đề kháng kháng sinh 13

2.6 Cơ chế tác động của kháng sinh và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh 16

2.6.1 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm beta - lactam và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm beta - lactam 16

2.6.2 Cơ chế tác động của các enzyme nhóm aminoglycoside và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm aminoglycoside 16

2.6.3 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm phenicol và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm phenicol 17

2.6.4 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm tetracycline và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm tetracycline 18

2.6.5 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm quinolone 18

2.6.6 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm macrolide và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm macrolide 19

2.6.7 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm diaminopyrimidine và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm diaminopyrimidine 19

2.6.8 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm sulfonamide và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm sulfonamide 20

2.7 Biện pháp hạn chế sự đề kháng 21

2.8 Biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh 21

2.9 Các phương pháp khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh 22

2.9.1 Phương pháp định tính 22

2.9.2 Phương pháp định lượng 23

2.10 Tình hình nghiên cứu về đề kháng kháng sinh của S aureus trong và ngoài nước 24

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

3.1 Thời gian và địa điểm 26

3.1.1 Thời gian 26

3.1.2 Địa điểm 26

3.1.2.1 Địa điểm lấy mẫu 26

3.1.2.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 26

3.2 Vật liệu 26

3.2.1 Đối tượng khảo sát 26

3.2.2 Môi trường, hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn 27

3.2.2.1 Môi trường 27

3.2.2.2 Hóa chất 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4 Nội dung nghiên cứu 28

3.4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Staphylococcus aureus 28

3.4.1.1 Cách lấy mẫu và thực hiện 28

3.4.1.2 Quy trình phân lập và định danh S aureus 28

3.4.2 Phương pháp kháng sinh đồ 29

3.5 Xử lý số liệu 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả phân lập S aureus từ thịt heo 32

4.2 Kết quả khảo sát mức độ nhạy cảm kháng sinh của Staphylococcus aureus 33

4.3 Kiểu đề kháng của 53 gốc vi khuẩn phân lập từ thịt heo 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 46

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHI Brain Heart Infusion Broth

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

MRSA Methicillin resisant Staphylococcus aureus

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các kháng sinh cấm sử dụng trong thú y 12

Bảng 2.2 Các kháng sinh hạn chế sử dụng trong thú y 13

Bảng 3.1 Phân bố địa điểm lấy mẫu 26

Bảng 4.1 Kết quả phân lập được S aureus 31

Bảng 4.2 Mức độ nhạy cảm với các loại kháng sinh thử nghiệm của S aureus 34

Bảng 4.3 Kiểu đề kháng của 53 gốc vi khuẩn phân lập từ thịt heo 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

TRANG

Hình 2.1 Hình thái của Staphylococcus aureus 5

Hình 3.1 Đĩa giấy tẩm các loại kháng sinh 27

Hình 4.1 Kết quả phản ứng coagulase 32

Hình 4.2 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn S aureus với 15 loại kháng sinh trên

3 đĩa petri sau 24h/370C 33

Sơ đồ 3.1 Quy trình phân lập và định danh S aureus 28

an toàn thực phẩm đã được đặt lên hàng đầu tại nhiều hội nghị y tế và sức khỏe cộng đồng toàn cầu Vì vậy, việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm đã và đang là vấn đề hết sức “nóng” của toàn xã hội

Các vụ ngộ độc thực phẩm có rất nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản chất thực phẩm chứa nhiều chất độc… Nhưng quan trọng hơn hết vẫn là từ vi sinh

vật, trong đó Staphylococcus aureus là một trong những nguyên nhân chính

Staphylococcus aureus có nguồn gốc từ thịt heo có thể là nguyên nhân gây

ngộ độc thực phẩm cho người, nếu là những chủng kháng thuốc thì có thể gây khó khăn trong điều trị bệnh cho người Vì vậy, hiểu biết về mức độ nhạy cảm với

kháng sinh của S aureus được phân lập từ thịt heo sẽ góp phần định hướng việc

dùng kháng sinh cho người chăn nuôi và là một thông tin hữu ích cho các cơ quan quản lý thực phẩm cũng như người tiêu dùng nhằm hạn chế việc lan tràn các chủng

S aureus kháng thuốc cho cộng đồng

Vì lý do trên, dưới sự hướng dẫn của TS Võ Thị Trà An, BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp, Bộ môn Nội Dược, Khoa Chăn Nuôi Thú Y và sự giúp đỡ của phòng

Vi Sinh Thực Phẩm, trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị Chi cục Thú Y Tp

Hồ Chí Minh và phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản và Môi Trường Sức Khỏe

Vật Nuôi, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá mức độ

nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn Staphylococccus aureus phân lập từ thịt

heo”.

1.2 Mục đích

Xác định sự hiện diện của các gốc S aureus được phân lập từ thịt heo

Xác định kiểu hình đề kháng kháng sinh của các gốc S aureus thu được

Kết quả của nghiên cứu sẽ góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các trường

hợp ngộ độc thực phẩm do S aureus gây ra cho con người

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về Staphylococcus

Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus

Staphylococcus là vi khuẩn gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5

micromet, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh nhân chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết Năm 1880, Alexander Ogston chứng minh được áp-xe sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm và Ogston được công nhận là người khám phá và đặt tên cho

tụ cầu – Staphylococcus vào năm 1882 Năm 1884, Rosenbach nghiêm cứu và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là Staphylococcus pyrogen aureus

(Martin và Iandolo, 2000) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006)

2.1.2 Tính chất

Staphylococcus là những vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có cả sự

trao đổi chất, hô hấp và lên men Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể

sử dụng nhiều loại carbonhidrat khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi Khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc Tryptic soy agar thường từ màu kem đến màu cam Thành tế bào chứa peptidoglycan hình thành một hàng rào cứng vững chắc xung quanh tế bào và acid teichoic giúp duy trì môi trường ion thích hợp cho

màng cytoplasma, đồng thời góp phần bảo vệ bề mặt tế bào tụ cầu Staphylococcus

có thể mọc ở nhiều điều kiện, môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở nhiệt độ 30 –

370C và pH gần trung tính Chúng kháng được với các chất tiệt trùng, độ khô nóng

và có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15 % NaCl (Martin và Iandolo, 2000) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006)

2.1.3 Phân loại

Hiện nay người ta biết được 33 loài Staphylococcus (Sandel và McKillip,

2002) nhưng có một số loài ít được quan tâm Trên phương diện gây bệnh có thể

chia Staphylococcus thành 2 nhóm: tụ cầu có men coagulase và tụ cầu không có men coagulase

Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài thường

gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính

2.1.4 Các yếu tố độc lực

Staphylococcus sản xuất một số men quan trọng góp phần tạo nên độc lực

mạnh mẽ của nhóm vi khuẩn này

 Hyaluronidase: men này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp

vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức

 Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế

bào hạt và đại thực bào

 Exfoliatine: là các men phá hủy lớp thượng bì Men này gây tổn thương da

tạo các bọng nước

kháng sinh như penicillin G, ampicillin làm cho các kháng sinh này mất tác dụng

2.2 Giới thiệu về Staphylococcus aureus

2.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hóa

Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính

chất chung nhất của Staphylococcus S aureus là những vi khuẩn hình cầu, không

di động, gram dương, đường kính 0,5 – 1,5 micromet, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu (Harvey và Gilmour, 2000) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006)

Hình 2.1 Hình thái Staphylococcus aureus

(Nguồn: Wikipedia, 2012)

S aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra

enzyme coagulase Đây được xem là tính chất đặc trưng của S aureus, là tiêu chuẩn

để phân biệt S aureus với các tụ cầu khác Có hai dạng coagulase: coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tự do” (“free”

coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào Có hai phương pháp để thực hiện

thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính và trong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định” bằng phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase “tự do” bằng phản

ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương (Collin và ctv, 1995)

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S aureus

đều nhạy cảm với novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến

15 % muối NaCl (Trần Linh Thước, 2002)

Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu,

vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn

so với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S aureus đều tạo sắc tố vàng,

nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường

có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin và ctv, 1995)

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có

màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 – 1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 – 5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân

lòng đỏ trứng của lethinase) (Baird và Lee, 1995; Sandel và McKillip, 2002)(trích

dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006) Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) (Sandel và McKillip, 2002)

Đa số các dòng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong

môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35 -

370C (Trần Linh Thước, 2002)

2.2.2 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi

tùy thuộc vào từng dòng (Bremer và ctv, 2004) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân

Hiền, 2006) S aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7 –

480C, với nhiệt độ thuận lợi là 30 – 450C; khoảng pH 4,2 – 9,3, với độ pH cực thuận

là 7 – 7,5; và trong môi trường chứa trên 15 % NaCl (Harvey và Gilmour, 2000) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006) Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60 %; nồng độ 33 – 55 %, tụ cầu vẫn phát

triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế (Đỗ Thị

Hòa, 2006) Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm

Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vât máu nóng S aureus

được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ Vi khuẩn này còn

có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn (Harvey và Gilmour, 2000) (trích dẫn bởi Phạm

Trần Xuân Hiền, 2006) Tuy nhiên, S aureus cũng khá nhạy cảm với nhiệt độ, bị

diệt ở 600C từ 2 – 50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu,

dễ bị các vi sinh vật khác ức chế (Bremer và ctv, 2004) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006)

Có 10 – 15 % dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S aureus Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S aureus cũng rất lớn do chúng phân

bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố Tụ cầu nhiễm vào thực phẩm chủ yếu do con đường chế biến và các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người Sự hiện diện với

mật độ cao của S aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình

chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó

chỉ xảy ra khi S aureus được phân lập tạo độc tố Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ

S aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc (Bennett và Lancette, 2001) (trích dẫn

bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006)

2.2.3 Tính kháng thuốc kháng sinh

Hầu hết các dòng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau Một

vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những dòng

này ngày càng tăng Những dòng MRSA (Methicillin resisant Staphylococcus

aureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh

khác Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở

Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S aureus, và người ta nghĩ rằng việc

chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiện, trong đường tiêu hóa chẳng hạn Ngoài ra,

S aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Todar, 2005)

Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới (Todar, 2005)

2.2.4 Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus

2.2.4.1 Những triệu chứng thường gặp

Staphylococcus aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ

ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau Samonella và Clostridium perfringens

(Rosec và ctv, 2002; Fueyo và ctv, 2000; Normanno và ctv, 2005) Triệu chứng thường gặp ở các vụ ngộ độc do tụ cầu là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, có hay không có tiêu chảy Ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết áp Triệu chứng ngộ độc xảy ra nhanh, từ 3 – 6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy

vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm và độ nhạy với độc

tố cũng như sức khỏe của từng người (Bremer và ctv, 2004) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006) Thường thì các triệu chứng chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn, khoảng 6 – 8 giờ (Trần Linh Thước, 2002) và hết bệnh sau 1 – 2 ngày Tuy nhiên khoảng 10 % trường hợp người bệnh bị mất nhiều nước phải nhập viện để truyền dịch (Normanno và ctv, 2004)

2.2.4.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm, trong đó có ngộ độc thực phẩm do

Staphylococcus aureus

Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu

để lại hậu quả không nhỏ Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng

Theo số liệu thống kê của Bộ Y tế, năm 2007, cả nước xảy ra 248 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.329 người mắc, trong đó 55 người tử vong So với năm 2006, tuy

số lượng tử vong giảm 3,5 % nhưng tổng số người mắc lại tăng 2,7 %

Theo thống kê của Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm, tính đến 15/12/2011, toàn quốc ghi nhận 142 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.533 người mắc, 3.562 người đi viện và 25 trường hợp tử vong Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chính là vi sinh vật 40 vụ (28,1 %), độc tố tự nhiên 38 vụ (26,8 %) Ngộ độc thực phẩm ghi nhận xảy ra tại 45/63 tỉnh/thành phố

Theo báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm năm 2011 của Chi cục VSATTP

TP.HCM cho biết vi khuẩn gây bệnh là Escherichia coli chiếm 45 %; vi khuẩn gây bệnh là Staphylococcus aureus chiếm tỷ lệ 45 %; vi khuẩn gây bệnh là Bacillus chiếm tỷ lệ 11 %; vi khuẩn gây bệnh là Clostridium perfingens chiếm tỷ lệ 11 %

Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục ATVSTP từ đầu tháng 4/2012 đến tháng 5/2012, cả nước đã xảy ra 10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập viện và đã có 4 trường hợp tử vong Phần lớn các

vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc

là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật Điển hình như vụ ngộ độc tập thể xảy ra trong một đám cưới ngày 12/4/2012 tại bản Hùn, xã Chiềng Cọ, thành phố Sơn La do

Theo WHO, mỗi năm tại Mỹ có 76.000.000 người bị ngộ độc thực phẩm, trong đó có 325.000 trường hợp phải nhập viện, tử vong 5.000 người Tại Anh, mỗi năm có 190 ca ngộ độc/1.000 dân Nhật Bản, cứ 100.000 người có 40 ca ngộ độc thực phẩm mỗi năm Tại Úc, mỗi năm có 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm

Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998 số ngộ độc thực phẩm do tụ cầu chiếm 3,1 – 11,9 % tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Ngày 17/6/1999, 21 trong tổng số 53 công nhân sau khi ăn ở căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh, trong đó có 8 trường hợp nhập viện (Miwa và ctv, 2000) (trích dẫn bởi Phạm Trần Xuân Hiền, 2006)

2.3 Những kiến thức cơ bản về kháng sinh

2.3.2 Phân loại

Theo Võ Thị Trà An (2007) có nhiều cách phân loại nhóm kháng sinh

2.3.2.1 Phân nhóm dựa vào cấu trúc hóa học

(1) Beta - lactam: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin…

(2) Aminoglycoside: streptomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin… (3) Polypeptide: colistin, bacitracin, polymycin…

(4) Tetracylin: tetracycline, oxytetracycline, chlotetracycline, doxycycline… (5) Phenicol: chloramphenicol, thiamphenicol, flofenicol…

(6) Macrolide: erythromycin, spyramycin, tylosin…

(7) Kháng sinh gần gũi với macrolide: lincomycin, virginiamycin…

(8) Sulfonamide: sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazole…

(9) Diaminopyrimidine: trimethoprim, diaveridin…

(10) Quinolone: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin…

(11) Nitrofuran: nitrofurazone, furazolidon, franltadon…

(12) Các nhóm khác: glycogpeptide, pleuromutilin, polyetherionophore…

2.3.2.2 Phân loại theo cơ chế tác động

Kháng sinh tác động lên thành tế bào vi khuẩn: bacitracin, vancomycin, penicillin…

Kháng sinh tác động lên màng tế bào chất: polymycin, colistin…

Kháng sinh tác động lên sự tổng hợp acid nucleic: quinolon, trimethoprim… Kháng sinh tác động lên quá trình tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn: tetracycline, streptomycin, erythromycin…

2.3.2.3 Phân loại dựa theo cơ chế kháng khuẩn

Nhóm kháng sinh tĩnh khuẩn: tetracyclin, marcrolide, phenicol…

Nhóm kháng sinh sát khuẩn: quinolon, aminosid, polypeptide, beta - lactam, sulfamid + diaminopyrimidin

2.4 Một số kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong thú y

Theo quy định mới nhất của Bộ NN&PT Nông thôn Việt Nam, nhiều kháng sinh thuộc các họ khác nhau đã bị cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng trong chăn nuôi thú y Chi tiết được liệt kê trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2

Bảng 2.1 Các kháng sinh cấm sử dụng trong thú y

1 chloramphenicol (Tên khác chloromycetin, chlornitromycin; laevomycin;

chlorocid, leukomycin)

2 furazolidon và dẫn xuất nhóm nitrofuran (nitrofuran, furacillin, nitrofurazon, furacin, nitrofurantoin, furoxon, orafuran, furadonin, furadantin, furaltadon,

payzone, furazolin, fitrofurmethon, nitrofuridin, nitrovin)

4 metronidazole (Tên khác: Trichomonacid, Flagyl, Klion, Avimetronid)

5 dipterex (Tên khác: Metriphonat, Trichlorphon, Neguvon, Chlorophos,

DTHP); DDVP (Tên khác Dichlorvos; Dichlorovos)

Bảng 2.2 Các kháng sinh hạn chế sử dụng trong thú y

STT Tên thuốc, hóa chất, kháng sinh

1 improvac (số ĐK: PFU-85 của nhà sản xuất Pfizer Australia Pty Limited)

nó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn Bằng chứng rõ ràng nhất là khi kiểm tra các chủng vi khuẩn thời tiền kháng sinh, các nhà khoa học không phát hiện

ra sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kỳ gen liên quan đến tình trạng đề kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn đương thời Áp lực chọn lọc đối với sự đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho động vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng trong thức ăn gia súc

Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng cho toàn xã hội

Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm hạn chế khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một

Ví dụ, Enterobacteriaceae kháng vancomycin, vi khuẩn Gram + kháng polymyxin

B Đề kháng thu nhận có thể xảy ra do đột biến nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn hoặc do vi khuẩn nhận các vật liệu di truyền (gene) liên quan đến kháng thuốc từ vi khuẩn khác Do vi khuẩn có chu kỳ phát triển từ vài giây đến vài phút nên chúng rất linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi trường sống Đề kháng do đột biến nhiễm sắc thể nhìn chung xảy ra từ từ và là một tiến trình tích lũy Một đột biến điểm có thể không dẫn đến sự đề kháng kiểu hình nhưng một đột biến điểm tiếp theo có thể làm thay đổi mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn (đề kháng với quinolone) Tần số xuất hiện đề kháng do đột biến trong phòng thí nghiệm (invitro) là khoảng 1/108 tế bào đối với streptomycin, nalidixic acid và rifampin; ở tần suất thấp hơn với erythromycin và dường như không xảy ra với vancomycin và polymycin Tuy nhiên trong thực tế lâm sàng (invivo), các kiểu đột biến này không đáng kể do hệ thống phòng vệ của cơ thể tiêu diệt đa số các chủng

vi khuẩn đề kháng dạng này

Trong khi đó, đề kháng thu nhận các gene có khả năng di chuyển thường đạt mức đề kháng cao và thuộc dạng “tất cả hoặc không có gì” (all or none) Gene kháng thuốc truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận có thể hiện kiểu hình (all) hoặc không thể hiện được tính trạng kháng thuốc (none) ở vi khuẩn nhận Đề kháng

do trao đổi thông tin di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự lan tràn đề kháng với kháng sinh Do vi khuẩn không có màng nhân, gene kháng thuốc có khả năng di chuyển dễ dàng hơn từ chromosome đến các vật liệu di truyền khác trong tế bào như plasmid Giữa các vi khuẩn khác nhau, gene kháng thuốc có thể được trao đổi

qua 3 cách: (1) Tải nạp là quá trình DNA được thực khuẩn thể (phage) sát nhập và chuyển cho một vi khuẩn khác; (2) Biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng (transformation) là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ một đoạn tế bào

vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm sắc thể (crossover); (3) Tiếp hợp (conjugation) là quá trình tế bào vi khuẩn cho (donor) tổng hợp lông giới tính (sex pili) và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận (recipient) Từ cầu nối này một bản sao (copy) gen kháng thuốc nằm trên plasmid được chuyển cho vi khuẩn nhận Trong quá trình tải nạp, vi khuẩn cần có điểm tiếp nhận phù hợp với phage trên bề mặt của chúng Trong quá trình biến đổi, DNA phải chèn vào đoạn gen nhờ tương đồng về di truyền Như vậy, với

cả hai tiến trình này vi khuẩn phải tương đồng về di truyền để sự tái tổ hợp có thể xảy ra Dạng trao đổi này chỉ có thể xảy ra ở các loài vi khuẩn có mối liên hệ về di truyền Trong khi đó, tiến trình tiếp hợp không có giới hạn này

Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn được nghiên cứu và ghi nhận với các

cơ chế chủ yếu sau: (1) sản xuất enzyme làm vô hoạt kháng sinh; (2) tạo ra enzyme thay thế cho enzyme mà kháng sinh tác động vào; (3) đột biến ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; (4) sửa đổi điểm tiếp nhận để giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; (5) giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào

vi khuẩn; (6) đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào giảm; (7) tạo quá nhiều điểm gắn kết kháng sinh

Dường như chúng ta không thể hoàn toàn loại bỏ được hiện tượng đề kháng với kháng sinh một khi chúng xuất hiện Ngoài sự linh hoạt do đặc tính sinh học, vi khuẩn còn có khả năng bảo tồn sự đề kháng một khi gene kháng thuốc nằm trên nhiễm sắc thể của nó Ngược lại khi yếu tố di truyền liên quan đến đề kháng nằm trên plasmid, nhất là plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác cùng loài hay khác loài Từ đó, sự kháng kháng sinh gia tăng dần lên trong quần thể vi khuẩn (Võ Thị Trà An, 2007)

Các penicillin ức chế sự tổng hợp của thành tế bào vi khuẩn bằng cách can

thiệp vào các enzyme transpeptidase (transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên

kết của chuỗi peptidoglycan) Các enzyme này liên kết với một nhóm protein gọi là PBP (penicillin - binding protein) nằm ở ngoài màng sinh chất Vì vậy điểm tác động của các kháng sinh nhóm beta – lactam là PBP Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào (pH môi trường hơi acid gia tăng khả năng này) và

khả năng kháng các enzyme β-lactamase Ngoài ra beta – lactam không chỉ ức chế

những kết nối cuối cùng của peptidoglycan trong tổng hợp thành tế bào mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản ứng tự ly giải hay tự sát của vi khuẩn do hư hại peptidoglycan Mặc dù cho tới nay cơ chế tác động của penicillin chưa hoàn toàn được làm sáng tỏ, nhưng người ta biết rằng các penicillin khác nhau sẽ tác động lên các enzyme khác nhau của quá trình tổng hợp tế bào Điều này giải thích một phần

lý do tại sao một số penicillin khác thì không hoặc ít có khả năng này Các vi khuẩn khác nhau có các PBP khác nhau và khả năng gắn kết giữa các penicillin với các PBP cũng khác nhau (Võ Thị Trà An, 2007)

Sự đề kháng với các kháng sinh của nhóm beta – lactam chủ yếu là do sự

hiện diện của enzyme β-lactamase làm hư hỏng vòng lactam hoặc sự hiện diện của

các enzyme thay thế nhóm PBP của vi khuẩn mà penicillin không gắn kết được

2.6.2 Cơ chế tác động của các enzyme nhóm aminoglycoside và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm aminoglycoside

Muốn tác động đến vi khuẩn trước hết, trước hết aminoglycoside phải xâm nhập vào tế bào vi khuẩn Tiến trình này chủ yếu là quá trình vận chuyển tích cực cần năng lượng và oxy Điều này giải thích một số đặc tính liên quan đến phổ tác động và đặc tính dược động học của các kháng sinh nhóm này (vi khuẩn kỵ khí

không nhạy cảm với kháng sinh; tại những mô có nồng độ oxy thấp thì kháng sinh khó tác dụng; Ca2+ và Mg2+ cạnh tranh vị trí gắn kết trong quá trình vận chuyển; pH kiềm gia tăng quá trình vận chuyển…) Sau khi vào trong tế bào, aminoglycoside gắn chủ yếu vào tiểu thể 30S của ribosome, chúng có thể gây ngừng quá trình tổng hợp của protein hoặc gây đọc sai mã di truyền và tạo ra những protein không hoàn chỉnh hoặc những protein không có chức năng Khác với các kháng sinh tác động lên tiến trình tổng hợp protein, aminoglycoside có tác động sát khuẩn nhanh (trừ spectinomycin) và phụ thuộc vào nồng độ

Hiện nay có ba cơ chế liên quan đến sự đề kháng kháng sinh của nhóm aminoglycoside: thứ nhất là cơ chế vô hoạt kháng sinh bởi các enzyme; cơ chế thứ hai là sửa đổi ribosome do đột biến (single - step mutation) ở protein S12 của tiểu đơn vị 30S và thứ ba là giảm sự thẩm thấu kháng sinh vào tế bào Trong đó sự vô hoạt kháng sinh bởi các enzyme giữ vai trò quan trọng nhất Vi khuẩn có mang yếu

tố đề kháng này có thể đề kháng với một hoặc vài kháng sinh nhóm aminoglycoside (Võ Thị Trà An, 2007)

2.6.3 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm phenicol và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm phenicol

Các kháng sinh nhóm phenicol có tác dụng tĩnh khuẩn do ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn Chúng gắn kết các tiểu đơn vị 50S của ribosome tế bào vi khuẩn và cản trở tiến trình hình thành các chuỗi peptide do phong bế tác động của

enzyme peptidyltransferase Tác động này cũng được ghi nhận đối với tế bào tủy

xương của động vật hữu nhũ

Sự đề kháng với chloramphenicol chủ yếu là do sự bất hoạt kháng sinh với

enzyme acetyltransferase Enzyme này được mã hóa bởi gene cat (chloramphenicol

acetyltransferase) và có khả năng acetyl hóa 2 nhóm hydroxyl của

chloramphenicol Ở vi khuẩn G-, đề kháng với chloramphenicol còn do đột biến ở chromosome dẫn đến giảm khả năng thẩm thấm của kháng sinh này qua màng tế bào Sự đề kháng thông qua cơ chế giảm thể hiện porine màng OmpA và OmpC

Có hai cơ chế chính dẫn đến đề kháng thu được với kháng sinh nhóm tetracycline ở vi khuẩn Cơ chế thứ nhất là thông qua hệ số bơm thoát dòng (Tet A,

B, C, D, E, H, G…), có nghĩa là chuyển kháng sinh từ trong tế bào ra bên ngoài làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào chất của vi khuẩn Cơ chế thứ hai là thông qua các protein có khả năng bảo vệ ribosome (Tet O, M, Q, X…) từ đó kháng sinh không gắn kết được Các nhân tố đề kháng với tetracycline bằng hai cơ chế này đã được phát hiện ở cả vi khuẩn G+ và G- Các nhân tố đề kháng với tetracycline hiện diện ở cả chromosome và plasmid của vi khuẩn (Võ Thị Trà An, 2007)

2.6.5 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm quinolone

Cơ chế tác động của nhóm quinolone chưa được biết rõ Tuy nhiên cơ chế dẫn đến sự đề kháng của vi khuẩn quinolone là sự thay đổi do đột biến điểm tại các

gene mã hóa cho enzyme AND gyrase (gyr A, gyr B) hoặc topoisomerase IV (par C,

par E, hay gyr A, gyr B) dẫn đến giảm gắn kết của kháng sinh với enzyme Cơ chế

này gặp ở cả vi khuẩn G-, G+, và Mycoplasma spp Những thay đổi ở thành tế bào

vi khuẩn G- dẫn đến giảm hấp thu kháng sinh vào trong tế bào vi khuẩn cũng dẫn đến đề kháng với quinolone Hiện chưa phát hiện cơ chế này ở vi khuẩn G+ Ngoài

ra cơ chế đề kháng thông qua bơm thoát dòng (effux pump) đã được ghi nhận ở

Staphylococcus aureus với gene norA mã hóa bơm thoát dòng nhiều loại thuốc hoặc