công nghệ vi sinh - sản xuất protein tái tổ họep trên e.coli

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNGINSULIN Công NGhệ vi sinh Sản xuất protein tái tổ hợp trên E.coli... IV/ Công nghệ sản xuất insulin:Ch

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

INSULIN

Công NGhệ vi sinh

Sản xuất protein tái tổ hợp trên E.coli

5.Huỳnh Thị Thanh Trúc 61003268

I/ Bệnh tiểu đường:

II/ Một số loại insulin trên thị trường:

Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc Thời gian bắt đầu tác dụng

III/ Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất insulin

1 Cấu trúc phân tử insulin: Insulin người là 1 polipeptide

CTHH: C257H383N65O77S6.

Trọng lượng phân tử: 5808

2 Vai trò của insulin:

2 Vai trò của insulin:

 Insulin làm tăng tính thấm của các ion kali, magie và phosphate vô cơ tạo

điều kiện cho quá trình phosphoryl hóa và sử dụng glucose.

IV/ Công nghệ sản xuất insulin:

Charles Best thuộc Đại học tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin

và ứng dụng chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người

Nhược điểm:

+Insulin từ động vật có cấu trúc không hoàn toàn giống insulin người

+ Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin người

+ Khả năng hấp thụ kém

+ Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể

+ Trong quá trinh tách chiết không thể loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh ở động vật.+ Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao

+ Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để sản xuất) => giá thành cao

+ Khó sản xuất lượng lớn với qui mô công nghiệp

V/ Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp trên E.coli:

1 Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp mini proinsulin (MPI):

Bước 1: bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã

hóa proinsulin người trên NST số 11

Bước 2: Tách và thiết kế plasmid tái tổ hợp

- Cắt gen mã hóa proinsulin và plasmid bằng một loại giới hạn Nối bằng ADN ligase của phageT4

- Thiết kế các trình tự mã hóa cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất

- Nếu sử dụng mRNA tách được từ trên tiến hành như sau:

+ Sao mRNA tinh khiết thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT – PCR)

+ Cài đoạn cDNA mã hóa insulin hoàn chỉnh vào plasmid đứng sau một promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli

DNA mã hóa 8 – 12 aa TNF-α và His10

được tổng hợp hóa học.

Cắt bằng NdeI và BamHI

Chèn vào downstream T7 promoter

Biểu hiện trong pET-3a

Gen mã hóa cho proinsulin người PCR (5 DNA overlapping, mỗi đoạn 65 – 68 base như mẫu)

Bước 3: Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện Sau quá trình biến nạp cần chọn lọc những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.

Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó

được đưa vào lên men.

Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng

phương pháp nuôi cấy liên tục, các chất

dinh dưỡng được bổ sung thường xuyên

để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn

theo hàm số mũ Sau 20 phút có hàng

triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên

phân Chỉ sau 1 thời gian ngắn, sinh khối

tăng lên rất nhanh và gen insulin được

tổng hợp

Môi trường: Luria – Bertani

Sơ đồ biểu hiện mini proinsulin trong plasmid pT2M2PI

Bước 5: Tiền tinh sạch

Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt.

+ Dùng enzyme lizozyme phá vỡ màng tế bào sau đó dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit

+ Bằng phương pháp ly tâm lọc và tách được proinsulin.

Bước 6: Hoạt hóa

Hoạt hóa proinsulin vitro (sau tinh sạch ở dạng mạch thẳng) bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4 (tạo phản ứng xoắn cuộn), sau đó dùng enzyme đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin

Khi đó sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết.

+ 50mM glycine buffer  mini proinsulin tinh sạch

(50 µM, 0.375 mg/l)

(bằng 2 lượng mini proinsulin) (18h, 4oC)

Bước 7: Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin

+ Bằng phương pháp sắc ký, tách,

và phương pháp miễn dịch gắn enzyme

2 Sinh tổng hợp insulin theo phương pháp 2 chuỗi:

http://www.bvdkquangnam.vn/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va-cong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hp-.html

http://vi.scribd.com/doc/93630047/G5-miniproinsulin

hop.html

http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/5296-san-xuat-thuoc-bang-cong-nghe-dna-tai-to-The End!