Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ fish

Là kĩ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn. Nhận ra các dạng vsv quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu. Xác định các vsv lạ, chưa biết rõ điều kiện môi trường nuôi cấy. Hệ thống phức tạp của các quần thể sinh vật. Kết hợp chính xác kĩ thuật di truyền phân tử . Hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn

Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish

 Là kĩ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn.

 Nhận ra các dạng vsv quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu.

 Xác định các vsv lạ, chưa biết rõ điều kiện & môi trường nuôi cấy.

 Hệ thống phức tạp của các quần thể sinh vật.

 Kết hợp chính xác kĩ thuật di truyền phân tử

 Hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh.

Mô tả quần thể vsv trong môi trường tự nhiên ( nổi bật trần tích Wadden, vịnh na-uy……).

Trong y học: xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (hô hấp, tiêu hóa,….).

Chuẩn đoán sự bất thường về cấu trúc và số lượng NST ( trước và sau sinh) của thai nhi.

Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish

Quy trình thực hiện

• Dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vsv bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc biệt với các trình tự đặc hiểu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn ( không cần phá vỡ tế bào)

• Chuẩn bị mẫu và đầu dò.

• Cố định mẫu

• Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào

• Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai

• Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang

• trực tiếp)

• Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả

Quy trình gồm các bước cơ bản

Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang

Gần đây các trình tự đích khác như rRNA 23s,rRNA 18s hay mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm Fish.

rRNA 16 S được sử dụng vì ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều và cấu trúc dc bán bảo toàn

đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác

Đánh dấu huỳnh quang lên đầu dò

Trực tiếp: thuốc nhuộm huỳnh quang

• Đặc điểm quang trọng: các chất huỳnh quang có mức năng lượng kích thích và phát xạ khác nhau

-> cho phép phát hiện đồng thời 2 hay nhiều vsv khi chỉ lai 1 lần duy nhất

Quy trình thực hiện

• Mục đích: đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm ngược vào tế bào, giữ lại tối đa số

lượng trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng

• Hình thức: ngâm mẫu trong các hợp chất tạo tủa ethanol hoặc methanol

• Yêu cầu: kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung

với chúng với số lượng lớn nhất

B1:Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ

B2: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu

1. Xử lý bề mặt kính: phủ lớp chất tráng kính ngoài (gelatin/poly-L-lysine/các hc tạo muối)

2. Các tế bào sau giai đoạn xử lý cố định vào mặt kính

3. Điều kiện: môi trường tối ẩm,

B3: quan sát và xử lý tín hiệu

• Kính hiển vi có trang bị dải lọc nhiều tần

( hoặc kính hiển vi laze quét đồng tiêu)

• Máy ảnh CCD

• Phần mềm xử lý ảnh kĩ thuật số

Nhược điểm kỹ thuật Fish

Kết quả không chính xác

Các chất tự phát huỳnh quang

Đầu dò thiếu tính đặc hiệu

Không thu được kết quả

Số lượng đầu dò quá ít

Cấu trúc của đầu dò hay trình tự đích quá phức tạp

Hàm lượng RNA quá thấp

Ảnh chụp bị mất màu

Ứng dụng của Fish

Fish được sử dụng trên toàn thế giới để nghên cứu các quần thể vi khuẩn trong

tự nhiên như môi trường dưới nước,trong đất hay trên bề mặt rễ thực vật

Vd: Khi sử dụng fish để phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà Lan

Loại vi khuẩn có hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA

 Vi khuẩn cộng sinh

Sử dụng rRNA 16S để định danh và phân cấp phát sinh loài Dùng FISH để chứng minh tính chất cộng sinh của vi khuẩn

Hệ vi sinh vật trong nước thải

Fish sử dụng các đầu dò oligonnucleotide được tạo ra bằng những kĩ thuật phân tử PCR để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong nướn thải, bùn hoạt tính

Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida albicans(Moter et al., 2000)

Sự đa dạng của vsv

Ứng dụng trong y học

 Nghiên cứu các quần thể vi khuẩn phức tạp trong cở thể người và động vật.

dạ dày khoang miệng phổi

Hình 6 nhuộm hình quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng (a) lai với các huỳnh quang đầu dò vi khuẩn EUB338 gắn nhân FITC (b) lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh lá cây)và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng)

 Phát hiện vi khuẩn xoắn trong khoang miệng

Nghiên cứu và phát hiện các bệnh có nguồn gốc từ nấm Candida đối với các mầm bệnh suy giảm miễn dịch

Xác định chính xác các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật và thực vậtđể từ đó kiểm soát và triệt tiêu mầm

bệnh này

Khoai tây mục héo và hóa nâu do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Penaeus vannamei

gây bệnh tôm trắng

Triển vọng của FISH

 Tại Việt Nam

• FISH còn hạn chế sử dụng, chủ yếu là ứng dụng chẩn đoán các bệnh về di truyền:

• Việc chẩn đoán trước sinh và sau sinh những bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể của thai nhi.

• Phát hiện các mất đọa nhỏ một số hội chứng di truyền.

• Xác định đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc.

• Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư.

 Tại Việt Nam

• Việc phát triển kỹ thuật FISH ở Việt Nam trong tương lai có nhiều triển vọng vì đầu tư cho kĩ thuật này phù hợp với điều kiện kinh tế và khoa học kĩ thuật của nước ta