ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO Ở TP. HỒ CHÍ MINH

Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm tetracycline và cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm tetracycline ...13 2.3.4.6.. Khái niệm và phân loại Kháng sinh là tất cả các chất hóa h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA

VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO

Ở TP HỒ CHÍ MINH

Tác giả

NGUYỄN DUY THIÊN

uận văn được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng L

Bác sỹ ngành Thú y

Giáo viên hướng dẫn:

TS VÕ THỊ TRÀ AN BSTY NGUYỄN THANH TÙNG

Tháng 09/2009

LỜI CẢM ƠNKính dâng lên cha mẹ

Những người đã suốt đời tận tụy vì con Cha mẹ đã hy sinh, vất vả và không quản khó nhọc để nuôi dạy con lên người

Trân trọng biết ơn

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y

Cùng toàn thể thầy cô đã tạo điều kiện học tập, hết lòng truyền đạt những kiến thức quí báu cho tôi trong suốt thời gian khóa học

Thành kính tri ơn

Cô Võ Thị Trà An và Thầy Lê Hữu Ngọc, anh Nguyễn Thanh Tùng đã hết lòng hướng dẫn, góp ý, truyền đạt những kiến thức và thao tác phòng thí nghiệm và cung cấp tài liệu quí báu để tôi hoàn thành đề tài này

Cảm ơn tất cả các bạn bè trong và ngoài lớp đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian qua cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ trong lúc tôi thực tập tốt nghiệp

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Qua thời gian thực hiện đề tài “Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân

lập từ thịt heo ở Tp Hồ Chí Minh” tại Chi cục Thú y Tp Hồ Chí Minh và phòng Thí

nghiệm Kiểm Nghiệm Thú Sản và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 3 năm 2009 đến tháng 6 năm 2009, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Từ 110 chủng vi khuẩn lấy từ Chi cục Thú y Tp Hồ Chí Minh chúng tôi đã tiến

hành kiểm tra và định danh E coli tại phòng thí nghiệm Kiểm Nghiệm Thú Sản và

Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi Kết quả thu được 85 chủng có khuẩn lạc điển hình

trên môi trường EMB và sinh hóa phù hợp với đặc tính của E coli (chiếm 77,27%)

Dùng phương pháp khuếch tán trên thạch, chúng tôi kiểm tra tính nhạy cảm với

12 loại kháng sinh của 85 chủng E coli Qua kết quả kháng sinh đồ cho thấy rằng những kháng sinh còn nhạy cảm với E coli là ceftazidime (96,47%), norfloxacin

(91,76%), amoxicillin/acid clavulanic (90,59%) và gentamicin (80%)

Những kháng sinh đề kháng với hơn 1/3 số chủng E coli là tetracycline

(85,88%), sulfamethoxazole/trimethoprim (67,71%), ampicillin (50,59%), chloramphenicol (34,12%)

E.coli mẫn cảm trung gian với các kháng sinh còn lại polymyxin B (57,65%),

cephalexin (41,18%), streptomycin (28,24%)

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU …1 U

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH 2

1.3 YÊU CẦU 2 U Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN KHOA HỌC 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ E COLI 3

2.1.1 Hệ thống phân loại 3

2.1.2 Hình thái, sức đề kháng và khả năng mẫn cảm với kháng sinh 3

2.1.2.1 Hình thái và sức đề kháng 3

2.1.2.2 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh 4

2.1.3 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn E.coli 5

2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên 5

2.1.5 Độc tố 6

2.2 PHÂN LOẠI E COLI 6

2.3 KHÁNG SINH VÀ SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH 7

2.3.1 Khái niệm và phân loại 7

2.3.2 Một số kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong thú y 8

2.3.3 Đề kháng 9

2.3.4 Cơ chế tác động của kháng sinh và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh .10

2.3.4.1 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm β-lactam và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm β-lactam 10

2.3.4.2 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm aminoglycoside và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm aminoglycoside 11

2.3.4.3 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm phenicol và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm phenicol 12

2.3.4.4 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm polypeptide và cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm polypeptide 12

2.3.4.5 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm tetracycline và cơ chế đề kháng của

vi khuẩn đối với nhóm tetracycline 13

2.3.4.6 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone và cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm quinolone 13

2.3.4.7 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm sulfonamide và diaminopyrimidine; cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm sulfonamide và diaminopyrimidine 14

2.4 KHÁNG SINH ĐỒ 14

2.5 LƯỢC DUYỆT MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ SỰ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA E COLI .18

2.5.1 Một số công trình nghiên cứu trong nước 18

2.5.1.1 Trên gia súc 18

2.5.1.2 Trên người 21

2.5.2 Một số công trình nghiên cứu nước ngoài 22

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 23

3.1.1 Thời gian 23

3.1.2 Địa điểm 23

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 U 3.3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.3.1 Vật liệu 23

3.3.2 Đối tượng lấy mẫu 23

3.3.3 Số lượng mẫu 23

3.3.4 Nghiên cứu vi sinh vật học 24

3.3.4.1 Nuôi cấy phân lập tại phòng thí nghiệm Kiểm Nhiệm Thú Sản và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi 24

3.3.4.2 Giám định các chủng E coli phân lập được bằng phản ứng sinh hóa 25

3.3.5 Kháng sinh đồ 25

3.3.6 Các chỉ tiêu theo dõi 27

3.3.7 Xử lý số liệu: 27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 KẾT QUẢ THU THẬP E COLI 28

4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỨC ĐỘ MẪN CẢM CỦA E COLI VỚI CÁC LOẠI KHÁNG SINH THỬ NGHIỆM 31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 KẾT LUẬN 38

5.2 ĐỀ NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

I Tài liệu trong nước 39

II Tài liệu nước ngoài 42

PHỤ LỤC 43

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các kháng sinh cấm sử dụng trong thú y 8 Bảng 2.2.Các kháng sinh hạn chế sử dụng trong thú y 9 Bảng 2.3 Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn chuẩn (Quinn và ctv, 1998) 17

Bảng 4.1: Kết quả phân lập E coli trên một số môi trường sinh hóa 28 Bảng 4.2: Mức độ mẫn cảm của E coli với từng loại kháng sinh thử nghiệm 31

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 E coli dưới kính hiển vi quang học 4

Hình 2.2 E coli dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 3.1 12 loại kháng sinh được đặt trên 2 đĩa petri chứa môi trường MHA 26

Hình 4.1 Khuẩn lạc E coli đặc trưng trên môi trường EMB 28

Hình 4.2 Khuẩn lạc E coli trên môi trường Rapid’E coli 29

Hình 4.3 Khuẩn lạc E coli mọc trên môi trường thạch NA sau 370C/ 24h 30

Hình 4.4 Kết quả thử IMViC của khuẩn E coli trên từng loại môi trường 30

Hình 4.5 Vòng vô khuẩn của 12 loại kháng sinh trên 2 đĩa petri sau 24h/370C 32

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Quy trình phân lập E coli trong phòng thí nghiệm Kiểm Nghiệm Thú Sản

và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi 24

Biểu đồ 4.1 Tỉ lệ nhạy cảm của E coli với 12 loại kháng sinh 32 Biểu đồ 4.2 Tỉ lệ đề kháng của E coli với 12 loại kháng sinh 35 Biểu đồ 4.3 Tỉ lệ mẫn cảm ở mức trung gian của E coli với 12 loại kháng sinh 36

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cũng giống như các nước khác trên thế giới, ở Việt Nam hiện nay bệnh do

Escherichia coli (E coli) gây ra vẫn luôn là vấn đề nhức nhối đối với các nhà chăn

nuôi (Nguyễn Ngọc Hải, 1999) Ở nước ta, do điều kiện khí hậu nhiệt đới, cộng với điều kiện chăn nuôi còn kém và thức ăn nước uống bị ô nhiễm là điều kiện rất thuận

lợi cho quá trình sinh sôi và phát triển của các mầm bệnh, trong đó có E coli Bệnh do

E coli là một trong những bệnh gây nên thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi heo, đặc biệt là E coli gây phù đầu và tiêu chảy trên heo con vì làm chết heo, giảm

tăng trọng, làm tăng chi phí phòng, chữa và chẩn đoán bệnh

Về khía cạnh sức khỏe của con người, trong những năm gần đây, Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng và cả nước nói chung đã xảy ra rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm Nguyên nhân chủ yếu là do thức ăn bị ô nhiễm, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Trong những nguyên nhân đó, quan trọng nhất là do thực phẩm bị nhiễm vi

sinh vật như Salmonella, Vibrio, E coli, Staphylococcus…mà trong đó E coli đóng

vai trò khá phổ biến, nhất là những chủng có khả năng sinh độc tố tác động lên hệ thống tiêu hóa của người và động vật (Chi cục Thú y Tp HCM, 2008)

Dùng kháng sinh để khống chế các mầm bệnh do vi khuẩn là một việc khá phổ biến trong chăn nuôi Tuy nhiên, việc dùng kháng sinh một cách thái quá có thể dẫn

đến sự đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn, trong đó có E coli Vì vậy, hiểu biết về mức độ mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli vấy nhiễm trong thịt

heo sẽ góp phần định hướng việc dùng kháng sinh cho người chăn nuôi và là một thông tin hữu ích cho các cơ quan quản lí thực phẩm cũng như người tiêu dùng nhằm

hạn chế việc lan truyền các chủng E coli kháng thuốc cho cộng đồng

Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự đồng ý của Khoa Chăn nuôi Thú Y, Bộ môn Nội Dược, với sự hướng dẫn của TS Võ Thị Trà An và BSTY Nguyễn Thanh

Tùng, chúng tôi thực hiện đề tài “Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập

từ thịt heo ở Tp Hồ Chí Minh”

1.2 MỤC ĐÍCH

Tìm hiểu mức mẫn cảm của vi khuẩn E coli đã được Chi cục Thú y Tp Hồ Chí

Minh phân lập từ thịt heo đối với một số kháng sinh thường dùng, để từ đó góp phần cho công tác phòng, chống bệnh và hạn chế lan tràn đề kháng kháng sinh

1.3 YÊU CẦU

Kiểm tra và định danh các chủng E coli mà Chi cục Thú y Tp Hồ chí Minh đã

phân lập được từ thịt heo trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh

Thử kháng sinh đồ các chủng E coli thu thập được đối với một số kháng sinh

Loài: Escherichia coli

Vi khuẩn E coli còn có tên gọi là Bacterium coli, được Escherich phát hiện

năm 1883 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên,1999)

Các nhóm vi khuẩn này có mặt thường xuyên trong ruột của người và động vật,

ở phần cuối của ruột non hoặc ở ruột già Ở người, cũng như ở các động vật máu nóng khác, các nhóm vi khuẩn này khu trú trong ruột ngay từ những giờ đầu tiên sau khi thú được sinh ra Chúng chiếm 80% trong thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột (Intervet, 1981) Người ta còn thấy vi khuẩn ở trong đất, nước và không khí do vi khuẩn theo phân ra ngoài

2.1.2 Hình thái, sức đề kháng và khả năng mẫn cảm với kháng sinh

2.1.2.1 Hình thái và sức đề kháng (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 1999)

E coli là trực khuẩn Gram âm có kích thước khoảng 2-3µ × 0,5µ, di động nhờ

các tiêm mao, không tạo bào tử, có giáp mô

E coli bị tiêu diệt ở 60oC trong 15-30 phút, 95% bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ Chúng có thể sống ở điều kiện ngoại cảnh từ vài tuần đến 1 tháng, chủng

có độc lực có thể tồn tại 4 tháng

Các chất sát trùng như formol, acid fenic 1%, HgCl2, NaOH 2% có thể diệt E coli trong 5 phút

2.1.2.2 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh

Về mặt lý thuyết, E coli mẫn cảm với các kháng sinh nhóm β-lactam (trừ

penicillin G và penicillin V), nhóm aminoside, nhóm polypeptide (colistin), nhóm tetracycline, nhóm sulfonamide, nhóm quinolone và nhóm phenicol (Nguyễn Như Pho,

2001) E coli bị tiêu diệt bởi kháng sinh khi chúng còn nhạy cảm với kháng sinh đó

Vì vậy, để điều trị có hiệu quả, người chăn nuôi nên làm kháng sinh đồ để biết E coli

có nhạy cảm với kháng sinh đó hay không

2.1.3 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn E.coli

E coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi Chúng có thể sinh trưởng ở

nhiệt độ 15 - 40oC, nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37oC, pH từ 6,4 - 7,4 Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ cho khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục, đường kính khoảng 2 - 3 mm Để lâu vi khuẩn tự thay thế khóm S bằng khóm R, khô

dẹt, rìa hơi nhăn E coli không gây tan chảy trên thạch gelatin Trên thạch máu có chủng E coli gây dung huyết, có chủng không Trong canh dinh dưỡng chúng tạo vẩn

đục đều sau lắng cặn, mùi phân thối, một số tạo váng mỏng

Các môi trường có thể dùng để chẩn đoán phân biệt E coli bao gồm: môi

trường EMB (Eosin Methylen Blue) tạo khuẩn lạc màu tím ánh kim; môi trường MCK (Mac Conkey) cho khuẩn lạc đỏ hồng; môi trường BGA tạo khuẩn lạc màu vàng; môi trường TSI (hoặc KIA) thì cho acid/acid (vàng/vàng); trên môi trường Rabit’ E coli

cho khuẩn lạc màu tím hoặc đỏ hồng

2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên

E coli có cấu trúc kháng nguyên gồm kháng nguyên thân O, kháng nguyên

lông H, kháng nguyên capsule K và kháng nguyên lông bám (pili) F (Tô Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 1999)

Chúng có khoảng trên 160 loại kháng nguyên thân O, là kháng nguyên chịu nhiệt Cấu tạo gồm hỗn hợp lipid, polisaccharide và protein Lipid xác định độc tính colitoxin, polysaccharide xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính chất kháng nguyên Kháng nguyên O được chia làm 4 nhóm lớn gồm OI, OII, OIII, OIV với 150 loại kháng nguyên đơn giá

E coli có khoảng 20 loại kháng nguyên lông H từ H1-H20, chúng được cấu tạo

từ những loại protein tự nhiên, là loại kháng nguyên chịu nhiệt, bị phá hủy bởi cồn

Chúng rất có ý nghĩa trong việc chẩn đoán E coli

E coli có hơn 100 loại kháng nguyên K, có đặc thù là polysaccharide, là loại

kháng nguyên chịu nhiệt kém, dễ bị phá hủy ở 100oC trong 1 giờ Kháng nguyên K gồm có 4 nhóm kháng nguyên là A, B, L, M Các kháng nguyên này có tính ngưng kết chéo với kháng nguyên thân O nên khi tiến hành thử ngưng kết phải đun sôi để khử kháng nguyên K Kháng nguyên K cũng được xếp vào nhóm kháng nguyên lông bám (yếu tố kết dính) như K88 trên heo

Kháng nguyên lông bám (pili) F hiện diện trong một số chủng E coli gây bệnh,

lông bám giúp chúng bám chặt lên niêm mạc ruột và tiết độc tố gây bệnh Có 2 loại pili là pili mềm (fibrillae) và pili cứng (fibriae) Trên pili mềm gồm có F5, F4, F11…Trên pili cứng có nhân tố F6 còn gọi là kháng nguyên 897P

2.1.5 Độc tố

E coli có khả năng tạo ra hai loại độc tố là nội độc tố (endotoxin) và ngoại độc

tố (exotoxin) Nội độc tố là yếu tố gây độc chủ yếu của E coli Nội độc tố có bản chất

là polysaccharide-protein-lipid thuộc về kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao với các chủng của serotype Đây là loại độc tố chịu nhiệt, không bị mất tính độc lực ở 100oC trong 30 phút Trong khi đó, ngoại độc tố của E coli có bản chất là

protein, là một chất không chịu nhiệt bị phá hủy ở 56oC trong vòng 15-20 phút

Độc tố đường ruột gồm có 2 loại là LT (heat labile toxin) và ST (heat stable toxin) Độc tố LT là một loại độc tố không bền với nhiệt, bất hoạt ở 60oC trong 15 phút, có trọng lượng phân tử cao và có khả năng gây miễn dịch tốt LT gồm 2 loại là LTa và LTb có tính chất kháng nguyên mạnh Độc tố ST là loại độc tố chịu nhiệt, không bị bất hoạt ở 100oC trong 15 phút, có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng sinh miễn dịch kém Độc tố ST cũng có 2 loại là STa và STb có tính chất kháng nguyên yếu

Ngoài ra, E coli còn tiết ra một số độc tố khác như độc tố thần kinh (verotoxin

hay vasotoxin) có tính chất kháng nguyên Đây là độc tố gây bệnh phù

2.2 PHÂN LOẠI E COLI

Các chủng E coli ở người được chia thành 6 nhóm khác nhau: ETEC (Enterotoxingenic E coli: E coli sinh độc tố ruột), EPEC (Enteropathogenic E coli:

E coli gây bệnh đường ruột), EHEC (Enterohaemorrhagic E coli: E coli gây xuất huyết đường ruột), EAEC (Enteroaggregative E coli: E coli kết tập ở ruột), EIEC (Enteroinvasive E coli: E coli xâm lấn niêm mạc ruột), DAEC (“Diffuse- Adhering” E coli) Ở gia súc các chủng E coli gây bệnh được xếp vào 4 nhóm: ETEC, EPEC, EHEC và AEEC (Attaching and Effacing E coli: E coli kết dính và phá hủy tế bào thượng bì ruột) Đối với các chủng E coli gây bệnh trên heo, người ta

chỉ phát hiện được các chủng tương tự như ETEC, EHEC và AEEC (Nguyễn Ngọc Hải, 1999)

ETEC là nhóm E coli gây tiêu chảy ở heo sơ sinh và cai sữa ETEC gây bệnh

bằng cách tiết ra 2 loại độc tố kém chịu nhiệt (LT) và độc tố chịu nhiệt (ST) Phần lớn các chủng ETEC gây tiêu chảy heo con cai sữa được định danh là nhờ sự có mặt của các kháng nguyên thân O8, O9, O71, O115, O138

EPEC là loại E coli gây tiêu chảy cổ điển ở trẻ em dưới 2 tuổi, thường gặp các

serotype O26, O44, O55, O114…Ở heo, bệnh thường gặp trên heo lớn

EIEC gồm những dòng không sinh enterotoxin, xâm nhập và nhân lên ở tế bào biểu mô colon rồi đến tế bào kế cận, gây tiêu chảy có máu hoặc không

Những E coli thuộc nhóm EHEC sản sinh độc tố verotoxin là tác nhân gây nên

viêm ruột xuất huyết và hội chứng urê huyết - xuất huyết ở người, chứng tiêu chảy và

bệnh phù ở heo Các chủng E coli gây xuất huyết gồm O26:H11, O103, O104, O111

và O157:H7 ở người và O138, O139, O141 trên heo (Nguyễn Ngọc Hải, 1999; Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 1999)

2.3 KHÁNG SINH VÀ SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH

2.3.1 Khái niệm và phân loại

Kháng sinh là tất cả các chất hóa học, không kể nguồn gốc (chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp) có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt lên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi sinh vật (Võ Thị Trà An, 2007)

Dựa trên cấu trúc hóa học, người ta phân loại kháng sinh như sau

Nhóm beta-lactam gồm penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin…

Nhóm aminoglycoside gồm streptomycin, kanamycin, gentamicin, neomycin, spectinomycin…

Nhóm tetracycline gồm tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, doxycycline…

Nhóm phenicol bao gồm chloramphenicol, thiamphenicol, florphenicol…

Nhóm sulfonamide gồm sulfadiazine, sulfadimerazine, sulfadimidine, sulfapyridine…

Nhóm macrolide gồm spiramycin, tylosin, erythromycin, tiamulin

Nhóm quinolone gồm oxolinic, flumequin, norfloxacin, enrofloxacin, acid nalidixic…

Nhóm polypeptide gồm colistin, polymyxin, bacitracin…

Nhóm nitro-imidazoles gồm dimetridazol, ronidazol…

Nhóm nitrofuranes gồm furaltadone, furazolidone…

1 Chloramphenicol (Tên khác Chloromycetin; Chlornitromycin; Laevomycin,Chlorocid, Leukomycin)

2

Furazolidon và dẫn xuất của nhóm Nitrofuran (Nitrofuran, Furacillin,

Nitrofurazon, Furacin, Nitrofurantoin, Furoxon, Orafuran, Furadonin,

Furadantin, Furaltadon, Payzone, Furazolin, Nitrofurmethon, Nitrofuridin, Nitrovin)

3 Dimetridazole (Tên khác: Emtryl)

4 Metronidazole (Tên khác: Trichomonacid, Flagyl, Klion, Avimetronid)

5 Dipterex (Tên khác: Metriphonat, Trichlorphon, Neguvon, Chlorophos, DTHP); DDVP (Tên khác Dichlorvos; Dichlorovos)

Bảng 2.2 Các kháng sinh hạn chế sử dụng trong thú y

1 Improvac (số ĐK: PFU-85 của nhà sản xuất Pfizer Australia Pty Limited)

Đề kháng tự nhiên là hiện tượng một số vi khuẩn luôn luôn không chịu sự tác

động của một số kháng sinh Ví dụ như trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa kháng với penicillin G, tụ cầu vàng Staphylococcus aureus không chịu tác dụng của colistin Một số vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của

kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào như penicillin, cephalosporin,

vancomycin E coli đề kháng tự nhiên với các kháng sinh lincosamide, imidazole và

các kháng sinh thuộc nhóm macrolide

Đề kháng thu được xảy ra do biến cố di truyền làm vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng Đề kháng thu được có thể là do đột biến gen hay do vi khuẩn nhận gen đề kháng

Đột biến gen có thể xảy ra trước hoặc sau khi tiếp xúc với kháng sinh Gồm đột biến một bước và đột biến nhiều bước Trong dạng đột biến một bước, mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc Có thể chỉ sau một lần tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn đã có sức đề kháng rất cao Trong đột biến nhiều bước, mức độ đề kháng có liên quan đến nồng độ kháng sinh và kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại các thể đột biến Vì vậy, ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sẽ cao hơn lần trước

Gen đề kháng sau khi xuất hiện thì sẽ truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn Ngoài ra, gen đề kháng có thể truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức như: vận chuyển chất liệu di truyền như tiếp hợp (conjugation) khi hai vi khuẩn tiếp xúc nhau và truyền cho nhau gen đề kháng qua lông giới tính (sex pili); biến nạp (transformation) khi vi khuẩn đề kháng bị phân giải, chúng giải phóng ra các ADN tự do và những đoạn này xâm nhập vào tế bào

vi khuẩn khác; tải nạp (transduction) nhờ các thực khuẩn thể (phage) mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác (Võ Thị Trà An, 2007)

Sự đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn đã được nghiên cứu và ghi nhận với các cơ chế chủ yếu sau; sản xuất enzyme làm vô hoạt kháng sinh; tạo ra enzyme thay thế cho enzyme mà kháng sinh tác động vào; đột biến ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; sửa đổi điểm tiếp nhận để giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn; đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào giảm; tạo quá nhiều điểm gắn kết với kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2007)

2.3.4 Cơ chế tác động của kháng sinh và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2007)

2.3.4.1 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm β-lactam và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm β-lactam (Võ Thị Trà An, 2007)

Các penicillin ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách can thiệp

vào các enzyme transpeptidase (transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên kết của

chuỗi peptidoglycan) Các enzyme này liên kết với một nhóm protein gọi là PBP (penicillin – binding protein) nằm ở ngoài màng nguyên sinh chất Vì vậy, điểm tác động của các kháng sinh nhóm β-lactam là PBP Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với

một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào (pH môi trường hơi acid gia tăng khả năng này) và khả năng kháng

các enzyme β-lactamase Ngoài ra, β-lactam không chỉ ức chế những kết nối cuối

cùng của peptidoglycan trong tổng hợp thành tế bào vi khuẩn mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản ứng tự ly giải hay tự sát của vi khuẩn do hư hại peptidoglycan Mặc dù cho tới nay cơ chế tác động của penicillin chưa hoàn toàn được làm sáng tỏ, nhưng người ta biết rằng các penicillin khác nhau sẽ tác động lên các enzyme khác nhau của quá trình tổng hợp thành tế bào Điều này giải thích một phần

lý do tại sao một số penicillin có tác dụng kháng khuẩn đến một số nhóm vi khuẩn trong khi một số penicillin khác thì không hoặc ít có khả năng này Các loài vi khuẩn khác nhau có các PBP khác nhau và khả năng gắn kết giữa các penicillin với các PBP cũng khác nhau (Võ Thị Trà An, 2007)

Sự đề kháng với các kháng sinh của nhóm β-lactam chủ yếu là do sự hiện diện

của enzyme β-lactamase làm hư hỏng vòng lactam hoặc sự hiện diện của các enzyme

thay thế nhóm PBP của vi khuẩn mà penicillin không gắn kết được

2.3.4.2 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm aminoglycoside và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm aminoglycoside (Võ Thị Trà An, 2007)

Muốn tác động đến vi khuẩn, trước hết aminoglycoside phải xâm nhập vào tế bào vi khuẩn Tiến trình này chủ yếu là quá trình vận chuyển tích cực cần năng lượng

và oxy Điều này giải thích một số đặc tính liên quan đến phổ tác động và đặc tính dược động học của các kháng sinh nhóm này (vi khuẩn kị khí không nhạy cảm với kháng sinh; tại những mô có nồng độ oxy thấp thì kháng sinh khó phát huy tác dụng;

Ca2+ và Mg2+ cạnh tranh vị trí gắn kết trong quá trình vận chuyển; pH kiềm gia tăng quá trình vận chuyển…) Sau khi vào trong tế bào, aminoglycoside gắn chủ yếu vào tiểu thể 30S của ribosome, chúng có thể gây ngừng quá trình tổng hợp protein hoặc gây đọc sai mã di truyền và tạo ra những protein không hoàn chỉnh hoặc những protein không có chức năng Khác với các kháng sinh tác động lên tiến trình tổng hợp protein, aminoglycoside có tác động sát khuẩn nhanh (trừ spectinomycin) và phụ thuộc vào nồng độ

Hiện nay có 3 cơ chế liên quan đến sự đề kháng kháng sinh của nhóm aminoglycoside: thứ nhất là cơ chế vô hoạt kháng sinh bởi các enzyme; cơ chế thứ hai

là sửa đổi ribosome do đột biến (single – step mutation) ở protein S12 của tiểu đơn vị 30S và thứ ba là giảm sự thẩm thấu kháng sinh vào tế bào Trong đó, sự vô hoạt kháng sinh bởi các enzyme giữ vai trò quan trọng nhất Vi khuẩn có mang yếu tố đề kháng này có thể đề kháng với một hoặc vài kháng sinh nhóm aminoglycoside

2.3.4.3 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm phenicol và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với nhóm phenicol (Võ Thị Trà An, 2007)

Các kháng sinh nhóm phenicol có tác dụng tĩnh khuẩn do ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn Chúng gắn kết với tiểu đơn vị 50S của ribosome tế bào vi khuẩn

và cản trở tiến trình hình thành các chuỗi peptide do phong bế tác động của enzyme

peptidyltransferase Tác động này cũng được ghi nhận đối với tế bào tủy xương của

động vật hữu nhũ

Sự đề kháng với chloramphenicol chủ yếu là do sự bất hoạt kháng sinh bởi

enzyme acetyltransferase Enzyme này được mã hóa bởi gene cat (chloramphenicol acetyltransferase) và có khả năng acetyl hóa 2 nhóm hydroxyl của chloramphenicol Ở

vi khuẩn G-, đề kháng với chloramphenicol còn do đột biến ở chromosome dẫn đến giảm khả năng thẩm thấu của kháng sinh này qua màng tế bào Sự đề kháng thông qua

cơ chế giảm thể hiện porin màng tế bào OmpA và OmpC (outer membrane porin) cũng

đã được phát hiện ở Pseudomonas aeruginosa

2.3.4.4 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm polypeptide và cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm polypeptide (Võ Thị Trà An, 2007)

Các polymyxin có hoạt tính sát khuẩn với phổ kháng khuẩn hẹp Colistin và polymyxin B có tác động sát khuẩn trên vi khuẩn G- vì receptor của chúng là phosphatidyl ethanolamin trên màng nguyên sinh chất chỉ có ở vi khuẩn G- Các polymyxin là những chất hoạt động bề mặt dạng cation với khả năng làm hư hỏng cấu trúc phospholipid của màng tế bào và tăng quá trình thẩm thấu như những chất tẩy Dạng proton hóa của polymyxin có khả năng trung hòa độc tố do các coliform gây ra trong bệnh viêm vú, nhưng dường như chỉ hiệu quả trong giai đoạn đầu

Sự đề kháng của vi khuẩn với các kháng sinh nhóm polypeptide nhìn chung rất hiếm Tuy nhiên đã có một số ghi nhận về sự đề kháng trên vi khuẩn (Võ Thị Trà An, 2007)

2.3.4.5 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm tetracycline và cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm tetracycline (Võ Thị Trà An, 2007)

Các tetracycline có tác dụng tĩnh khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein của

tế bào vi khuẩn Sau khi khuếch tán qua màng tế bào vi khuẩn, một hệ thống vận chuyển tích cực sẽ đưa thuốc vào bên trong nguyên sinh chất Tại đây, các tetracycline gắn kết với tiểu đơn vị 30S của ribosome, sau đó chúng cản trở ARN vận chuyển mang aminoacyl (aminoacyl – transfer ARN) gắn với điểm tiếp nhận trên phức hợp ribosome – ARN thông tin

Có hai cơ chế chính dẫn đến đề kháng thu được với kháng sinh nhóm tetracycline ở vi khuẩn Cơ chế thứ nhất là thông qua hệ thống bơm thoát dòng (Tet A,

B, C, D, E, H, G…), có nghĩa là chuyển kháng sinh từ trong tế bào ra bên ngoài, làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào chất của vi khuẩn Cơ chế thứ hai là thông qua các protein có khả năng bảo vệ ribosome (Tet O, M, Q, X…) từ đó kháng sinh không gắn kết được Các nhân tố đề kháng với tetracycline bằng 2 cơ chế này đã được phát hiện ở cả vi khuẩn G+ và G- Các nhân tố đề kháng với tetracycline hiện diện ở cả chromosome và plasmid của vi khuẩn

2.3.4.6 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone và cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm quinolone (Võ Thị Trà An, 2007)

Cơ chế tác động của nhóm quinolon chưa được biết rõ Tuy nhiên, cơ chế dẫn đến sự đề kháng của vi khuẩn với quinolone là sự thay đổi do đột biến điểm tại các

gene mã hóa cho enzyme ADN gyrase (gyrA, gyrB) hoặc topoisomerase IV (parC, parE, hay grlA, grlB) dẫn đến giảm gắn kết của kháng sinh với enzyme Cơ chế này gặp cả ở vi khuẩn G-, G+, và Mycoplasma spp Những thay đổi ở thành tế bào vi

khuẩn G- dẫn đến giảm hấp thu kháng sinh vào trong tế bào vi khuẩn cũng dẫn đến đề kháng với quinolone Hiện chưa phát hiện cơ chế này ở vi khuẩn G + Ngoài ra, cơ chế

đề kháng thông qua bơm thoát dòng (effux pump) đã được ghi nhận ở Staphylococcus aureus với gene norA mã hóa bơm thoát dòng nhiều loại thuốc hoặc E coli (gene acrAB) Đa đề kháng với nhiều loại hóa chất không liên hệ với nhau về cấu tạo hóa học, kể cả quonolone ở E coli được ghi nhận là do đột biến tại mar (multiple antibiotic

resistance) locus tại chromosome của loài vi khuẩn này

2.3.4.7 Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm sulfonamide và diaminopyrimidine; cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm sulfonamide và diaminopyrimidine (Võ Thị Trà An, 2007)

Sulfonamide đối kháng cạnh tranh với PABA (paraaminobenzoic acid), đây là

một tiền chất để tổng hợp dihydrofolate Sau đó dihydrofolate sẽ được dihydrofolate reductase chuyển hóa thành tetrahydrofolate Tetrahydrofolate tiếp tục tham gia quá

trình tổng hợp nucleotide và sự sinh sản của vi khuẩn Do đó sulfonamide có tác dụng

ức chế sự sinh sản của vi khuẩn Còn diaminopyrimidine thì ngăn quá trình chuyển

hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate bằng cách gắn với enzyme dihydrofolate reductase Từ đó ngăn cản vi khuẩn tổng hợp puridine và ADN Hai loại kháng sinh

này thường phối hợp với nhau để nâng cao tác dụng sát khuẩn

Đề kháng với sulfonamide do đột biến điểm ở chromosome xảy ra chậm và có thể cản trở sự xâm nhập của thuốc vào tế bào vi khuẩn, hoặc tạo thành các enzyme

dihydropteroate không nhạy cảm hoặc sản xuất quá nhiều PABA Đề kháng thông qua plasmid phổ biến hơn với các dihydropteroate synthetase (DHPS) đề kháng với

sulfonamide Đề kháng với trimethorpim qua gene nằm trên chromosome có thể do

việc sản xuất quá mức dihydrofolate reductase, hoặc những đột biến trong gene folA

mã hóa cấu trúc của dihydrofolate reductase, hoặc đột biến gây bất hoạt thymidylate synthetase Đề kháng với trimethoprim thường gặp ở nhóm vi khuẩn Enterobacteriaceae khi chúng thu nhận gene (dfr) mã hóa cho enzyme dihydrofolate reductase đề kháng với trimethoprim do vị trí hoạt động bị biến đổi

2.4 KHÁNG SINH ĐỒ

Kháng sinh đồ là một sự phân tích trong phòng thí nghiệm cho phép xác định hoạt tính của một hoặc nhiều kháng sinh đối với loại vi khuẩn đã phân lập được Người ta có thể làm kháng sinh đồ bằng hai phương pháp là pha loãng hoặc khuếch tán Phương pháp pha loãng được thực hiện trên môi trường lỏng hoặc thạch và là phương pháp định lượng Phương pháp khuếch tán được tiến hành trên môi trường thạch và là phương pháp định tính (Sabin và Dernuet, 1995)

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng lên kết quả kháng sinh đồ pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lên hoạt tính của một vài loại kháng sinh Kháng sinh thuộc họ

aminoside và họ macrolide sẽ tăng hoạt tính trong môi trường acid pH thích hợp cho kháng sinh đồ là từ 7,2 - 7,4

Độ dày của thạch trong đĩa petri cũng là một yếu tố quan trọng để cho kết quả chính xác trong phương pháp khuếch tán trên thạch do nồng độ kháng sinh khuếch tán

từ các đĩa kháng sinh sẽ thay đổi theo độ dày của thạch Độ dày của thạch trên môi trường Mueller - Hinton là 4 mm (25 - 30 ml thạch/đĩa Petri 90 mm)

Để kháng sinh có thể khuếch tán tốt trên môi trường thạch rắn thì môi trường không được mất nước Vì vậy, sau khi môi trường được chuẩn bị xong phải được giữ ngay trong túi nhựa ở 2 - 8oC và sau khi dàn vi khuẩn lên đĩa phải kèm theo một đĩa nước cho vào tủ ấm

Nồng độ vi khuẩn có ảnh hưởng quan trọng đến kết quả kháng sinh đồ vì vậy canh khuẩn phải dựa theo độ đục của ống Mc Farland 0,5 để đạt nồng độ vi khuẩn 1 - 3×108 vi khuẩn/ml

Tính bền vững của kháng sinh trong suốt quá trình nuôi cấy giữ một vai trò quan trọng trong việc thực hiện kháng sinh đồ Ví dụ, tetracycline (ở 37oC) đã mất đi 80% hoạt tính trong 24 giờ Do đó, các đĩa kháng sinh thường được giữ ở 4 oC và để trở lại nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

Khi lựa chọn kháng sinh cho kháng sinh đồ, người ta phải nắm được các yếu tố

về vi sinh vật phân lập được, về lâm sàng học, về dược lý học và cả về dược động học của kháng sinh cần lựa chọn Khi lựa chọn một kháng sinh để làm kháng sinh đồ cần chú ý những điểm sau (Sabin và Dernuet, 1995):

Các dữ liệu dịch tễ đặc thù nơi lấy mẫu của vi khuẩn phân lập được, nghĩa là vi khuẩn này có thường được phân lập thấy ở vùng đó không và khả năng nhạy cảm hoặc sức đề kháng của vi khuẩn này trước đây ở khu vực đó như thế nào

Cách sử dụng kháng sinh ở khu vực đó và giá cả của nó ra sao

Xem xét kỹ chức năng và dược động học của kháng sinh cần lựa chọn

Cần giới hạn số kháng sinh lựa chọn và có thể chỉ lựa chọn đại diện theo nhóm

họ hoặc có phổ hoạt tính tương tự nhau.Cách chọn các kháng sinh để kiểm tra mức độ mẫn cảm của các họ kháng sinh như sau: (Quinn và ctv, 1998)

Nhóm tetracycline: tetracycline có thể dự đoán kết quả cho tất cả các kháng sinh trong nhóm tetracycline

Sulphisoxazole là một kháng sinh thích hợp đại diện cho nhóm sulphonamide

Nhóm macrolide: erythromycin có thể đại diện cho các kháng sinh khác trong nhóm macrolide

Kháng sinh clindamycin có thể dự đoán kết quả cho lincomycin

Đối với nhóm aminoglycoside và quinolone thì nên được kiểm tra riêng biệt cho từng kháng sinh trong mỗi nhóm Các kháng sinh trong mỗi nhóm không có quan

hệ gần gũi đủ để đại diện kết quả cho các kháng sinh khác trong mỗi nhóm

Chloramphenicol thì cũng nên được kiểm tra riêng biệt

Đối với nhóm penicillin: penicillin G có thể dự đoán kết quả ampicillin,

amoxicillin và các acylamino – penicillin cho các chủng Enterococus faecalis

Cephalothin có thể đại diện kết quả cho cefaclor, cephapirin, cefazolin, cephradine, cephalexin và cefadroxil Cefatozime thì đại diện cho ceftazidime, ceftizoxime và ceftriaxone

Bảng 2.3 Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn chuẩn (Quinn và ctv, 1998)

Môi trường MHA (mm)

hóa

Hàm lượng

Bt

10 20/10

2.5 LƯỢC DUYỆT MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ SỰ MẪN CẢM

VỚI KHÁNG SINH CỦA E COLI

Tình hình đề kháng kháng sinh của E coli trong thời gian gần đây rất biến đổi

Sự đề kháng thay đổi không những theo thời gian mà còn theo địa điểm Trong cùng một năm, ở những địa điểm khác nhau (các trại khác nhau, các địa phương khác nhau)

thì sự đề kháng của E coli cũng rất khác nhau Nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng

kháng sinh một cách lạm dụng và không đúng nguyên tắc của các nhà chăn nuôi

2.5.1 Một số công trình nghiên cứu trong nước

2.5.1.1 Trên gia súc

Nguyễn Ngọc Hải (1999) đã phân lập vi khuẩn từ 135 mẫu hạch bạch huyết màng treo ruột lấy từ những con heo có bệnh tích của bệnh phù ở khu vực Biên Hòa và Thủ Đức Kết quả cho thấy 100% chủng đề kháng với ceftriaxone, cephalexin,

bactrim; 71,4% đề kháng với colistin (đặc biệt chiếm 43 trong 48 gốc E coli phân lập

ở Thủ Đức); 84,6% nhạy cảm với gentamicin (ở cả 2 khu vực); 7,7% nhạy cảm với kanamycin

Huỳnh Công Tuấn (2000) đã phân lập và giám định vi khuẩn E coli từ phân của những heo cai sữa có triệu chứng tiêu chảy điển hình bị nghi ngờ do E coli Với

100 mẫu phân được lấy ở 4 trại heo thuộc địa bàn Tp Hồ Chí Minh, kết quả cho thấy

các gốc vi khuẩn E coli phân lập được nhạy cảm nhất với kanamycin (72,6%) và

ciprofloxacin (71,9%), kế đến là colistin (64,5%) và gentamicin (58,1%) Chỉ có 30,7% gốc vi khuẩn phân lập được nhạy cảm với chloramphenicol, 17,8% nhạy cảm với ampicillin và 3,2% nhạy cảm với tetracycline Không có kháng sinh nào mất tác

dụng hoàn toàn với vi khuẩn E coli, các chủng E coli phân lập được đề kháng mạnh

với tetracycline (96,8%), ampicillin (82,2%) và chloramphenicol (69,3%)

Trần Sỹ Trung (2000) cũng đã phân lập và giám định E coli trên heo con theo

mẹ tiêu chảy và thử khả năng nhạy cảm của chúng đối với một số kháng sinh Vi

khuẩn được phân lập từ 80 mẫu phân của những heo con tiêu chảy đặc thù do E coli ở trại heo Đồng Hiệp và trại heo Nam Hòa Kết quả cho thấy ở cả hai trại E coli nhạy

cảm nhất với norfloxacin (83%) và nitrofurantoine (75%) Các kháng sinh còn lại có tỉ

lệ đề kháng rất cao như colistin (68,7%), bactrim (80,1%), chloramphenicol (62,5%),