LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU BẰNG KỸ THUẬT PCR

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 122009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ….W U X…. ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU BẰNG KỸ THUẬT PCR Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 122009 ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Đoàn Thị Tuyết Lê sinh ngày 17 tháng 1 năm 1983 tại huyện Phù Cát tỉnh Bình Định. Con Ông Đoàn Văn Trọng và Bà Lê Thị Mỹ Oanh. Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Quốc Học Quy Nhơn, tỉnh Bình Định năm 2001 Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ sinh học hệ chính quy tại Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chi Minh. Tình trạng gia đình: kết hôn Địa chỉ liên lạc: 214B Nguyễn Ái Quốc phường Tân Hiệp – thành phố Biên Hòa – tỉnh Đồng Nai. Điện thoại: 0918916861 Email: tuyetledtyahoo.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Đoàn Thị Tuyết Lê iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. TS. Hồ Thị Kim Hoa, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL. TP. HCM. Tập thể cán bộ Phòng Đào Tạo Sau Đại Học trường ĐHNL. TP. HCM. Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trường ĐHNL. TP. HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành luận văn. Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn Đoàn Thị Tuyết Lê v TÓM TẮT Đề tài “Phân biệt các loại thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà bằng kỹ thuật PCR” được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM từ ngày 142008 đến ngày 182009. Mục tiêu nghiên cứu là: hoàn thiện quy trình mPCR phân biệt các loại thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu sử dụng primer thiết kế bởi Matsunaga ctv (1999); xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu, thịt bò sử dụng primer tự thiết kế; ứng dụng quy trình mPCR, PCRtrâu và PCRbò để phát hiện 6 loại thịt trên đối với hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt, có có xử lý nhiệt và mẫu bột thịt trên thị trường nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc. Kết quả đạt được như sau: Đã tối ưu phản ứng mPCR phát hiện thịt heo, gà, dê, cừu, bò lẫn trâu sử dụng các primer được thiết kế bởi Matsunaga ctv (1999). Tỷ lệ thích hợp cho các primer FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP là 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol. Quy trình này có thể áp dụng cho thịt tươi, thịt xử lý nhiệt ở nhiệt độ 80oC15’; 120oC15’; 120oC30’; 130oC15’; 130oC30’, 180oC15’. Ảnh hưởng của tỷ lệ DNA hiện diện trong các hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt lên khả năng phát hiện của mPCR cũng được xác định. Đối với hỗn hợp DNA 6 loài có tỷ lệ bằng nhau, nồng độ DNA thấp nhất mà mPCR phát hiện gà là 0,0001 ngμl, heo là 0,00025 ngμl, cừu, dê, trâubò là 0,0025 ngμl. Còn đối với hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu, tỷ lệ thấp nhất mà mPCR có thể phát hiện trâubò, dê là 0,1%, cừu là 1%. Tỷ lệ giống nhau giữa hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ảnh hưởng như nhau đến khả năng phát hiện của mPCR. MPCR không phát hiện được thịt trâubò, dê, cừu với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 130oC30’. Quy trình mPCR sử dụng primer thiết kế bởi Matsunaga ctv (1999) chưa phân biệt được thịt bò với thịt trâu nên đề tài tiếp tục xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu và thịt bò với các primer tự thiết kế. Các primer được thiết kế dựa vào vùng giống và khác nhau của gen cytochrome b của thịt bò, trâu và các loài khác. Quy trình PCR phát hiện thịt trâu với forward primer và reverse primer có trình tự như sau 5’ CTACACATCCGA CACAACAACAGC3’, 5’ ATGTAGCAGGGGCAT GAGAA3’. Mẫu DNA được biến tính ở 94oC trong 4 phút sau đó được khuếch đại qua 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 94oC1’, ủ bắt cặp ở 56oC 45’’, kéo dài ở 72oC1’ và kết thúc ở 72oC5’. Nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCRtrâu có thể phát hiện là vi 0,001 ngμl. Tỷ lệ DNA thịt trâu thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCRtrâu có thể phát hiện là 0,1%. Tỷ lệ thịt trâu thấp nhất mà PCRtrâu có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1%. Quy trình PCRtrâu có khả năng phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80oC15’, 120oC15’, 130oC15’, 180oC15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt trâu với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC30’ và 130oC30’. Quy trình PCR phát hiện thịt bò với forward primer là 5’CTACACATCCGA CACAACAACAGC3’, reverse primer là 5’TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC 3’. Quy trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94oC4’; 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC1’, bắt cặp ở 54oC 45’’, kéo dài ở 72oC1’; kéo dài cuối cùng ở 72oC5’. Nồng độ DNA bò thấp nhất mà PCRbò có thể phát hiện là 0,001 ngμl. Tỷ lệ DNA bò thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCRbò có thể phát hiện là 0,05%. Tỷ lệ thịt bò thấp nhất mà PCRbò có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1%. PCRbò có khả năng phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80oC15’, 180oC15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt bò với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC15’, 120oC30’, 130oC15’ và 130oC30’. vii SUMMARY Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle, goat, sheep, pig, and chicken by PCR techniques” was carried out at Institute of Biotechnology Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from April 1, 2008 to August 1, 2009. The project was aimed: (i) to optimize the mPCR reaction used for differentiation of commercially available meat including lamb, beef andor buffalo meat, chicken, pork and goat meat using primers designed by Matsunaga et al (1998); (ii) to establish PCR reactions for identification of beef and buffalo meat; (iii) consequently, to apply these reactions in identification of meat species in raw and processed meat mixtures. The results were summarized as follows: The optimal mPCR condition for detection of the meat species was confirmed, in which the proportion of primers for identification of pork, lamb, beef, chicken, goat meat, and buffalo was 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol (FSIM: RG: RCH: RCB: RS: RP), respectively. This protocol could be applied to fresh meat and meat that had been processed at 80oC15; 120oC15; 120oC30 ; 130oC15; 130oC30, and 180oC15. The effect of the amount of DNA template from different meat species in the reaction was also investigated. For DNA mixture involving the six meat species with equal ratio, the lowest concentration for detection of DNA was 0.0001 ngμl in chicken, 0.00025 ngμl in pork, 0.0025 ngμl in lamb, goat, buffalo andor cattle . In the mixture with reduced DNA concentrations from lamb, cattle and goat meat, the lowest rate of DNA that can be detected in was 0.1% in buffalo meat andor beef, 0,1% in goat meat and 1% in lamb. The mPCR protocol didn’t differentiate between beef and buffalo meat exactly. So, the reseach continued to build PCR protocols detecting buffalo meat and beef with selfdesigned primer. The primers was designed based on similar and different regions of cytochrome b genes of cattle, buffalo and other species. PCR protocol for detection of buffalo meat (buffaloPCR) using specific primers was accomplished. A new set of primers for buffalo meat were designed and tested (Forward primer, 5CTACACATCCGACACAACAACAGC3 and reverse primer, 5ATGTAGCAGGGGCATGAGAA3). Amplification reaction was started with predenaturation step at 94oC4, followed by 35 cycles including 94oC1, 56oC45, viii 72oC1’ and final extension at 72oC5. The lowest concentration of buffalo DNA that could be detected by buffaloPCR was 0.001 ngμl. The lowest rate of buffalo DNA in the DNA mixture reduced ratio of DNA from raw meat of buffalo, cattle, goat, sheep that buffaloPCR could detect was 0.1%, which is the same as the lowest rate of buffalo meat that buffaloPCR could detect in the meat mixture with reduced ratio of buffalo, beef, goat, sheep. The PCR was successfully applied to detect buffalo meat in mixtures having been processed at 80oC15’, 120oC15’, 130oC15’, 180oC15’ but was not in the case of meat mixtures that had ≤ 10% buffalo meat and had been heated at 120oC30’ and 130oC30’. PCR protocol for detection of beef (cattlePCR) was set up. The new set of primers for the PCR to detect beef were: forward primer, 5CTACACATCCGACAC AACAACAGC3’, and reverse primer, 5TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC3. The thermal process was as follows: 94oC4 for initial denaturation, 35 cycles of denaturation at 94oC1’, annealing at 54oC45, enlongation at 72oC1’ and final extension at 72oC5’. The cattlePCR could detect cattle DNA with the concentration as low as 0.001 ngμl. The lowest rate of cattle DNA in the mixture reduced ratio of DNA from the raw meat of the buffalo, cattle, goat, sheep that cattlePCR could detect was 0.05%. The lowest rate of cattle meat that cattlePCR could detect in the reduced ratio mixture of buffalo, goats, sheep meat was 0.1%. This PCR protocol was successfully to detect beef in meat mixtures which was processed at 80oC15, 180oC15 but was not to identify the meat in those had ≤ 10% buffalo meat and had been processed at 120oC15’, 120oC30’, 130oC15’, and 130oC30’. ix MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang Chuẩn Y ................................................................................................................. i LÝ LỊCH CÁ NHÂN ....................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv TÓM TẮT ........................................................................................................................ v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ xv DANH SÁCH SƠ ĐỒ ..................................................................................................xvi DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... xvii Chương 1 .........................................................................................................................1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu ................................................................................................................ 2 1.3 Mục đích ................................................................................................................ 2 Chương 2 .........................................................................................................................3 TỔNG QUAN.................................................................................................................. 3 2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến ............................................................................. 3 2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt ................................................................................ 3 2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến .................................................................. 4 2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam ................... 5 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới ........................................................................................................................ 5 2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam ...................................................................................................................... 5 2.2. Các phương pháp phát hiện thịt ............................................................................ 6 2.2.1 Phương pháp dựa vào protein ......................................................................... 6 2.2.1.1 Phương pháp điện di ................................................................................. 6 2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch ............................................................................ 8 2.2.1.3. Phương pháp sắc ký ................................................................................. 9 2.2.2. Phương pháp dựa vào DNA ........................................................................... 9 2.2.2.1 Phương pháp lai DNA .............................................................................. 9 2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR .................................................................... 11 2.3 Thiết kế primer ..................................................................................................... 21 2.3.1 Tổng quan về thiết kế primer ........................................................................ 21 2.3.1.1 Giới thiệu ................................................................................................ 21 2.3.1.2 Các đặc điểm của primer ........................................................................ 21 2.3.1.3 Nguyên tắc chung của thiết kế primer .................................................... 23 2.3.2 FastPCR......................................................................................................... 24 2.4 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài ................................ 24 2.4.1 DNA ty thể .................................................................................................... 24 2.4.2 Di truyền của ty thể....................................................................................... 28 2.4.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản phẩm thịt chế biến .................................................................................................. 28 x 2.5 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng phương pháp PCR và multiplex PCR ........................................................................ 29 Chương 3 ....................................................................................................................... 33 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 33 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành .......................................................................... 33 3.2 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 33 3.3 Vật liệu ................................................................................................................. 33 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA .......................................................................... 33 3.3.2 Primer ............................................................................................................ 34 3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ......................................................................... 34 3.4 Phương pháp tiến hành ........................................................................................ 35 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu .................................................................................... 35 3.4.2 Tách chiết DNA ............................................................................................ 35 3.4.3 Điều chỉnh quy trình mPCR phát hiện thịt có nguồn gốc từ heo, gà, dê, cừu, bò vàhoặc trâu ......................................................................................... 36 3.4.3.1 Phát hiện từng loại thịt bằng các phản ứng PCR đơn ............................. 36 3.4.3.2 Thiết lập và tối ưu hóa quy trình mPCR ............................................... 36 3.4.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của mPCR .............. 37 3.4.4 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò ............................. 38 3.4.4.1 Thiết kế primer ....................................................................................... 38 3.4.4.3 Kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer FRB, FRC .......... 39 3.4.5 Xác định quy trình PCR trâu và PCRbò ..................................................... 40 3.4.6 Ứng dụng mPCR, PCRtrâu, PCRbò để phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà ............................................................................................................ 40 3.4.6.1 Ứng dụng mPCR ................................................................................... 40 a. Xác định giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của mPCR ............................................................................................................ 40 b.Thực hiện mPCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ....................................................................... 41 c. Thực hiện mPCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ................................................. 41 d. Thực hiện mPCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ............................................................ 42 e. Thực hiện mPCR với bột thịt trên thị trường ............................................ 42 3.4.6.2 Ứng dụng PCRtrâu ................................................................................ 42 a. Xác định giới hạn phát hiện của PCRtrâu ................................................. 42 b. PCRtrâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .............................................................................................. 42 c. PCRtrâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ....................................................................................................... 42 d. PCRtrâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ................................................................................................................ 42 e. PCRtrâu với bột thịt trên thị trường ........................................................... 42 3.4.8.3 Ứng dụng PCRbò .................................................................................. 44 a. Xác định giới hạn phát hiện của PCRbò .................................................... 44 b. PCRbò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .............................................................................................. 44 xi c. PCRbò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ............................................................................................................ 44 d. PCRbò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ...................... 44 e. PCRbò với bột thịt trên thị trường ............................................................. 44 Chương 4 ....................................................................................................................... 46 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................................. 46 4.1 Điều chỉnh quy trình mPCR ............................................................................... 46 4.1.1 PCR phát hiện từng loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu ................................. 46 4.1.2 Quá trình thiết lập và tối ưu hóa mPCR ...................................................... 47 4.1.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của mPCR ..................... 49 4.2 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò .......................... 50 4.3 Kết quả kiểm tra lý thuyết độ đặc hiệu các cặp primer FRB, FRC ............... 50 4.3.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR ................................................................. 50 4.3.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W .................................................................. 51 4.3.3 Kết quả BLAST ............................................................................................ 51 4.4 Kết quả kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer FRB, FRC ........... 51 4.4.1 Bằng PCR ...................................................................................................... 51 4.4.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B .................................................. 52 4.4.1.2 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C và D .................................................. 52 4.4.1.3 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E và F ................................................... 52 4.4.1.4 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G và H .................................................. 53 4.4.1.5 Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2RBU2 và F2RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua ......................................... 55 4.4.2 Giải trình tự sản phẩm PCR của cặp FRB; FRC đặc hiệu ...................... 55 4.4.3 Xác nhận sản phẩm khuếch đại là của thịt trâu và bò ................................... 56 4.4.3.1 BLAST ................................................................................................... 56 4.4.3.2 Gởi mã số lên NCBI cho trình tự đoạn DNA của thịt trâu và bò ........... 56 4.5 Xác định quy trình PCRtrâu ............................................................................... 57 4.6 Xác định quy trình PCRbò ................................................................................. 57 4.7 Ứng dụng mPCR, PCRtrâu và PCRbò phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà ........................................................................................................................ 57 4.7.1 Ứng dụng mPCR .......................................................................................... 57 4.7.1.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA mỗi loài có thể phát hiện được của mPCR .......................................................................................................... 57 4.7.1.2 MPCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .......................................................................................................... 58 4.7.1.3 MPCR phát hiện thịt heo, gà, trâubò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ......................................................................................... 59 4.7.1.4 MPCR phát hiện thịt heo, gà, trâubò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt .................................................................................................... 60 a. Kết quả phát hiện thịt heo, gà, trâubò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý ............................................................................................ 61 b. Kết quả so sánh mPCR với thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt ở cùng nhóm tỷ lệ phối trộn ......................................................... 64 4.7.1.5 MPCR với bột thịt trên thị trường ......................................................... 67 4.7.2 Ứng dụng PCRtrâu ...................................................................................... 68 4.7.2.1 Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCRtrâu ......... 68 xii 4.7.2.2 PCRtrâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .......................................................................................................... 68 4.7.2.3 PCRtrâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .................................................................................................................... 69 4.7.2.4 PCRtrâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ............. 69 4.7.2.5 PCRtrâu với bột thịt trên thị trường ...................................................... 71 4.7.3 Ứng dụng PCRbò ......................................................................................... 71 4.7.3.1 Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCRbò ............. 71 4.7.3.2 PCRbò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .......................................................................................................... 72 4.7.3.3 PCRbò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ...... 72 4.7.3.4 PCRbò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ................. 73 4.7.2.5 PCRbò với bột thịt trên thị trường ........................................................ 75 Chương 5 ....................................................................................................................... 76 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................... 76 5.1 Kết luận ................................................................................................................ 76 5.2 Đề nghị................................................................................................................. 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 78 xiii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST : Basic Local Alignment Search Tool BSE : bovine spongiform encephalophathy F : forward primer chung cho bò và trâu tự thiết kế ( gồm F1 và F2) FSIM : forward primer SIM (kí hiệu của forward primer chung của mPCR) GC : gas chromatography HPLC : high performance liquid chromatography IEF : isoelectric focusing LC : liquid chromatography LTRs : long terminal repeats mPCR : multiplex polymerase reaction chain MTATP6 : mitochondrially encoded ATP synthase 6 mtDNA : mitochondrial deoxyribonucleic acid MTND1 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1 MTND4 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4 MTND4L : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L MTND5 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 5 MTND6 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6 MTRNR1 : mitochondrially encoded 12S RNA MTTH : mitochondrially encoded tRNA histidine MTTL1 : mitochondrially encoded tRNA leucine 1 (UUAG) MTTS1 : mitochondrially encoded tRNA serine 1 (UCN) MTTV : mitochondrially encoded tRNA valine NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide PCR : polymerase chain reaction Prion : proteinaceous infectious particle RBU : reverse primer buffalo (gọi chung cho RBU1 và RBU2 tự thiết kế) RC : reverse primer cattle (gọi chung cho RC1 và RC2 tự thiết kế) RCB : reverse primer cattle buffalo (theo Matsunaga ctv, 1999) RCh : reverse primer chicken RG : reverse primer goat xiv RP HPLC : reverse phase high performance liquid chromatography RP : reverse primer pig RS : reverse primer sheep SSRs : simple sequence repeats xv DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA ...................................... 10 Hình 2.2: Genome của ty thể......................................................................................... 27 Hình 4.1: Sản phẩm PCR riêng lẻ của heo, cừu, bò, gà, dê .......................................... 46 Hình 4.2: Sản phẩm PCR của thịt bò và trâu ................................................................. 47 Hình 4.3: Kết quả mPCR theo PCR riêng lẻ................................................................ 48 Hình 4.4: Kết quả tối ưu mPCR ................................................................................... 48 Hình 4.5: Kết quả thí nghiệm khẳng định mPCR phát hiện thịt trâu ........................... 49 Hình 4.6: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A (F1RBU1) và B (F1RBU2) .................. 53 Hình 4.7: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C (F1RC1) và D (F1RC2) ........................ 53 Hình 4.8: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E (F2RBU1)và F (F2RBU2) .................... 54 Hình 4.9: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G ((F2RC1) và H (F2RC2) ...................... 54 Hình 4.10: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2 RBU2 (Ta=56oC) .................................. 54 Hình 4.11: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2RBU2 và F2RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua ................................................. 55 Hình 4.12: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của mPCR ........................ 57 Hình 4.13: Kết quả mPCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ................................................................................................... 59 Hình 4.14: MPCR phát hiện thịt heo, gà, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ......................................................................................................... 60 Hình 4.15: MPCR phát hiện thịt heo, gà, trâubò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC15’(M2.1M2.7) và 120oC15’ (M3.1M3.7) .................... 63 Hình 4.16: MPCR phát hiện thịt heo, gà, trâubò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120oC30’(M4.1M4.7) và 130oC15’ (M5.1M5.7) .................. 63 Hình 4.17: MPCR phát hiện thịt heo, gà, trâubò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC30’(M6.1M6.7) và 180oC15’ (M7.1M7.7) .................. 63 Hình 4.18: Kết quả mPCR với bột thịt trên thị trường ................................................ 67 Hình 4.19: Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCRtrâu .............. 68 Hình 4.20: PCRtrâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ............................................................................................................... 68 Hình 4.21: PCRtrâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ....... 69 Hình 4.22: PCRtrâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC15’(M2.1M2.7) và 180oC15’ (M7.1M7.7) ..................................... 70 Hình 4.23: PCRtrâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC30’(M6.1M6.7) và 120oC15’ (M3.1M3.7)................................... 70 Hình 4.24: PCRtrâu phát hiện thịt trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC15’(M5.1M5.7) và 120oC30’ (M4.1M4.7)................................... 70 Hình 4.25: PCRtrâu với bột thịt ................................................................................... 71 Hình 4.26: Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCRbò .................. 71 Hình 4.27: PCRbò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ............................................................................................................... 72 Hình 4.28: PCRbò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ........... 73 Hình 4.29: PCRbò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC15’(M2.1M2.7) và 120oC15’ (M3.1M3.7) ..................................... 74 Hình 4.30: PCRbò phát hiện thịt bòtrong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120oC30’(M4.1M4.7) và 130oC15’ (M5.1M5.7)................................... 7

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….W U X…

ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU

BẰNG KỸ THUẬT PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….W U X…

ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU

Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chi Minh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đoàn Thị Tuyết Lê

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:

* PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

* Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ nhiệm

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học

* TS Hồ Thị Kim Hoa, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL TP HCM

* Tập thể cán bộ Phòng Đào Tạo Sau Đại Học trường ĐHNL TP HCM

* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - trường ĐHNL TP HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành luận văn

* Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn Đoàn Thị Tuyết Lê

TÓM TẮT

Đề tài “Phân biệt các loại thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà bằng kỹ thuật PCR”

được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP HCM từ ngày 1/4/2008 đến ngày 1/8/2009 Mục tiêu nghiên cứu là: hoàn thiện quy trình m-PCR phân biệt các loại thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu sử dụng primer thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999); xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu, thịt bò sử dụng primer tự thiết kế; ứng dụng quy trình m-PCR, PCR-trâu và PCR-

bò để phát hiện 6 loại thịt trên đối với hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt,

có có xử lý nhiệt và mẫu bột thịt trên thị trường nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc Kết quả đạt được như sau:

Đã tối ưu phản ứng m-PCR phát hiện thịt heo, gà, dê, cừu, bò lẫn trâu sử dụng các primer được thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999) Tỷ lệ thích hợp cho các primer FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP là 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol Quy trình này có thể áp dụng cho thịt tươi, thịt xử lý nhiệt ở nhiệt độ 80oC/15’; 120oC/15’; 120oC/30’; 130oC/15’;

130oC/30’, 180oC/15’ Ảnh hưởng của tỷ lệ DNA hiện diện trong các hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt lên khả năng phát hiện của m-PCR cũng được xác định Đối với hỗn hợp DNA 6 loài có tỷ lệ bằng nhau, nồng độ DNA thấp nhất mà m-PCR phát hiện gà là

0,0001 ng/μl, heo là 0,00025 ng/μl, cừu, dê, trâu/&bò là 0,0025 ng/μl Còn đối với hỗn

hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu, tỷ lệ thấp nhất mà m-PCR có thể phát hiện trâu/&bò, dê là 0,1%, cừu là 1% Tỷ lệ giống nhau giữa hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ảnh hưởng như nhau đến khả năng phát hiện của m-PCR M-PCR không phát hiện được thịt trâu/&bò, dê, cừu với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 130oC/30’

Quy trình m-PCR sử dụng primer thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999) chưa phân biệt được thịt bò với thịt trâu nên đề tài tiếp tục xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu và thịt bò với các primer tự thiết kế Các primer được thiết kế dựa vào vùng giống

và khác nhau của gen cytochrome b của thịt bò, trâu và các loài khác

Quy trình PCR phát hiện thịt trâu với forward primer và reverse primer có trình

tự như sau 5’- CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, 5’- ATGTAGCAGGGGCAT GAGAA-3’ Mẫu DNA được biến tính ở 94oC trong 4 phút sau đó được khuếch đại qua 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 94oC/1’, ủ bắt cặp ở 56oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’ và kết thúc ở 72oC/5’ Nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện là

0,001 ng/μl Tỷ lệ DNA thịt trâu thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò,

dê, cừu mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,1% Tỷ lệ thịt trâu thấp nhất mà PCR-trâu

có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1% Quy trình PCR-trâu có khả năng phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80oC/15’,

120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt trâu với tỷ lệ

≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/30’ và 130oC/30’

Quy trình PCR phát hiện thịt bò với forward primer là 5’-CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, reverse primer là 5’-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC -3’ Quy trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94oC/4’; 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp

ở 54oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’; kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’ Nồng độ DNA bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,001 ng/μl Tỷ lệ DNA bò thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,05% Tỷ lệ thịt bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò,

dê, cừu là 0,1% PCR-bò có khả năng phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý ở

80oC/15’, 180oC/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt bò với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’ và 130oC/30’

SUMMARY Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle, goat, sheep, pig, and chicken by PCR techniques” was carried out at Institute of

Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from April 1,

2008 to August 1, 2009 The project was aimed: (i) to optimize the m-PCR reaction used for differentiation of commercially available meat including lamb, beef and/or buffalo meat, chicken, pork and goat meat using primers designed by Matsunaga & et

al (1998); (ii) to establish PCR reactions for identification of beef and buffalo meat; (iii) consequently, to apply these reactions in identification of meat species in raw and processed meat mixtures

The results were summarized as follows:

The optimal m-PCR condition for detection of the meat species was confirmed,

in which the proportion of primers for identification of pork, lamb, beef, chicken, goat meat, and buffalo was 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol (FSIM: RG: RCH: RCB: RS: RP), respectively This protocol could be applied to fresh meat and meat that had been processed at 80oC/15; 120oC/15'; 120oC/30 '; 130oC/15'; 130oC/30', and 180oC/15' The effect of the amount of DNA template from different meat species in the reaction was also investigated For DNA mixture involving the six meat species with equal ratio, the lowest concentration for detection of DNA was 0.0001 ng/μl in chicken, 0.00025 ng/μl in pork, 0.0025 ng/μl in lamb, goat, buffalo and/or cattle In the mixture with reduced DNA concentrations from lamb, cattle and goat meat, the lowest rate of DNA that can be detected in was 0.1% in buffalo meat and/or beef, 0,1% in goat meat and 1% in lamb

The m-PCR protocol didn’t differentiate between beef and buffalo meat exactly

So, the reseach continued to build PCR protocols detecting buffalo meat and beef with self-designed primer The primers was designed based on similar and different regions

of cytochrome b genes of cattle, buffalo and other species

PCR protocol for detection of buffalo meat (buffalo-PCR) using specific primers was accomplished A new set of primers for buffalo meat were designed and tested (Forward primer, 5'-CTACACATCCGACACAACAACAGC-3' and reverse primer, 5'-ATGTAGCAGGGGCATGAGAA-3') Amplification reaction was started with pre-denaturation step at 94oC/4', followed by 35 cycles including 94oC/1', 56oC/45'',

72oC/1’ and final extension at 72oC/5' The lowest concentration of buffalo DNA that could be detected by buffalo-PCR was 0.001 ng/μl The lowest rate of buffalo DNA in the DNA mixture reduced ratio of DNA from raw meat of buffalo, cattle, goat, sheep that buffalo-PCR could detect was 0.1%, which is the same as the lowest rate of buffalo meat that buffalo-PCR could detect in the meat mixture with reduced ratio of buffalo, beef, goat, sheep The PCR was successfully applied to detect buffalo meat in mixtures having been processed at 80oC/15’, 120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ but was not in the case of meat mixtures that had ≤ 10% buffalo meat and had been heated at

120oC/30’ and 130oC/30’

PCR protocol for detection of beef (cattle-PCR) was set up The new set of primers for the PCR to detect beef were: forward primer, 5'-CTACACATCCGACAC AACAACAGC-3’, and reverse primer, 5'-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC-3' The thermal process was as follows: 94oC/4' for initial denaturation, 35 cycles of denaturation at 94oC/1’, annealing at 54oC/45'', enlongation at 72oC/1’ and final extension at 72oC/5’ The cattle-PCR could detect cattle DNA with the concentration

as low as 0.001 ng/μl The lowest rate of cattle DNA in the mixture reduced ratio of DNA from the raw meat of the buffalo, cattle, goat, sheep that cattle-PCR could detect was 0.05% The lowest rate of cattle meat that cattle-PCR could detect in the reduced ratio mixture of buffalo, goats, sheep meat was 0.1% This PCR protocol was successfully to detect beef in meat mixtures which was processed at 80oC/15',

180oC/15' but was not to identify the meat in those had ≤ 10% buffalo meat and had been processed at 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’, and 130oC/30’

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG Trang tựa

Trang Chuẩn Y i

LÝ LỊCH CÁ NHÂN i

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii

DANH SÁCH CÁC HÌNH xv

DANH SÁCH SƠ ĐỒ xvi

DANH SÁCH CÁC BẢNG xvii

Chương 1 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Mục đích 2

Chương 2 3

TỔNG QUAN 3

2.1 Sơ lược về thịt và thịt chế biến 3

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt 3

2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến 4

2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam 5

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới 5

2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam 5

2.2 Các phương pháp phát hiện thịt 6

2.2.1 Phương pháp dựa vào protein 6

2.2.1.1 Phương pháp điện di 6

2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch 8

2.2.1.3 Phương pháp sắc ký 9

2.2.2 Phương pháp dựa vào DNA 9

2.2.2.1 Phương pháp lai DNA 9

2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR 11

2.3 Thiết kế primer 21

2.3.1 Tổng quan về thiết kế primer 21

2.3.1.1 Giới thiệu 21

2.3.1.2 Các đặc điểm của primer 21

2.3.1.3 Nguyên tắc chung của thiết kế primer 23

2.3.2 FastPCR 24

2.4 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài 24

2.4.1 DNA ty thể 24

2.4.2 Di truyền của ty thể 28

2.4.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản phẩm thịt chế biến 28

2.5 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng

phương pháp PCR và multiplex PCR 29

Chương 3 33

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 33

3.2 Nội dung nghiên cứu 33

3.3 Vật liệu 33

3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA 33

3.3.2 Primer 34

3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 34

3.4 Phương pháp tiến hành 35

3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 35

3.4.2 Tách chiết DNA 35

3.4.3 Điều chỉnh quy trình m-PCR phát hiện thịt có nguồn gốc từ heo, gà, dê, cừu, bò và/hoặc trâu 36

3.4.3.1 Phát hiện từng loại thịt bằng các phản ứng PCR đơn 36

3.4.3.2 Thiết lập và tối ưu hóa quy trình m-PCR 36

3.4.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCR 37

3.4.4 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò 38

3.4.4.1 Thiết kế primer 38

3.4.4.3 Kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 39

3.4.5 Xác định quy trình PCR- trâu và PCR-bò 40

3.4.6 Ứng dụng m-PCR, PCR-trâu, PCR-bò để phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà 40

3.4.6.1 Ứng dụng m-PCR 40

a Xác định giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR 40

b.Thực hiện m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 41

c Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 41

d Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 42

e Thực hiện m-PCR với bột thịt trên thị trường 42

3.4.6.2 Ứng dụng PCR-trâu 42

a Xác định giới hạn phát hiện của PCR-trâu 42

b PCR-trâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 42

c PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 42

d PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 42

e PCR-trâu với bột thịt trên thị trường 42

3.4.8.3 Ứng dụng PCR-bò 44

a Xác định giới hạn phát hiện của PCR-bò 44

b PCR-bò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 44

c PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử

lý nhiệt 44

d PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 44

e PCR-bò với bột thịt trên thị trường 44

Chương 4 46

KẾT QUẢ THẢO LUẬN 46

4.1 Điều chỉnh quy trình m-PCR 46

4.1.1 PCR phát hiện từng loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu 46

4.1.2 Quá trình thiết lập và tối ưu hóa m-PCR 47

4.1.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCR 49

4.2 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò 50

4.3 Kết quả kiểm tra lý thuyết độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 50

4.3.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR 50

4.3.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W 51

4.3.3 Kết quả BLAST 51

4.4 Kết quả kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 51

4.4.1 Bằng PCR 51

4.4.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B 52

4.4.1.2 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C và D 52

4.4.1.3 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E và F 52

4.4.1.4 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G và H 53

4.4.1.5 Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua 55

4.4.2 Giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F&RB; F&RC đặc hiệu 55

4.4.3 Xác nhận sản phẩm khuếch đại là của thịt trâu và bò 56

4.4.3.1 BLAST 56

4.4.3.2 Gởi mã số lên NCBI cho trình tự đoạn DNA của thịt trâu và bò 56

4.5 Xác định quy trình PCR-trâu 57

4.6 Xác định quy trình PCR-bò 57

4.7 Ứng dụng m-PCR, PCR-trâu và PCR-bò phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà 57

4.7.1 Ứng dụng m-PCR 57

4.7.1.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA mỗi loài có thể phát hiện được của m-PCR 57

4.7.1.2 M-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 58

4.7.1.3 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 59

4.7.1.4 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 60

a Kết quả phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý 61

b Kết quả so sánh m-PCR với thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt ở cùng nhóm tỷ lệ phối trộn 64

4.7.1.5 M-PCR với bột thịt trên thị trường 67

4.7.2 Ứng dụng PCR-trâu 68

4.7.2.1 Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu 68

4.7.2.2 PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu,

bò, dê, cừu 68

4.7.2.3 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 69

4.7.2.4 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 69

4.7.2.5 PCR-trâu với bột thịt trên thị trường 71

4.7.3 Ứng dụng PCR-bò 71

4.7.3.1 Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò 71

4.7.3.2 PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 72

4.7.3.3 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 72

4.7.3.4 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 73

4.7.2.5 PCR-bò với bột thịt trên thị trường 75

Chương 5 76

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

5.1 Kết luận 76

5.2 Đề nghị 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

BSE : bovine spongiform encephalophathy

F : forward primer chung cho bò và trâu tự thiết kế ( gồm F1 và F2) FSIM : forward primer SIM (kí hiệu của forward primer chung của m-PCR)

HPLC : high performance liquid chromatography

IEF : isoelectric focusing

LTRs : long terminal repeats

m-PCR : multiplex polymerase reaction chain

MT-ATP6 : mitochondrially encoded ATP synthase 6

mtDNA : mitochondrial deoxyribonucleic acid

MT-ND1 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1

MT-ND4 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4

MT-ND4L : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L

MT-ND5 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 5

MT-ND6 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6

MT-RNR1 : mitochondrially encoded 12S RNA

MT-TH : mitochondrially encoded tRNA histidine

MT-TL1 : mitochondrially encoded tRNA leucine 1 (UUA/G)

MT-TS1 : mitochondrially encoded tRNA serine 1 (UCN)

MT-TV : mitochondrially encoded tRNA valine

NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide

PCR : polymerase chain reaction

Prion : proteinaceous infectious particle

RBU : reverse primer buffalo (gọi chung cho RBU1 và RBU2 tự thiết kế)

RC : reverse primer cattle (gọi chung cho RC1 và RC2 tự thiết kế)

RCB : reverse primer cattle &/ buffalo (theo Matsunaga & ctv, 1999) RCh : reverse primer chicken

RG : reverse primer goat

RP- HPLC : reverse phase high performance liquid chromatography

RP : reverse primer pig

RS : reverse primer sheep

SSRs : simple sequence repeats

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA 10

Hình 2.2: Genome của ty thể 27

Hình 4.1: Sản phẩm PCR riêng lẻ của heo, cừu, bò, gà, dê 46

Hình 4.2: Sản phẩm PCR của thịt bò và trâu 47

Hình 4.3: Kết quả m-PCR theo PCR riêng lẻ 48

Hình 4.4: Kết quả tối ưu m-PCR 48

Hình 4.5: Kết quả thí nghiệm khẳng định m-PCR phát hiện thịt trâu 49

Hình 4.6: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A (F1-RBU1) và B (F1-RBU2) 53

Hình 4.7: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C (F1-RC1) và D (F1-RC2) 53

Hình 4.8: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E (F2-RBU1)và F (F2-RBU2) 54

Hình 4.9: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G ((F2-RC1) và H (F2-RC2) 54

Hình 4.10: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2 &RBU2 (Ta=56oC) 54

Hình 4.11: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua 55

Hình 4.12: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR 57

Hình 4.13: Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 59

Hình 4.14: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 60

Hình 4.15: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) 63

Hình 4.16: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120oC/30’(M4.1-M4.7) và 130oC/15’ (M5.1-M5.7) 63

Hình 4.17: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/30’(M6.1-M6.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) 63

Hình 4.18: Kết quả m-PCR với bột thịt trên thị trường 67

Hình 4.19: Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu 68

Hình 4.20: PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 68

Hình 4.21: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 69

Hình 4.22: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) 70

Hình 4.23: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/30’(M6.1-M6.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) 70

Hình 4.24: PCR-trâu phát hiện thịt trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/15’(M5.1-M5.7) và 120oC/30’ (M4.1-M4.7) 70

Hình 4.25: PCR-trâu với bột thịt 71

Hình 4.26: Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò 71

Hình 4.27: PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 72

Hình 4.28: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 73

Hình 4.29: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) 74

Hình 4.30: PCR-bò phát hiện thịt bòtrong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120oC/30’(M4.1-M4.7) và 130oC/15’ (M5.1-M5.7) 74

Hình 4.31: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở

130oC/30’(M6.1-M6.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) 75Hình 4.32: PCR-bò với bột thịt trên thị trường 75

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt 20

Sơ đồ 2.2: Nguyên tắc chung của thiết kế primer 23

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu 45

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt

xẻ) 3

Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển 25

Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA 26

Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho từng phản ứng PCR thịt tươi 36

Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt dự kiến của phản ứng PCR thịt tươi 36

Bảng 3.3: DNA template của thí nghiệm khẳng định m-PCR phát hiện thịt trâu 37

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu primer 39

Bảng 3.5: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp 41

Bảng 3.6: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt 43

Bảng 4.1: Các primer thiết kế 50

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR 51

Bảng 4.3: Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal W của các primer với trình tự cytochrome b các loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu 51

Bảng 4.4: Các tổ hợp primer 52

Bảng 4.5: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR 58

Bảng 4.6: Tỷ lệ thấp nhất của trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR phát hiện trong các hỗn hợp thịt xử lý ở cùng nhiệt độ và thời gian 61

Bảng 4.7: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 1 (30:30:10:10:10:10) 64

Bảng 4.8: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 2 (40:40:5:5:5:5) 64

Bảng 4.9: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 3 (48:48:1:1:1:1) 65

Bảng 4.10: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 4 (49:49:0,5:0,5:0,5:0,5) 65

Bảng 4.11: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 5 (49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1) 65

Bảng 4.12: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 6 (49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05) 66

Bảng 4.13: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 7 (49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03) 66

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, khi nhu cầu về lương thực thực phẩm tăng cao thì việc đảm bảo chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm là điều cần thiết Trong đó, các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt đã và đang là mối quan tâm của xã hội

Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ một hay nhiều loại thịt khác nhau Do sự đa dạng về hình thức, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt chế biến đã gây ra vấn đề gian lận thương mại Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt ghi thành phần trên nhãn hiệu, công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm Đặc biệt, sự gian lận này có thể ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng một hay một vài loài thịt nào đó vì lý do sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay vì lý do tôn giáo (ví dụ, đạo Hindu không ăn thịt bò, đạo Hồi và đạo Do Thái không ăn thịt heo)

Thịt chế biến thường xử lý ở nhiệt độ cao trên 1000C (khoảng 1200C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…) Đặc biệt đối với bột xương thịt làm thức ăn cho gia súc tuy

xử lý ở nhiệt độ khoảng 1300C nhưng được sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ heo, trâu, bò, cừu, gà, dê,…nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn tồn tại và có khả năng gây bệnh Ví dụ bệnh BSE (Bovine spongiform encephalopathy) - bệnh bò điên - gây hại gia súc và có khả năng lây lan sang người Vì

lý do này, các nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam không cho nhập bột xuơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò, cừu của các vùng lãnh thổ có mầm bệnh BSE

Vì thế, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp phát hiện chính xác và nhanh chóng các loại thịt trong những sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhau là nhu cầu cần thiết của thị trường và xã hội Có nhiều phương pháp để xác định nguồn gốc thịt như phương pháp phát hiện dựa vào protein (ví dụ điện di, miễn dịch, sắc ký), phương pháp phát hiện dựa vào DNA (lai DNA, RAPD-PCR, PCR đặc trưng

cho loài như standard-PCR, multiplex-PCR, Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP.)

Các phương pháp phát hiện dựa vào protein hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt Do đó, các phương pháp dựa vào DNA thường được sử dụng hơn đặc biệt là các phương pháp PCR đặc trưng cho loài Trong

đó, các phương pháp Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP đòi hỏi máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giá thành cao Còn phương pháp standard –PCR (thường gọi là PCR) và multiplex PCR dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi trong việc phân biệt loài của thịt Nếu có quy trình ly trích hợp lý, xác định gen mục tiêu thích hợp sẽ có thể phân biệt được các loại thịt đã xử lý nhiệt

1.2 Mục tiêu

- Điều chỉnh quy trình multiplex PCR để phát hiện các loại thịt heo, gà, dê, cừu, trâu/& bò sử dụng primer được thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999)

- Xây dựng quy trình PCR để phát hiện thịt trâu

- Xây dựng quy trình PCR để phát hiện thịt bò

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược về thịt và thịt chế biến

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt

Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mô có giá trị sử dụng làm thực phẩm

có nguồn gốc từ động vật Trong thương mại, thịt gồm có các mô: mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô xương sụn và mô máu Thành phần hóa học của thịt bao gồm nước, protein, lipid, glucid, các chất trích ly chứa nitơ và không chứa nitơ, khoáng, vitamin

và enzym Các thành phần này phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử dụng, khẩu phần nuôi dưỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận súc thịt và cơ thể học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004)

Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ)

Loại mô Thịt bò (%) Thịt heo (%) Thịt cừu (%)

mô liên kết Mô mỡ có giá trị năng lượng cao và còn làm cho thịt có vị béo Giá trị

thực phẩm của thịt đầu tiên được đánh giá qua tỉ lệ protein chứa trong đó và giá trị sinh học của lượng protein đó

Trong dinh dưỡng con người và động vật, thịt và sản phẩm của thịt là nguồn đạm, chất béo, vitamin, chất khoáng và các chất hòa tan Tất cả được sử dụng trong cơ thể nhằm mục đích sinh tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể cũng như bù đắp năng lượng tiêu hao do hoạt động Thịt các loài động vật chứa hầu hết các nguyên tố đa lượng và vi lượng cần thiết cho cơ thể, các vitamin nhóm B, acid pantotenic, vitamin

PP Thịt heo chứa nhiều vitamin B1, B6 và acid pantotenic Thịt bò chứa nhiều vitamin B12

2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến

Nguyên liệu chủ yếu để sản suất thịt và các sản phẩm thịt là đại gia súc có sừng (trâu, bò…); gia súc (heo, cừu, dê ); và gia cầm (như gà, vịt, ngỗng,…) Để đa dạng hóa sản phẩm chế biến từ thịt và nâng cao giá trị sử dụng của thịt thì chúng phải được chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác nhau tùy theo mục tiêu sử dụng Chế biến làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất dinh dưỡng từ thịt, hạn chế sự nhiễm vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, kéo dài tuổi thọ của sản phẩm do

đó tăng giá trị sử dụng của thịt chế biến

Thịt chế biến có hai nhóm lớn: thịt chế biến làm thức ăn cho người và thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc Thịt chế biến làm thức ăn cho người thường được chế biến từ mô cơ, mô mỡ Thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thường là bột thịt) còn được chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác là phụ phế phẩm trong giết mổ gia súc như da, lông, xương, móng và các nội quan

Có nhiều phương pháp chế biến thịt cung cấp thực phẩm cho con người: phơi khô, ướp muối, ướp đường, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy), hun khói Trong đó phương pháp sử dụng nhiệt độ là phổ biến nhất Tùy theo loại sản phẩm và mục tiêu sử dụng mà người ta xử lý ở mức nhiệt độ khác nhau Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế biến như xúc xích, lạp xưởng, thịt hộp, cá hộp được xử lý ở 800C; xúc xích tiệt trùng, thịt hộp được xử lý ở 1200C; đối với bột thịt sử dụng cho gia súc và con người, nhiệt độ xử lý là 1300C (Hồ Thị Thu Nguyệt, 2003)

2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới

Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức nhiều cuộc điều tra trên đối tượng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy

có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu của sản phẩm Đặc biệt là sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt gia súc khác nhau, các nhà sản xuất thường ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại thịt có giá trị thấp được trộn vào trong sản phẩm Một số trường hợp lại ghi sai tỷ lệ giữa các loại thịt Trong khi đó, khả năng kiểm soát thành phần loài, độ an toàn và chất lượng sản phẩm thịt chế biến trên thị trường của các tổ chức ban ngành có liên quan vẫn còn ít (http://archive.food.gov.uk)

Một cuộc điều tra khác của bộ môn Công Nghệ thực phẩm và vệ sinh thực phẩm, trường Thú y, Đại học Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt được trộn vào trong các sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là 39,2% xúc xích lên men 35,7% xúc xích Ý, 27,2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tươi, 6,2% thịt viên

có chứa thịt của những loài động vật không công bố trên nhãn sản phẩm Cụ thể là xúc xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức với thành phần ghi trên nhãn là thịt bò nhưng kết quả kiểm tra lại có lẫn thịt gia cầm Các mẫu thịt bò tươi kiểm tra cho thấy dương

tính với thịt hươu và thịt ngựa

2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tình hình gian lận thương mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và sản phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với nhà quản lý Ngay cả thịt tươi bán ở chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận như thịt trâu giả bò, thịt ngựa giả bò, thịt heo giả dê Đối với các sản phẩm thịt chế biến như xúc xích tôm, xúc xích bò, chả giò, thịt hộp trên thị trường có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng với thành phần trên nhãn hiệu đã đăng kí, đặc biệt các thực phẩm chế biến nhập khẩu

Những năm gần đây, Việt Nam đặc biệt quan tâm đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Các bệnh dịch nguy hiểm đã và đang diễn ra Tình trạng vận chuyển lậu động vật và các sản phẩm động vật vẫn thường xảy ra Cục Thú y đã phối hợp với Vụ pháp chế - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm –

Bộ Y tế, Cục quản lý Thị trường – Bộ Công thương thường xuyên tổ chức thanh tra,

kiểm tra công tác kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt động chống nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức phức tạp Tuy nhiên, chính quyền địa phương chưa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa các cơ quan, ban ngành tại địa phương chưa thống nhất và chặt chẽ

(http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=182&Itemid=65)

Thêm vào đó, công tác kiểm tra đối với các mặt hàng xuất nhập khẩu có nguồn gốc động vật vẫn còn nhiều vấn đề bất cập:

- Các nhà xuất nhập khẩu đều có thể đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn kỹ thuật và tiêu chuẩn của Việt Nam Tuy nhiên, do thiếu trang thiết bị và cán bộ, nên việc kiểm tra chất lượng , kiểm dịch và thủ tục phê duyệt thường kéo dài

- Trong khi đó, các nước nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lượng, kiểm dịch, kiểm soát giết mổ của các nước nhập khẩu thường rất chặt chẽ Các yêu cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của các nước này cũng rất cao

- Các nhà nhập khẩu nước ngoài còn yêu cầu thịt và sản phẩm của thịt phải được lấy từ vùng an toàn đối với bệnh lở mồm lông móng, dịch tả heo, dịch tả gà (newcastle), BSE và những vùng này phải được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) công nhận

- Yêu cầu tiêu chuẩn của Việt Nam thường không chặt chẽ bằng các yêu cầu tiêu chuẩn của các nước nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006)

2.2 Các phương pháp phát hiện thịt

2.2.1 Phương pháp dựa vào protein

Những phương pháp dựa vào protein sau đây có thể ứng dụng để xác định thành phần và nguồn gốc của các sản phẩm thịt và từ thịt:

Phương pháp điện di dựa vào sự phân tách của các phân tử protein trong điện trường sau khi ly trích từ mô Đầu tiên, protein đi qua lớp starch gel, sau đó đi qua lớp polyarylamide và agarose Sự phân tách protein được biểu hiện trên polyarylamide gel (PAGE), trên polyacrylamide gel chứa một tác nhân biến tính (sodium dodecyl sulfate) (SDS-PAGE) hoặc nhờ điểm đẳng điện (isoelectric focusing - IEF) trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide (PAGIF)

Phương pháp IEF bao gồm sự phân tách trên một gel mà được xác định nhờ sự thay đổi pH Các protein riêng lẻ di chuyển theo giá trị pH mà tương đương với điểm đẳng điện (isoelectric point ) Điện di PAGE cũng được quan tâm nhờ sự vắng mặt của tác nhân biến tính Trong phương pháp này, sự phân tách protein phụ thuộc vào vật mang và kích thước của phân tử protein Các protein di chuyển từ cực dương sang cực

âm phụ thuộc vào điện tích của chúng Trong trường hợp của SDS – PAGE, phân tử protein mang điện tích âm được lấy từ SDS di chuyển từ cực dương với vận tốc phụ thuộc chủ yếu vào trọng lượng phân tử của chúng Có một mối tương quan tuyến tính giữa khoảng cách di chuyển của protein và giá trị logarit thập phân của trọng lượng phân tử mà có thể dùng để xác định trọng lượng phân tử của protein Với sự hỗ trợ của điện di hai chiều (two dimensional electrophoresis 2-DE), nó có thể dùng để xác định thịt của nhiều loài liên quan của cá, chim, gia súc Sự phân tách protein có thể nhìn thấy được bằng mắt thường (trong trường hợp protein có chứa chất màu) hoặc sau khi nhuộm màu Những thuốc nhuộm thông thường gồm: coomasie blue, muối bạc, hoặc chất nhuộm có bản chất enzym (Hofmann, 1997)

™ Ứng dụng của phương pháp IEF

Sự phân tách protein nhờ IEF chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: pH thịt, tuổi và giới tính của gia súc cho thịt, dinh dưỡng, điều kiện nuôi, điều kiện dự trữ, hoạt tính tự nhiên hoặc protease vi sinh vật Có thể phân tách dựa vào thành phần đơn, ví dụ myoglobin là sắc tố cơ chuyên biệt loài Myoglobin sử dụng như là chỉ thị loài, sự phân tách cùng nhau có thể đạt được bởi những thịt thí nghiệm khác nhau của cùng một con vật hay của những con vật khác nhau của cùng một loài Điều này đã được chứng minh đối với thịt của các loài như bò, ngựa, heo, cừu, dê, kangaroo, lạc đà, gấu, thỏ, gà, vịt, đà điểu, band myoglobin được xác định và chúng có thể được phân biệt cơ bản những myoglobin (Hofmann, 1997) Trong trường hợp, những thú có quan hệ gần

thể được sử dụng để xác định những thú có liên quan nhau với lượng myoglobulin thấp Ví dụ, thịt gà và thịt gà tây

™ Ứng dụng của phương pháp PAGE và SDS-PAGE

Phương pháp điện di PAGE có thể được sử dụng để xác định protein của các loại thịt heo, bò, ngựa, cừu, cá, dê, hươu Phương pháp này cũng có thể sử dụng để phát hiện thịt của những loài có quan hệ với nhau, nhưng protein dùng để kiểm tra không được xử lý nhiệt Việc xác định các sản phẩm thức ăn bổ sung từ thịt của những

loài khác nhau đã xử lý nhiệt có thể thực hiện trong điều kiện protein kiểm tra được

phân hủy trong dung dịch guanidine chloride và điện di đẳng điện sau khi nhuộm enzym (Pyz, 1998)

Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) có thể phân tích các protein khó tan trong các dung môi khác hơn là trong dung dịch SDS Phương pháp này cũng có thể ứng dụng cho các protein không tan trong dung dịch có chứa urê, được sử dụng để phân tích chất lượng của protein, ví

dụ protein nhiều loài cá hoặc phân tích số lượng dựa vào thuốc nhuộm Tuy nhiên, phương pháp này không tiện lợi vì kết quả đạt được có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu

tố như tuổi, dinh dưỡng, stress, sự sai khác về chất lượng của thịt cũng như thịt đông lạnh bảo quản không tốt so với thịt tươi (Minkiewicz & ctv, 2000)

2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch

Phương pháp miễn dịch được sử dụng trong phân tích thực phẩm bao gồm phân tích những phân tử có trọng lượng nhỏ như mycotoxins, kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vitamin cũng như những phân tử lớn như độc tố vi khuẩn, enzym, kích thích tố, protein thực phẩm, và thậm chí phân tích những vi sinh vật sống như vi khuẩn và nấm mốc (Hitchcock, 1988; Fukall & Kas, 1989) Từ đầu thế kỷ XX, phương pháp miễn dịch dựa vào phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể đã được ứng dụng để phân biệt loài của thịt Những thành tựu trong hóa miễn dịch đã dẫn đến sự xuất hiện nhiều phương pháp miễn dịch mới, bao gồm các phương pháp miễn dịch phóng xạ, các phương pháp miễn dịch enzym, và các phương pháp miễn dịch sắc ký không enzyme (non-enzymatic chromatographic immunoassays hay lateral flow) với độ nhạy và độ chính xác được cải thiện rất nhiều

2.2.1.3 Phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký gồm sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng (LC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được ứng dụng để phân biệt loài trong các mẫu thịt dựa vào sự kiểm tra thành phần acid béo (Verbeke & Brabander, 1985), histidine dipeptides (Carnegie & ctv, 1983; Chung & ctv, 1998) Trong các kỹ thuật trên, HPLC được sử dụng rộng rãi nhất Ví dụ, phương pháp sắc ký lỏng cao áp ngược pha (RP-HPLC) được sử dụng để phân biệt loài của thịt tươi và thịt chế biến dựa vào histidine peptides phụ thuộc vào loài, tỷ lệ đặc trưng của carnosine với serine (C/E) (Chung & ctv, 1998) Mặc dù, mẫu sắc ký giống nhau ở các cơ khác nhau trong một loài, nhưng có nhiều protein đặc trưng và có nhiều peak protein thay đổi (Toorop & ctv, 1997; Ashoor & ctv,1998) gây khó khăn cho việc phân tích dữ liệu Dựa vào lý do căn bản là chất béo không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, phương pháp LC được phát triển cho việc phát hiện thịt heo và mỡ heo trong các sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến dựa vào tăng tỷ lệ triglyceride có trong acid béo bão hòa với triglyceride chứa trong acid béo không bão hòa (Saeed & ctv, 1989) Tuy nhiên, vì lượng mỡ trong sản phẩm thịt thường thay đổi nên khó xác định lượng thịt giả mạo (bị pha trộn) từ phương pháp dựa vào chất béo Cũng như phương pháp điện di, phương pháp sắc ký có thể phân biệt loài riêng biệt, nhưng phương pháp sắc ký ít hiệu quả trong việc phát hiện loài thịt giả mạo được pha trộn trong các hỗn hợp thịt tươi và thịt chế biến vì tính phức tạp cao của các peak Thêm vào đó, phương pháp sắc ký đòi hỏi trang thiết bị đắc tiền và quy trình chuẩn bị mẫu khó khăn

2.2.2 Phương pháp dựa vào DNA

2.2.2.1 Phương pháp lai DNA

Các nghiên cứu ban đầu sử dụng DNA để phát hiện loài của thịt đã sử dụng những phương pháp đơn giản Nhờ đó mà những probe DNA đã đánh dấu được lai với DNA bộ gen của mẫu thấm trên màn nilong Mô hình thí nghiệm cho một kiểm tra được chỉ ra ở hình 2.4 Sự chuẩn bị probe không đòi hỏi bất kỳ kiến thức trước như tính chính xác về trình tự DNA nghiên cứu Sự gắn kết chuyên biệt về loài của probe với DNA mục tiêu là nhờ probe lai với trình tự bổ sung với probe trên DNA mục tiêu Những trình tự bổ sung với probe được sắp xếp một cách ngẫu nhiên và được tìm thấy xuyên suốt genome như trình tự “satellite”

Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA

3 mẫu thuộc 3 loài: X, Y, và Z; sử dụng probe được chuẩn bị từ loài Y

(Lockley & ctv, 2000)

Ly trích DNA Ly trích DNA

Biến tính DNA và gắn kết lên màng Tổng hợp probe và đánh dấu

Lai probe với màng

Rửa để loại bỏ probe không gắn kết Phát hiện probe được lai

2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR

Phương pháp PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua vì khả năng khuếch đại của kỹ thuật PCR có thể phát hiện trình tự DNA mục tiêu khi lượng mẫu hạn chế Các phương pháp dựa vào PCR để phân biệt loài của thịt đã được phát triển

từ thập niên trước Tất cả những phương pháp PCR này được phân thành 2 nhóm (Hui, 2006) Đó là Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) và PCR đặc trưng cho loài (species-specific PCR) RAPD khuếch đại nhiều trình tự chưa được biết trước sử dụng các primer không chuyên biệt, dẫn đến kết quả fingerprint đặc trưng cho từng loài (species-specific fingerprints) của sản phẩm PCR được quan sát trên gel điện di Species-specific PCR (species-specific PCR) sử dụng các cặp primer đặc trưng và bảo tồn mà các primer này bắt cặp với những trình tự dùng để phân biệt loài của DNA nhân hay DNA ty thể Vì thế cần phải biết trước về trình tự DNA mục tiêu để thiết kế primer Sản phẩm PCR sau đó có thể được phân biệt dựa vào kích thước, giải trình tự, hoặc dựa vào những phân tích tiếp theo như đa hình chiều dài phân đoạn (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) hoặc đa hình cấu tạo chuỗi đơn (Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) Ưu điểm của kỹ thuật PCR là tính hiệu quả và ít tốn thời gian

a Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Những primer chuyên biệt hoặc ngẫu nhiên khuếch đại những marker DNA đa hình được sử dụng để phân biệt loài của thịt Những primer chuyên biệt này thường ngắn, kích thước khoảng 10 bp Do trình tự của những primer này chuyên biệt nên không cần biết trước trình tự DNA của loài Trong cùng điều kiện PCR, các primer này sẽ khuếch đại hàng loạt vị trí cho ra nhiều band khác nhau khi điện di Từ đó xác định được band chuyên biệt về loài Những cặp primer khác nhau sẽ cho ra sản phẩm

khác nhau (Lee & ctv, 1994; Cushwa, 1996; Roa & ctv, 1996; Koh, 1998)

Phương pháp RAPD sử dụng những primer bất kỳ dựa trên những trình tự oligonucleotide ngắn khuếch đại nhiều trình tự không xác định cùng một lúc Sau khi điện di trên gel, sản phẩm PCR sẽ cho ra các dạng fingerprint có tính duy nhất cho một loài chuyên biệt Khả năng phân biệt của RAPD-PCR thì gần như không có giới hạn vì

sự lựa chọn các primer bất kỳ là không giới hạn Tuy nhiên, không phải tất cả các primer ngẫu nhiên có thể phân biệt một cách thỏa đáng giữa các loài Sàng lọc và lựa chọn kỹ lưỡng các primer là điều quan trọng cho việc áp dụng thành công kỹ thuật này

(Saez & ctv, 2004) RAPD đã được ứng dụng phân biệt loài các động vật nuôi (Koh & ctv, 1998), nhiều loại thịt, sản phẩm thịt (Martinez & ctv, 1999; Bellagamba & ctv, 2003) RAPD được sử dụng để tạo ra những fingerprint rõ ràng từ các sản phẩm chế biến mà trong đó DNA hơi bị biến tính, như các sản phẩm cá muối hoặc xông khói (Martinez, 1997) Mặc dù kỹ thuật này thu được các fingerprint mang thông tin hữu ích trong thời gian ngắn nhưng hiệu quả không được biết trước vì điều kiện chu kỳ hay

sự đa hình của các loài ngoại nhiễm Sử dụng những primer dài hơn và điều kiện khuếch đại chính xác hơn có thể cải thiện tính hiệu quả (Desmarais & ctv, 1998) Vì thế, qui trình RAPD phải được tối ưu và thực hiện một cách chính xác Phân tử DNA thường bị gãy thành những đoạn nhỏ hơn trong các sản phẩm chế biến; vì thế phân tích RAPD ít được tin cậy để sử dụng phân tích những mẫu đã qua khử trùng và đóng hộp RAPD thuận lợi như là một phương pháp định tính nhanh chóng cho việc phân biệt loài của thịt, nhưng mỗi một lần kiểm tra phải được chạy cùng với một mẫu chuẩn đã được biết trước (Koh & ctv, 1998) Tóm tắt về nguyên lý và ứng dụng của phương pháp RAPD trong phân tích di truyền của những loài vật nuôi được viết bởi Cushwa

và Medrano (Cushwa & Medrano, 1996)

b PCR đặc trưng cho loài (Species-specific PCR)

PCR đặc trưng cho loài dùng để phân biệt loài đã được phát triển để khuếch đại một đoạn DNA với sự biến đổi đủ đặc trưng cho loài Các primer xuôi và ngược được thiết kế chuyên biệt cho mỗi loài dựa vào sự sắp gióng của các trình tự DNA có sẵn từ các gen được chọn Thông tin đầy đủ về trình tự cho phép dự đoán kích thước của sản phẩm, giúp cho việc đọc kết quả trên gel thuận lợi Các gen ty thể như ATPase 8 đơn

vị và 6 đơn vị (Tartaglia & ctv, 1998; Krcmar & Rencova, 2003), D-loop và gen cytochrome b (Cyt b) (Kocher & ctv, 1989; Burgener & Hübner, 1998; Matsunaga & ctv, 1999; Colombo & ctv, 2000; Herman , 2000), DNA satellite (Guoli & ctv, 1999) các gen actin (Fairbrother & ctv, 1998; Hopwood & ctv, 1999), những yếu tố đặc trưng Art2 ngắn và CR1 dài nằm trải rác trên genome (Tajima & ctv, 2002) và gen hormone phát triển (Brodmann & ctv, 2003) đã được nghiên cứu trong việc xác định loài của động vật, với nhiều phương pháp tập trung vào gen Cyt b như là trình tự mục tiêu Độ đặc hiệu của các cặp primer mà được mã hóa từ trình tự gen Cyt b đã cho phép khuếch đại DNA của cá ngừ để xác định loài cá ngừ đã qua chế biến và trong đồ hộp trên thị trường

b1 Standar-PCR

PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ

polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 PCR là kỹ thuật in vitro

cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn

(tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào)

Sự khuếch đại nhờ những primer oligonucleotid Primer là những phân tử DNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverse primer) Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới

bổ sung với sợi DNA mẫu Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi Sự tổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập

Các giai đoạn của PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn (Too , 2001):

¾ Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường ở 94 -

950C trong vòng 30 giây đến 1 phút

¾ Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

¾ Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA

™ Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m*2n (Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa)

™ Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu kỳ tiếp theo Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức:

Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x

n : Số chu kỳ

2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2

x : Số bản sao của chuỗi mã hóa

+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

ƒ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

ƒ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

ƒ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp với nhau

Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu là

105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35

– 40

Các thành phần của một PCR

Theo Too (2001), các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm:

- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại

- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình thự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của PCR Các primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không

có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer Chiều dài các primer tối

thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide) Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngược không quá lớn, PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb

- Polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt được sử

dụng rất phổ biến, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng

Taq DNA polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu

đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Taq DNA polymerase tổng

hợp DNA theo hướng 5’→3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C

- Các nucleotid (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA

- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzym được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzym polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzym và sự trung thực của kết quả Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Phân tích kết quả PCR

Sản phẩm của PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của điện trường Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và điện thế

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ=300 nm) thành vạch màu đỏ da cam

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)

Tartaglia & ctv (1998) đã phát triển phương pháp PCR chuyên biệt cho bò sử dụng trình tự DNA ty thể đặc trưng cho bò để thiết kế primer Phương pháp cho phép phát hiện thịt bò và bột xương bò ở mức 0,125% Nhờ khuếch đại DNA satellite sử dụng các cặp primer chuyên biệt cho bò, Guoli & ctv (1999) đã phát hiện thịt bò tươi, luộc (100oC, 30 phút) và autoclaved (120oC, 30 phút) mà không có hiện tượng bắt cặp chéo với các loài khác được kiểm tra

b2 Multiplex PCR

Multiplex PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng Multiplex PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online) Phương pháp multiplex PCR thực chất là phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định Chính vì vậy đoạn DNA mục tiêu nhân lên rất nhiều lần và có thể được quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Multiplex PCR cho phép phân biệt cùng một lúc nhiều loài với một phản ứng PCR sử dụng một primer universal từ trình tự DNA bảo tồn trên gen cùng với nhiều primer được thiết kế từ trình tự đặc trưng cho từng loài (Matsunaga & ctv, 1999, Rodriguez & ctv, 2003) Thông tin chi tiết về trình tự của nhiều loài có thể tìm kiếm được và do đó sự đa hình về mặt phát sinh loài có thể được xác định dựa vào những primer chuyên biệt về loài Dưới điều kiện phản ứng nghiêm ngặt, những primer cho ra một sản phẩm chỉ khi có sự hiện diện DNA của loài đặc hiệu với primer Nhờ vào sự bắt cặp của các primer chuyên biệt loài với trình tự DNA đặc trưng ở mỗi loài, nó có thể được dùng để kiểm tra sự hiện diện nhiều loài Trong phương pháp này, có thể sử dụng một primer forward chung (dựa vào vùng bảo tồn trên cytochrome b ở các loài)

và các primer reverse riêng (dựa vào vùng không bảo tồn trên cytochrome b) Phương pháp multiplex PCR được sử dụng để phát hiện nhiều loài của thịt (Meyer & ctv, 1994; Matsunaga, 1999; Behrens, 1999)

b3 Real time PCR

Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn DNA chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành (McPherson & Moller, 2006)

Phương pháp Real – time PCR dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang Trong khi chạy Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu Mẫu xét nghiệm chứa nhiều DNA đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu xét nghiệm có ít DNA đích Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào các nồng độ DNA chuẩn Nồng độ DNA trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn

Tính đặc hiệu của Real - time PCR tùy thuộc hóa chất dùng để theo dõi phản ứng khuếch đại và dụng cụ để kiểm tra tín hiệu Các hóa chất khác nhau dùng trong mục đích này (Weighardt , 2004):

- Phẩm nhuộm chèn vào DNA sợi đôi sẽ phát huỳnh quang: ethidium bromide, SYBR Green I

- Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang: TaqMan probe, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probe, Molecular Beacons probe, Scorpions và TaqMan Minor Groove Binder (MGB) probe

Trong đó, kỹ thuật TaqMan probe thường được sử dụng trong việc phân biệt loài (Holland & ctv, 1991) Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong DNA đích Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là reporter) và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’ Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu Khi DNA đích tích lũy, probe gắn vào DNA đích nhưng chưa phát

quang Khi mạch bổ sung với mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài, Taq DNA

polymerase tiến tới đầu 5’ của probe Hoạt tính 5’Æ3’ exonuclease của Taq DNA

polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh quang của probe Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên Mức độ huỳnh quang tương ứng với số DNA chuyên biệt mong đợi Khác với SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm DNA khuếch đại không đặc hiệu sẽ không cho tín hiệu huỳnh quang (McPherson & Moller, 2001)

Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần

Kỹ thuật TaqMan sử dụng các primer chuyên biệt cho loài đã được phát triển để phát hiện thịt bò hoặc thịt heo trong thực phẩm với giới hạn phát hiện từ 0,1 % xuống 0,01% (Lahiff & ctv, 2002; Laube & ctv, 2003)

b4 PCR-RFLP

Chikuni và ctv (1994) đã thiết kế primer cho PCR dựa vào trình tự DNA satellite

I của cừu để khuếch đại DNA cừu và dê nhưng không khuếch đại được ở các loài khác như bò, trâu, hươu, ngựa, heo, gà, thỏ Giải trình tự sản phẩm PCR cho thấy 92% tương đồng Tuy nhiên, có 4 vùng enzym cắt giới hạn khác nhau ở cừu và dê vì thế có

thể phân biệt hai loài này bằng enzym cắt giới hạn Sử dụng ApaI cắt sản phẩm 374 bp

cừu cho ra hai đoạn 236 bp và 138bp Vùng cắt của enzym này không tồn tại trên sản phẩm PCR của dê Kỹ thuật này gọi là PCR – RFLP Nó được sử dụng rộng rãi để phân biệt loài của nhiều loại thịt (Meyer & ctv, 1995; Borgo & ctv, 1996; Beneke & ctv, 1998; Hopwood & ctv, 1999; Wolf, 1999; Partis, 2000) Hơn nữa, việc phân biệt loài không cần giải trình tự sản phẩm PCR mà chỉ ủ sản phẩm PCR với nhiều enzym cắt giới hạn, rồi sau đó dựa vào kết quả điện di các đoạn DNA mà sau khi ủ với enzym

có thể phân biệt được loài của thịt

trình tự sản phẩm PCR trở thành một công việc chuẩn trong phòng thí nghiệm mà thực hiện kỹ thuật DNA tái tổ hợp thì dữ liệu về trình tự DNA của các loài động vật sẽ được hình thành để việc xác nhận rõ ràng (Bossier, 1999) Tuy nhiên, vẫn còn một số khó khăn cho việc ứng dụng giải trình tự cho hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau

Phương pháp trực tiếp để có thông tin từ sản phẩm PCR là giải trình tự Thông tin có được sẽ sử dụng để xác định nguồn gốc loài của các loại thịt Các nghiên cứu liên quan đến vấn đề này thường có khuynh hướng tập trung khuếch đại trình tự DNA

ty thể, đặc biệt là gen cytochrome b (Lockley & ctv, 2000) DNA ty thể có nhiều ưu điểm hơn DNA nhân ở các nghiên cứu xác định loài của các sản phẩm thịt (Alberts & ctv, 1994) DNA ty thể có khuynh hướng được thừa hưởng từ mẹ và do đó sẽ tránh được sự tối nghĩa về mặt trình tự của mã di truyền ở kiểu gen dị hợp tử DNA ty thể có

tỷ lệ biến dị tương đối cao so với nhiều gen trong nhân Điều này có ý nghĩa trong việc tích lũy đủ những điểm đột biến để cho phép sự phân biệt chính xác những loài có quan hệ gần với nhau Tuy nhiên, phải chú ý rằng DNA ty thể cũng biểu hiện một mức

độ thay đổi trong loài và vì thế phải cẩn thận trong nghiên cứu sự khác biệt về nguồn gốc dựa trên sự đa hình (Chow & ctv, 1993)

b6 PCR-SSCP (PCR- Single Strand Conformational Polymorphism)

PCR được sử dụng để khuếch đại vùng giống nhau của DNA từ những loài khác nhau, thường là một phần của gen cytochrome b ty thể Sản phẩm chuỗi đôi sau đó được biến tính cho ra DNA chuỗi đơn có cấu trúc bậc hai phụ thuộc vào trình tự của

nó Sau khi điện di trên gel polyacrylamide trong điều kiện thích hợp, sản phẩm với những cấu trúc bậc hai khác nhau di chuyển khác nhau trong điện trường và thu được những đoạn khác nhau Sử dụng phương pháp này có thể phân biệt các loài có ít sự khác biệt thậm chí chỉ là sai khác một base (Hayashi ,1996) Phương pháp này có thể phân biệt thịt lợn và thịt lợn lòi (Rea & ctv, 1996)

Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt

Phương pháp dựa vào DNA Các phương pháp phân biệt loài của thịt

Sắc ký Khí

Không cạnh tranh

AGID Miễn dịch

RIA

Trong PCR, bao giờ cũng cần có cặp primer (primer xuôi và primer ngược) Có rất nhiều tiêu chuẩn nghiêm ngặt đặt ra khi thiết kế một cặp primer như chiều dài primer, tính chuyên biệt của cặp primer, nhiệt độ nóng chảy Tm của primer, nhiệt độ bắt cặp, sự tạo thành cấu trúc bậc hai để đảm bảo PCR thành công và thu được sản phẩm nhân bản (một số lượng bản sao của đoạn DNA khuôn ban đầu) Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn primer dự định thiết kế sẽ rất tốn thời gian và công sức Công việc này trở nên dễ dàng và nhanh chóng nhờ các phần mềm thiết kế primer

Một chương trình thiết kế primer hoàn chỉnh đòi hỏi nhiều chức năng, công cụ tương đối phức tạp và tính logic cao Thông thường chương trình phải đáp ứng được nhiệt độ bắt cặp của primer, kiểm tra khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc của primer, kiểm tra sự bắt cặp của primer xuôi và primer ngược Một số chương trình thiết kế primer thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử là Primer 3, IDT, PDA, FASTPCR, VectorNIT, DNAclub

2.3.1.2 Các đặc điểm của primer

™ Tính chuyên biệt

Duy nhất: Chỉ duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên khuôn DNA, nghĩa là trình

tự primer chỉ xuất hiện một lần trên trình tự khuôn Ngoài ra, cần đảm bảo primer không bắt cặp bổ sung vào trình tự DNA của các nguồn có khả năng nhiễm như DNA người, chuột, tác nhân gây cùng triệu chứng Có thể kiểm tra bằng công cụ BLAST của NCBI

Chiều dài: Chiều dài của primer ảnh hưởng đến tính duy nhất, nhiệt độ nóng chảy và

nhiệt độ bắt cặp của primer Nói cách khác, primer càng dài thì nó thể hiện được tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp càng cao Để đảm bảo tính duy nhất

thì chiều dài của primer phải tối thiểu là 15 base, primer thường có chiều dài từ 17 đến

28 base Chiều dài của primer được chọn phụ thuộc vào tính duy nhất của primer và nhiệt độ nóng chảy của primer đó

Thành phần base: ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của quá trình lai, nhiệt độ nóng chảy,

nhiệt độ lai và sự ổn định của cấu trúc phân tử Các base được sắp xếp ngẫu nhiên thì thích hợp hơn là những vùng (A+T) dài hay là những vùng giàu (G+C) Thành phần (G+C) khoảng từ 50 đến 60% sẽ cho nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ lai thích hợp trong một PCR bình thường

™ Tính ổn định

Nhiệt độ nóng chảy (Tm): Là nhiệt độ mà tại đó một nửa sợi DNA là sợi đơn và một

nửa còn lại là DNA sợi đôi Tm là đặc tính của các thành phần base Thành phần (G+C) trong DNA cao sẽ dẫn tới nhiệt độ Tm cao vì nhiều liên kết H trong DNA hơn

Có nhiều công thức tính Tm, một trong những công thức được nhiều người sử dụng nhất là:

Tm = 2(A+T) + 4(G+C) (Wallace và ctv, 1979)

Nhiệt độ bắt cặp (Tanneal) là nhiệt độ mà tại đó primer bắt cặp với DNA khuôn Tanne

al được tính theo công thức sau :

Tanneal = Tm-primer – 4oC

Để đảm bảo primer bắt cặp vào DNA mạch khuôn trước khi hai mạch khuôn bắt cặp với nhau thì :

Tính nghiêm ngặt trong quá trình bắt cặp của primer: quyết định tính đặc hiệu của

sản phẩm DNA được nhân bản Tanneal là nhân tố ảnh hưởng quan trọng nhất của tính chuyên biệt này Nếu Tanneal quá thấp thì primer sẽ bắt cặp không đặc hiệu nên tính nghiêm ngặt thấp Ngược lại, nếu Tanneal quá cao thì primer không có khả năng bắt cặp

nên tính nghiêm ngặt cao

Cấu trúc thứ cấp: nếu sự bắt cặp giữa primer xuôi và primer ngược (hình thành

dimer, hetero dimer); primer xuôi với primer xuôi (self - dimer, homo – dimer), giữa primer ngược với primer ngược (self - dimer, homo – dimer); hay primer tự tạo thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin) xảy ra nhiều hơn so với sự bắt cặp của primer với DNA mẫu thì hiệu quả nhân bản của PCR giảm một cách rõ rệt Như vậy, nên tránh những trường

hợp này