Công nghệ vi sinh

Công nghệ Sinh học Vi sinh là một ngành mũi nhọn của Công nghệ sinh học, tuy nó được hình thành muộn hơn so với nhiều môn sinh học khác nhưng do ý nghĩa quan trọng của nó về mặt lý luận cũng như thực tiễn nên đã phát triển hết sức nhanh chóng.

LỜI MỞ ĐẦU

Công nghệ Sinh học Vi sinh là một ngành mũi nhọn của Công nghệsinh học, tuy nó được hình thành muộn hơn so với nhiều môn sinh học khácnhưng do ý nghĩa quan trọng của nó về mặt lý luận cũng như thực tiễn nên đãphát triển hết sức nhanh chóng

Công nghệ Sinh học Vi sinh là môn khoa học nghiên cứu những hoạtđộng sống của vi sinh vật nhằm khai thác chúng tốt nhất vào các quy trìnhsản xuất ở quy mô công nghiệp

Những tiến bộ của công nghệ sinh học vi sinh ngày càng xâm nhập sâutrong mọi lĩnh vực hoạt động của con người Từ những sản phẩm lên mentruyền thống đã quen thuộc với con người từ lâu và được sử dụng hàng ngày:sữa chua, giấm, bia… đến các sản phẩm công nghệ cao: thực phẩm chứcnăng, prebiotic, probiotic, công nghệ sinh học nano… đều có sự góp mặt củacông nghệ vi sinh

Sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ và điện tử hóa các thiết

bị cho sản xuất vi sinh đã đưa đến một bước nhảy vọt trong nuôi cấy vi sinhvật công nghiệp Tuy nhiên, để khai thác tối đa tiềm năng của vi sinh vậtphục vụ đời sống con người cũng như thiết kế được các quy trình công nghệphù hợp với chúng, cần hiểu rõ các nguyên lí cơ bản trong Công nghệ sinhhọc vi sinh vật Để từ đó đưa đến một cái nhìn tổng quan về các bước trongnguyên lí cũng như hiểu rõ vai trò của từng khâu trong quá trình sản xuất.Qua đó, tùy trong điều kiện cụ thể sản xuất, có thể thiết kế thiết bị phù hợp,đưa ra các biện pháp khắc phục sự cố và tập trung vào khâu có vai trò quyếtđịnh đến sản phẩm nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt nhất

Một quy trình lên men cổ điển được tiến hành theo 5 giai đoạn chính sau:

Một số khâu chính trong quy trình lên men:

I Giống Vi sinh vật

Trong lên men công nghệ, ngoài điều kiện cần có một quy trình côngnghệ hợp lý thì vấn đề giống là khâu quan trọng, quyết định giá trị kinh tế củamột quy trình sản xuất

Trong công nghệ lên men, người ta sử dụng một phổ rộng gồm nhiềuloại vi sinh vật thuộc nhóm Prokaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam) vàEukaryote (nấm men, nấm mốc, tảo)

Hình 1 Một số hình ảnh về các chủng giống vi sinh vật

a Nấm men b Nấm mốc

1 Tiêu chuẩn của giống

Một chủng vi sinh vật được coi là chủng giống tốt phải hội tụ nhiềuđặc điểm ưu việt Trước hết chủng phải có năng suất sinh tổng hợp một chất

2 Chế tạo môi trường

nào đó hay tạo sinh khối với hiệu suất cao, đồng thời phải có thêm một số đặcđiểm sau:

- Có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như cácphu phẩm, các nguyên liệu thô…

- Trong quá trình lên men không tạo các sản phẩm phụ không mongmuốn đôi với nhà sản xuất

- Ít mẫn cảm với sự tạp nhiễm do vi sinh vật khác và phage

- Có sản phẩm hay sinh khối dễ dàng tách dễ dàng khỏi môi trườngdinh dưỡng

Tuy nhiên không phải các tiêu chuẩn trên luôn gắn liền với nhau vàcùng tồn tại ở cùng một đối tượng vi sinh vật nào đó Các vi sinh vật thuộcnhóm Eukaryote hầu hết có kích thước tế bào lớn hay đa bào dạng sợi, do đó

dễ tách chúng khỏi môi trường dinh dưỡng rất dễ dàng bằng phương pháplọc, ly tâm thông thường, song ở chúng thường tồn tại kích thước tế bào tỉ lệnghịch với hoạt tính trao đổi chất

Việc chọn giống vi sinh vật cho một quy trình công nghệ là điều hếtsức quan trọng Để có một giống vi sinh vật có hoạt tính cao, người ta phảihoàn thiện genotype với các phương pháp: chọn lọc, lai tạo, gây đột biếntrong vật chất di truyền của tế bào hoặc trong hệ thống trao đổi chất Trongvài thập niên gần đây, con người đã sử dụng các phương pháp kỹ thuật ditruyền hiện đại để tạo các chủng giống có những tính chất mong muốn mộtcách chủ động Rõ ràng việc hoàn thiện genotype của chủng giống là mộtviệc làm không có điểm dừng và phải làm thường xuyên Chính vì vậy cácchủng giống dùng trong sản xuất có tính chất ngày một hoàn hảo hơn, đápứng ngày một tốt hơn các yêu cầu của con người

2 Các công việc chủ yếu của công tác giống trong sản xuất

Trong sản xuất, việc hoạt hóa giống, thường xuyên kiểm tra chất lượngcủa giống là quan trọng Phòng kĩ thuật của xí nghiệp lên men phải làm

- Kiểm tra độ thuần khiết của giống trong lên men

- Kiểm tra khả năng hồi biến của giống

- Hoạt hóa giống sau một thời gian sử dụng Để hoạt hóa giống người

ta thường dùng môi trường có thành phần giàu chất kích thích sinh trưởngnhư dịch cao nấm men, nước chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, acid béo(Tween- 80)

Hầu hết các chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất là những chủng độtbiến (chủng sản hay “khủng hoảng thừa”) Ở các chủng đột biến, khả nănghồi biến (trở về tính chất của chủng gốc) là hiện tượng rất hay xảy ra đặc biệt

là các chủng vi sinh vật thuộc Prokaryote như vi khuẩn, xạ khuẩn (do hệ gentrần), ở vi sinh vật nhân thực, khả năng hồi biến là thấp hơn (do hệ gen ổnđịnh hơn)

- Giữ giống bằng những phương pháp thích hợp để có thể duy trìnhững tính chất cần có của chủng giống

Hiện có các phương pháp chính để giữ giống vi sinh vật như sau:

2.1 Bảo quản trên môi trường thạch, định kì cấy truyền

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản.Quá trình này được lặp lại trong một thời hạnnhất định (thông thường từ 1-6 tháng), đảmbảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đếnmôi trường mới trước khi già và chết Thực tế

có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp vớiphương pháp bảo quản này như:Staphylococci, Coliform có thể sống đượcvài năm Là phương pháp khá phổ biến đượcdùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt làcác chủng đang dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc

lộ nhiều nhược điểm sau:

Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc

Hình 2: Cấy chuyển

Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản.Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với cácchủng bảo quản.

Tốn nhiều công sức để cấy truyền

Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền khôngthích hợp

Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học dođột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền

Các bước tiến hành:

Thuần khiết chủng VSV trên môi trường agar ở đĩa petri, chọn cáckhuẩn lạc điển hình và cấy lên môi trường thạch nghiêng thích hợp, sau đónuôi cấy trong tủ ấm để VSV phát triển bình thường, lấy các ống giống ra vàcho vào tủ lạnh giữ ở 4 0C

Nên cho thêm vào môi trường 0,1 M citrat natri hoặc 0,3M Oxalat đểchống nhiễm Bacteriophage; 1% dầu thực vật như dầu lạc, dầu dừa

Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền thường xuyên, cụthể là hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cholớp thạch chứa môi trường bị khô, người ta thường phủ lên môi trường thạch

đã có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng như paraphin lỏng Lớpparafin này sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật đối với oxygen không khí

và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch Do vậy, ống giống có thểbảo quản một năm mà giống không bị thoái hóa và tạp nhiễm Với phươngpháp này giống có thể bảo quản ở tủ lạnh ở nhiệt độ 4 – 60 C hay ở nhiệt độphòng đều được

Phương pháp này được A.Lumière và J.Chevotier đề nghị đầu tiên năm

1914 và hiện nay đang được sử dụng để bảo quản 73% nấm mốc, 100% xạkhuẩn, 80% nấm men và 73% vi khuẩn Tuy nhiên có một số VSV khôngthích hợp với cách bảo quản dưới lớp dầu khoáng như Aerobacter,

Cách thực hiện:

Cho môi trường agar thích hợp vào 1/3 ống nghiệm thanh trùng ở

121oC/30 phút, lấy ra để nghiêng thạch 450 chờ thạch đông, cấy giống và nuôitrong tủ ấm để VSV phát triển tốt (tuỳ giống) Đổ parafin lỏng vào ốngnghiệm (parafin được thanh trùng 121 0C/30ph, để nguội) cách bề mặt thạchkhoảng 0.5 cm và cách miệng ống 1-2cm Sau đó dùng parafin đặc đun chảy

đổ trên nút bông đem bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8 0C

2.2 Bảo quản trong nước cất

Làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật trên thạch Nuôi cấy vi sinh vậttrong thời gian phù hợp Cắt phần thạch chứa vi sinh vật nuôi cấy ra thànhmiếng sau đó được chuyển vào trong các ống nhựa hoặc lọ thủy tinh có chứasẵn nước muối sinh lý vô trùng để bảo quản vi sinh vật

Phương pháp này có thể bảo quản vi sinh vật trong nhiều năm

Nuôi cấy vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường thạchnghiêng hay trên môi trường thạch đĩa

Sau khi vi sinh vật đã phát triển ở một thời gian nhất định tạo thành cáckhuẩn lạc tương đối lớn tiến hành phủ một lớp dầu Glycerol 15% đã vô trùnglên trên ngập khối thạch Sự có mặt của glycerol làm tăng áp suất thẩm thấucủa môi trường, do đó nước được rút từ trong tế bào ra ngoài, do đó, tế bàomất nước song vẫn được bảo quản một cách an toàn trên môi trường

Phương pháp này có thể bảo quản vi sinh vật trong nhiều năm

Do cấu trúc hóa lí, cát và đất sét là những cơ chất tốt mang các tế bào

vi sinh vật – chủ yếu là các bào tử

Cát hoặc đất sét được xử lý qua các khâu làm sạch, sàng lọc qua rây,

xử lý bằng hóa chất để bảo đảm đạt độ trung tính, sấy khô và khử trùng để có

đọ vô trùng tuyệt đối Sau đó bằng thao tác vô trùng trộn bào tử của giống visinh vật cần bảo quản vào cát hay đất sét vô trùng trong các ống nghiệm

Dùng paraphin nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm để giúp cho ốnggiống không bị ẩm trở lại

Phương pháp giữ giống này chủ yếu áp dụng cho các nhóm vi sinh vậtsinh bào tử như nấm mốc hoặc xạ khuẩn

2.5 Giữ giống trên silicagel

- Dùng để bảo quản nấm sợi có bào tử:

- Các bước :

Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạtsilicagel đưa vào không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 °Ctrong 3 giờ Đựng trong lọ có nắp chịu nhiệt

Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng (115OC/20 phút).Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theotừng chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau(10-15 ngày)

Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ốngnghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật

độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịchbào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau)

Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel Chú ýsilicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải đượcthực hiện trong chậu nước đá Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3thể tích hạt silicagel trong lọ Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạtsilicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiếtnhư số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp

Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35 - 40%), 25 0C/1 tuần Vặn chặtnút và quấn giấy parafil giữ trong 4 0C

2.7. Giữ giống bằng phương pháp lạnh sâu

Giữ giống theo phương pháp này dựa trên nguyên tắc ức chế sự pháttriển của vi sinh vật bằng cách đưa chúng vào điều kiện lạnh sâu ở -250 đến-700 C Để bảo đảm rằng tế bào vi sinh vật không bị chết khi bị làm lạnh sâu,người ta cần trộn sinh khối của giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ(dung dịch nhũ hóa) như glyxerin 15% , huyết thah ngựa (loại không chochất bảo quản) dung dịch glucose hoặc lactose 10 % Việc làm lạnh đượctiến hành một cách từ từ Khi độ lạnh đạt -200 C, việc tiếp tục làm lạnh cầnđạt tốc độ 1 - 20 C/ phút

Hình 3: Giữ giống trong tủ lạnh sâuVới phương pháp này cũng cần cấy chuyền và làm lại, nhưng thời giangiữa các lần cấy chuyền được kéo dài hơn phương pháp 1 Thời gian cấychuyền như sau:

Nếu giữ ở t = -150 đến -200C: 6 tháng cấy chuyền và làm lại một lầnNếu giữ ở t = -300C : 9 tháng cấy chuyền và làm lại một lầnNếu giữ ở t = -400C : 1 năm cấy chuyền và làm lại một lầnNếu giữ ở t = -500 đến -600C: 3 năm cấy chuyền và làm lại một lầnNếu giữ ở t = -700C : 10 năm cấy chuyền và làm lại một lần

Phương pháp bảo quản giống này khá đơn giản và tiện lợi, lại cho hiệuquả bảo quản khá cao Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này đượcthực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C,-140°C và -196° C Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp

do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảoquản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấmmen, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut Hiện nay nó là một trong những phươngpháp được sử dụng khá phổ biến để bảo quản giống vi sinh vật

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phươngpháp vạn năng hơn cả Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng visinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng

tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểmnhư đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro cháy nổ

Phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thườngxuyên dùng đến Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng

vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đôngkhô

Hình 4: Giữ giống bằng Nito lỏng

A Bình chứa Nito lỏng

B Ống nhựa nút xoáy đựng giống trong giữ giống bằng Nito lỏng

2.8. Giữ giống bằng phương pháp đông khô

Về nguyên tắc, cách giữ giống này giống với giữ giống bằng lạnhđông, tức vi sinh vật trong quá trình xử lý sẽ được đưa vào nhiệt độ thấp(lạnh sâu) ở t = -600 đến -700C một cách từ từ sự có mặt của chất bảo vệ như:Glutamat 3% hay lactose 1,25 + pepton 1,2% hay Saccharose 8% + sữa 5% +gelatin 1,5%

Điều khác biệt với phươngpháp lạnh đông là: để bảo đảm an toànhơn cho sự sống của tế bào giống,người ta làm thăng hoa phần nước ởtrong tế bào sống và môi trường cóchất bảo vệ trong thiết bị đông khô ở

áp suất 1.10-4 mmHg Hỗn hợp tế bàogiống và dung dịch bảo vệ được chứatrong những ampul thủy tinh có đường kính 15 mm được hàn kín để bảo đảm

độ khô và chân không cần thiết Những ampul này được bảo quản ở nhiệt độ

4 - 60 hay ở nhiệt độ phòng

Phương pháp này được cho là tối ưu, cho hiệu suất bảo quản cao nhất

vì có thể giữ giống vi sinh vật qua hàng chục năm vãn có tỷ lệ sống cao vàkhông bị biến đổi về di truyền, đồng thời chiếm diện tích bảo quản ít nhất

Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển cảu công nghệ gen, phươngpháp giữ giống bằng ngân hàng gen cũng được nghiên cứu áp dụng Tuy cótính ưu việt cao của phương pháp về việc lưu giữ những đặc tính quý hiếmcủa vi sinh vật nhưng phương pháp đòi hỏi phí tổn cho trang thiết bị và kỹthuật còn quá cao

Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô: Đây là khâu quan trọng đánh giákhả độ an toàn cũng như hiệu quả của phương pháp giữ giống Cách làm nàyđược tiến hành như sau:

Hình 5: Bảo quản giống bằng phương

pháp đông khô

Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làmlạnh đột ngột bằng cồn đốt.

Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệmchứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô Hút toàn bộ dịchhuyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước

cất Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi

vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp

và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một

Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên Tuy nhiên, có một

số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu cáckhuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt Mẻ đông khô là thành côngnếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩapetri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật

độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặcchuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi

Mục đích của nhân giống là tăng số lượng tế bào Đồng thời giúp tếbào làm quen dần với môi trường nuôi cấy

Hình 6: Sơ đồ hệ thống nhân giống trong lên men VSV Công nghiệp

1 Nuôi VSV trong hộp Petri, 2 Nhân giống trong ống nghiệp, 3 Một phần

có thể đông lạnh giữ giống, 4 Nhân giống từ ống đông lạnh, 5 Nhân giốngđến quy mô 1m3, 6 Nồi lên men sản xuất 10 m3, 7 Hệ thống kiểm soát

Trong các quy trình lên men, với các đối tượng vi sinh vật khác nhau

sẽ cần giống dưới các dạng khác nhau Thường có 2 dạng giống: tế bào sinhdưỡng và bào tử

- Trường hợp giống là tế bào sinh dưỡng

Để có thể thu được lượng giống là tế bào sinh dưỡng, người ta cần tạođiều kiện môi trường nuôi cấy, thành phần môi trường bảo đảm tối ưu cho sựsinh trưởng nhanh (tức tăng số lượng tế bào, không tạo sản phẩm) Trongtrường hợp này sử dụng phương pháp nuôi cấy dịch thể (nuôi cấy chìm)

- Trường hợp giống làbào tử (đối với xạ khuẩn vànấm mốc): Thông thườngngười ta thực hiện nhân giốngthu bào tử trên môi trường đặc(nuôi cấy bán rắn có cám, bộtbắp, thóc, trấu…)

Người ta nuôi nấm mốc,

xạ khuẩn trong một thời gian dài để tạo bào tử Bào tử được thu hồi bằng

Hình 7: Tủ cấy vô trùng

nhiều cách: dùng máy hút (như hút bụi) hay dùng chổi lông đã tiệt trùng quétlên bề mặt của môi trường bán rắn Bào tử thu được ở dạng khô, được đựngtrong các bình kín có gắn parafin, bảo quản nơi sạch, mát, có thể giữ dùngdần hàng năm.

Tùy theo quy mô của quá trình lên men mà ta có quá trình nhân tế bàogiống với số lượng nhiều, ít khác nhau Quá trình nhân giống vi sinh vật chosản xuất ở quy mô công nghiệp thường được tiến hành qua các bước sau:

+ Giai đoạn phòng thí nghiệm: đây là gai đoạn cấy giống vi sinh vật từống giống thuần khiết vào môi trường dinh dưỡng vô trùng và nuôi chúngtrong điều kiện phòng thí nghiệm

Hình 8: Tủ ấm vi sinh nhân giống trongphòng thí nghiệm

+ Giai đoạn ở xưởng: Nuôi cấy giống ở giai đoạn này được thực hiệnqua một số lần cấy giống từ lượng môi trường ít đến môi trường nhiều dầnnhằm tăng lượng giống thu được – người ta gọi là nhân giống cấp 1,2,3…Tỷ

lệ giống cấy trong nhân giống cũng như trong lên men dao động từ 1 – 10%thể tích môi trường dinh dưỡng tùy từng chủng giống

Điều cần lưu ý: kết thúc khâu nhân giống cần phải kiểm tra số lượng,chất lượng giống trước khi cấy vào nồi lên men

II Chế tạo môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường nuôi cấy và lên men gần giống nhau Thông

so với môi trường lên men, nhưng các thành phần khác thì giàu hơn, đặc biệt

là các chất kích thích sinh trưởng phục vụ cho sinh sản và phát triển củagiống vi sinh vật Môi trường nuôi cấy bề mặt thường là các hợp chất rắn,xốp gồm có: cám,bột và các chất dinh dưỡng Trong sản xuất công nghiệpmôi trường răn được khử trùng bằng hơi nóng trong các thiết bị chuyên dùngvới áp suất dư khoảng 0,05Mpa để đạt được nhiệt độ 104-1100C pH của môitrường được chỉnh bằng các dụng dịch NaOH, HCl, H2SO4, axit lactic, axitaxetic

Hình 9: Các thiết bị thanh trùng môi trường

Chế độ nuôi đặc biệt là nhiệt độ giữa nhân giống và lên men cũng cóthể khác nhau Nếu cùng chế độ nhiệt độ thì không phải quan tâm lắm, nhưngnếu nhiệt độ lên men thấp (như lên men bia) thì phải nhân giống với nhiệt độgiảm dàn để khi vào lên men giống không bị choáng, sốc Chế độ sục khí ởcác giai đoạn này cũng khác nhau, thường thì trong thời gian nhân giống nhucầu về oxi cao như pha sinh trưởng của lên men hoặc cao hơn

III Lên men

Là giai đoạn nuôi vi sinh vật để chúng tạo sản phẩm hoặc là sinh khối

vi sinh vật, hoặc là các sản phẩm trao đổi chất bậc 1,2…Đây là khâu quyếtđịnh kết quả của một quy trình lên men