bài giảng công nghệ vi sinh vật

Các giai đoạn phát triển của Công nghệ vi sinh CNVS • Thế hệ 1: Giai đoạn lên men cổ điển – Con người sử dụng các thuộc tính của vi sinh vật một cách thụ động • Thế hệ 2: Từ những năm 30

CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT

BÀI GIẢNG

GV: Nguyễn Thị Kim Cúc

Các giai đoạn phát triển của

Công nghệ vi sinh (CNVS)

• Thế hệ 1: Giai đoạn lên men cổ điển

– Con người sử dụng các thuộc tính của vi sinh vật một cách thụ động

• Thế hệ 2: Từ những năm 30-những năm 60 của

thế kỷ XX

– Mở đầu với việc tìm ra chất kháng sinh penicillin của

Alexander Flemming

• Thế hệ 3: Từ những năm 60 đến nay

– Công nghệ vi sinh đã phát triển thành một ngành độc lập

và là công cụ đắc lực phục vụ cho sản xuất các sản

phẩm cần thiết bằng vi sinh vật

Ứng dụng của Công nghệ vi sinh vật

Công nghệ

vi sinh

CN Thực phẩm, Công nghệ lên men

Trồng trọt, chăn nuôi thú

y và nuôi trồng thủy sản

Y học Môi trường

Ngành Năng lượng

 Hormone tăng trưởng ở người

 Chế phẩm men tiêu hóa

 Chế phẩm thuốc

 Thực phẩm chức năng từ vi khuẩn, vi tảo…

Ứng dụng của CNVS trong y

Nông-Lâm-Ngư nghiệp

 Cải tạo giống cây trồng, vật nuôi

 Chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh vật

 Phân bón vi sinh

 Các chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu EM

(Effective Microorganisms)

 Các chế phẩm probiotics

 Thức ăn chăn nuôi

 Cây trồng, vật nuôi biến đổi gen…

Ứng dụng của CNVS trong ngành năng

lượng và bảo vệ môi trường

 Cồn (ethanol)

 Xăng sinh học

 Khí đốt sinh học

 Chế phẩm vi sinh trong xử lý rác thải hữu

cơ, nước thải và xử lý môi trường…

Ứng dụng của CNVS trong y tế Công

nghiệp thực phẩm và Công nghiệp lên men

 Enzyme

 Rượu, bia và các sản phẩm lên men chứa cồn

 Acid hữu cơ

Đôi điều suy ngẫm về một số ứng

dụng khác của CNVS

 Bom vi trùng: tạo ra các chủng vi sinh

vật có bộ gen tái tổ hợp tiếp nhận những gen gây ung thư, gen kháng kháng

sinh…?

 Những sinh vật biến đổi di truyền

(GMO-Genetically Modified Organisms):

cà chua GM, đậu nành GM, ngô GM, lúa GM…?

Cơ sở hóa sinh và di truyền học của công nghệ vi sinh

Chủ đề 1

Phân loại sản phẩm trong

Phân loại sản phẩm

Sinh khối và Enzyme

 Sinh khối:

 Protein đơn bào (single cell protein)

 Men bánh mì (baker yeast)

 Men tiêu hóa ( lactobacillus, nấm men…)

 Sinh khối vi khuẩn trong chế phẩm thuốc trừ sâu

 Phân bón vi sinh cố định đạm

 Các chế phẩm làm vaccine (vaccine bất hoạt, vaccine giảm hoạt lực…)

 Các chế phẩm vi sinh vật trong xử lý nước nuôi thủy sản, nước thải…

 Các chế phẩm probiotic

 Enzyme: amylase, protease, catalase, pectinase,

invertase, cellulase, hemicellulase, lipase, lactase…

Phân loại sản phẩm

Các sản phẩm TĐC

 Các sản phẩm trao đổi chất:

- Các chất trao đổi sơ cấp: amino acid, nucleotide, vitamine, acid citric…

- Các chất trao đổi thứ cấp: các chất kháng sinh, các chất kích thích hoặc kìm hãm sinh trưởng, các độc tố từ VSV…

- Các sản phẩm cuối cùng của trao đổi năng lượng: ethanol, methanol, propanol, acid lactic, acetol-butanol, methane…

 Các sản phẩm của sự chuyển hóa: phenyl acetyl carbinol,

chuyển hóa steroid…

 Các sản phẩm tái tổ hợp gen: insulin, interferon, HBV…

Các sản phẩm trao đổi chất của VSV

TẾ BÀO VSV

Sản phẩm bậc 1

(aa, đường, nucleoside, nucleotide…)

(Kháng sinh, độc tố…)

Tiền sản phẩm

(ethanol, sorbit…)

Sản phẩm chuyển hóa

(acid acetic, sorbose…)

Ưu thế của tế bào vi sinh vật trong

Cơng nghệ Vi sinh

• Kích thước nhỏ, hấp thu nhanh và đồng hóa ở tốc độ cao

• Nguồn nguyên liệu đơn giản : phế phụ phẩm rẻ tiền

• Chúng có thể thực hiện rất nhiều các phản ứng hoá sinh khác

nhau

– Mỗi loài có một số phản ứng riêng nên các phản ứng sinh hoá của

các loài VSV khác nhau rất đa dạng

– Dù một hợp chất có phức tạp đến đâu, trong thiên nhiên đều có các VSV sử dụng hoặc phân hủy Sản phẩm loài này loài khác sử dụng

• Thích ứng với thiết bị của nhà máy

Ưu thế của tế bào vi sinh vật trong

Cơng nghệ Vi sinh

• Dễ dàng sử dụng KTDT để tăng sản lượng và biến đổi sảnphẩm cuối

• Mỗi loài thường tạo ra một số chất trao đổi thứ cấp

(secondary metabolites) đặc hiệu giúp cho chúng phát triển tốt hơn và kìm hãm một số loài khác

• Cạnh tranh với tổng hợp hóa học ngay cả các phân tử đơn

giản như L-glutamic acid

• Các quá trình công nghiệp vượt xa các cơ chế điều hòa tự

nhiên.

Acid lactic Ethanol, Acid propionic, Ethanol, Ethanol,

và CO 2 acid acetic, acid lactic, acid lactic,

CO 2 và H 2 acid succinic, acid formic,

acid acetic, butanediol,

CO 2 và H 2 acetoin,

CO 2 và H 2

Nguyên lý điều hịa trao đổi chất ở vi

sinh vật

• Điều hòa hoạt tính enzyme nhờ sự ức chế sản phẩm cuối

cùng (sự kìm hãm do liên kết ngược)

• Điều hòa sự tổng hợp enzyme nhờ sự cảm ứng và ức chế

• Điều hòa tổng hợp enzyme nhờ sự kiềm chế bằng sản phẩm cuối cùng và sự giải kiềm chế

• Điều hòa tổng hợp enzyme nhờ sự kiềm chế dị hóa

Không có quá trình tạo ra sự dư thừa các chất so với nhu cầu phát triển của vsv trong tự nhiên

Sản xuất các sản phẩm từ vi sinh vật?

Điều hòa hoạt tính enzyme nhờ sự ức

chế bằng sản phẩm cuối cùng

Sự cảm ứng và ức chế quá trình

tổng hợp enzyme

Cơ chế hoạt động của Operon Lac

Điều hòa tổng hợp enzyme nhờ sự

Điều hòa tổng hợp enzyme nhờ sự kiềm chế bằng sản phẩm cuối cùng và sự

giải kiềm chế

Cơ chế hoạt động của Operon trp

Nguyên lý tổng hợp thừa ở VSV

• Enzyme tồn tại ở dạng cấu trúc không gian với 2 trung tâm:

• Trung tâm phản ứng với cơ chất

• Trung tâm chịu sự kiểm soát của chất kiềm chế (trung tâm dị lập thể)

Tổng hợp thừa một sản phẩm nào đó?

• Tác động vào trung tâm dị lập thể của enzyme

• Tác động vào chất kiềm chế

Giải tỏa sự kiềm chế

Kỹ thuật di truyền???

Những nguyên tắc cơ bản của nuôi cấy vi sinh công nghiệp

Chủ đề 2

Nội dung yêu cầu Sinh viên tự học

• Thiết kế quá trình lên men

• Thiết bị lên men

• Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật-các phương pháp lên men

Quy trình sản xuất trong Vi sinh

Kiểm tra sự tạo sản phẩm

Dinh dưỡng và nguyên liệu nuôi cấy

VSV công nghiệp

• Nguồn Carbon

– Vai trò của nguồn carbon: đáp ứng nhu cầu năng

lượng và giúp tạo ra các tiền chất, chất trung gian hoặc sản phẩm cuối

– Nguồn carbon phổ biến: glucose, lactose, sucrose,

maltose, rỉ đường, bột ngũ cốc, tinh bột, cellulose…

– Lượng carbon sử dụng tùy thuộc loài VSV: VK hiếu khí

sử dụng tới 50% cơ chất, kị khí tùy tiện chỉ dùng tới

10% cho sinh trưởng

– Nguồn carbon và năng lượng nên cung cấp ở phạm vi 10-100 g/l (một số chủng 1-10 g/l)

Dinh dưỡng và nguyên liệu nuôi cấy

VSV công nghiệp

• Nguồn Nitrogen

– Ở quy mô PTN thường cung cấp dưới dạng các hợp chất vô cơ và hữu cơ: NH3, NH4+, urê, muối nitrate (NH4NO3), N2, amino acid, peptone…

– Trong sản xuất công nghiệp, thường cung cấp dưới dạng sản phẩm thô: dịch thủy phân nấm men, bột đậu nành, cao ngô, khô lạc, nước mắm, nước

tương…

– Lượng amino acid và vitamine nên đưa vào ở phạm

vi 1-100 µg/l

Nguồn dinh dưỡng trong môi trường

nuôi cấy công nghiệp

• Nguồn dinh dưỡng khoáng

– Có vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng của quá trình lên men

– Phospho: cần cho việc kiến trúc tế bào và hoạt động của enzyme (phosphat amon và phosphat kali)

• Tránh sử thanh trùng chung CaCO3 và hợp chất phosphat vô cơ

– Các khoáng khác: Na, K, Fe, Mg, Al…

• Có vai trò quan trọng cho hoạt động của các enzyme

• Nên bổ sung ngay trong nguồn nướcCác nguyên tố vi lượng: Mn, Mo, Co…thường có trong

những nguyên liệu tự nhiên

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình

lên men

• Độ pH: có thể được điều chỉnh bằng các dung dịch NaOH,

HCl, NH4OH, urea, CaCO3, dung dịch đệm (đệm

phosphate)

• Oxy: thực hiện khuấy đảo và sục khí thích hợp

• Nhiệt độ: được giám sát và điều chỉnh trong suốt quá

trình lên men, có thể sử dụng các hệ thống làm nóng và làm nguội đã được trang bị quanh nồi lên men…

• Chủng giống và tỷ lệ giống cấy:

– Sử dụng các chủng vi sinh vật có nguồn gốc rõ ràng và

có hiệu quả cao trong lên men

– Tỷ lệ giống cấp cho sản xuất công nghiệp thường từ

0,1-10% tùy chủng vi sinh vật

Một số yếu tố khác cần thiết trong

quá trình lên men

• Các yếu tố phá bọt (Antifoaming agents): Ester, acid béo, chất béo, silicone, sulphonate,

polypropylene glycol…

• Các nhân tố sinh trưởng (Growth factors):

thiamine, biotin, calcium pentothenate…

• Các nhân tố ức chế (Inhibitors), cảm ứng

(Inducers), các chất tiền thể (precursors) và

chelators

Mối liên quan giữa sinh trưởng

và sự tạo thành sản phẩm

Từ cơ chất ban đầu với một dung tích nồi lên men nhỏ đến mức cho phép, trong thời gian ngắn, có thể thu

hoạch sản phẩm mong muốn với năng suất cao nhất?

Thu sản phẩm ở giai đoạn nào trong quá trình nuôi cấy?

VSV đạt sinh trưởng và phát triển tối ưu có đồng thời với việc tạo ra sản phẩm với hiệu suất cao nhất?

Sự sinh trưởng và sự tạo thành sản

phẩm ở vi sinh vật

Quá trình lên men hai giai đoạn

• Pha thứ nhất (pha sinh trưởng)

– Xảy ra các quá trình sinh tổng hợp protein và xây dựng

tế bào

– Bao gồm bước nhân giống và thời kỳ đầu trong quá

trình nuôi cấy ở thùng lên men cho tới khi sinh khối

ngừng phát triển và bắt đầu tích tụ sản phẩm lên men

• Pha thứ hai (pha tích tụ các sản phẩm trao đổi chất)

– Các sản phẩm trao đổi chất được tích tụ chủ yếu trong pha này

– Ở đầu pha này các tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp cao, tích tụ nhiều sản phẩm trong môi trường

– Cuối pha này lượng sinh khối giảm, quá trình tích tụ sản phẩm bị chậm lại

Phương pháp nuôi cấy VSV

Phương pháp nuôi cấy VSV

– Cần được kiểm soát chặt chẽ

– Trang thiết bị hiện đại, đắt tiền

– Dễ bị tạp nhiễm đồng loạt

– Sục khí thường xuyên đối với VSV hiếu khí

Phương pháp nuôi cấy liên tục

• Phương pháp đơn cấp: môi

trường thêm vào và môi

trường rút ra được thực hiện

liên tục và cùng tốc độ

– Dùng để thu nhận sinh

khối, hoặc sản phẩm trao

đổi chất mà được tạo thành

cùng với sự sinh trưởng

• Phương pháp nhiều cấp:

– Nuôi cấy bán liên tục: gián

đoạn, sử dụng men của mẻ

trước

Phương pháp nuôi cấy liên tục

• Ưu điểm

– Tiết kiệm thời gian

– Tiết kiệm môi trường, giống

– Nếu bị nhiễm tạp dễ bị kéo cả dây chuyền

– Cần có kinh nghiệm và chuyên môn

Vai trị của giống VSV trong sản xuất

cơng nghiệp

• Quyết định năng suất sinh học của nhà máy

• Quyết định chất lượng sản phẩm sinh học

• Quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

• Quyết định giá thành sản phẩm

Yêu cầu giống VSV trong sản xuất

công nghiệp

 Sinh ra sản phẩm mà ta mong muốn

 Cho năng suât sinh học cao

 Có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tại vùng sản xuất

 Sản phẩm lên men dễ dàng tách chiết

 Giống vi sinh vật phải thuần khiết, ổn định kiểu hình và kiểu gen

 Có tính thích nghi cao, đặc biệt dễ thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp

 Có tốc độ sinh sản và phát triển mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp, có khả năng lấn áp sự phát triển của vi sinh vật lạ

 Ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT

Chủ đề 3

Kỹ thuật cơ bản trong công nghệ vi

sinh vật

• Kỹ thuật tạo giống vsv

• Kỹ thuật nâng cao chất lượng giống vsv

• Kỹ thuật bảo quản giống vsv

• Thiết kế quá trình lên men

• Kỹ thuật thu nhận và tinh sạch sản phẩm

• Kỹ thuật tạo sản phẩm

Nguyên lý các quá trình cơ bản

trong cơng nghệ VSV

Quá trình tạo giống

Quá trình sản xuất thử

Quá trình sản xuất công

nghiệp

Quá trình thu nhận và tinh

chế sản phẩm

Phân lập, tuyển chọn, thích ứng, nâng cao chất lượng giống bằng KTDT và bảo quản giống

Các yếu tố tác động tới giống, điều kiện tối thích cho cơ thể giống

Điều kiện tối thích cho sản xuất ở quy mô công nghiệp

Các phương pháp thu nhận sản phẩm cuối cùng với

hiệu suất cao

Fermentation process

Upstream Processes

Downstream Proceses

Kỹ thuật tạo giống VSV cho sản

xuất cơng nghiệp

• Phân lập giống trong tự nhiên:

– Tìm vị trí phân lập giống

– Lấy mẫu (1 gam hoặc 1 ml) để phân lập

– Tăng sinh (môi trường tăng sinh)

– Chọn lọc (cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu)– Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa mà ta quan tâm

• Phân lập giống trong điều kiện sản xuất:

– Chọn vị trí và loại mẫu vật phân lập: căn cứ vào đặc điểm của giống vsv trong điều kiện sản xuất

• Phân lập giống trong những ống giống đã thoái hóa:

– Là quá trình tuyển chọn lại giống từ các ống giống

Hoạt tính amylase

Hoạt tính lipase Hoạt tính cellulase

Khả năng sinh kháng sinh

Sự ức chế Rhodotorula sp của LAB

Sự ức chế S aureus của Bacteriocin

Tính nhạy cảm với kháng sinh

Kỹ thuật nâng cao chất lượng

– Giữ giống trong điều kiện đã tạo được thích nghi đó

• Tạo giống có chất lượng cao hơn bằng cách làm biến đổi

di truyền

– Lai giống

– Đột biến nhân tạo

– Kỹ thuật tái tổ hợp gen

Kỹ thuật nâng cao chất lượng giống vsv

Tạo đột biến

• Đột biến ngẫu nhiên (Spontaneous mutation)

– Xảy ra trong quá trình sao chép DNA với (1 in 109 bp)

• Đột biến hóa học (Chemical mutagens)

– Base pair changers (nitrous acid)

– Base analogues (e.g 5 bromouracil)

– Frameshift mutagens (aflatoxin, benzpyrene)

• Phóng xạ (Radiation)

– Tia X, tia gamma phá hủy DNA, các base

– Tia UV gây ra knots trong mạch DNA

Ví dụ: Sơ đồ tuyển chọn chủng Penicillium

chrysogenum Wis 49-133 để sản xuất penicillin G

Ví dụ: Sơ đồ tuyển chọn chủng P chrysogenum

Wis 49-133 để sản xuất penicillin G (tt)

Tạo đột biến

Hệ thống kiểm soát của tế bào

Cơ chất Enzyme

Sản phẩm (product)

Induction

Inhibition/Repression

• Chiến thuật (strategy):

– Tạo đột biến (mutant)

– Cung cấp inducer trong môi trường

– Tránh tạo ra inhibitor/repressor

– Tìm kiếm những đột biến thiếu sự kiểm soát inhibition/repression

Tạo đột biến

Ví dụ: Sản xuất Lysine theo con đường

đơn giản sử dụng Aerobacter aerogenes

• Trong tế bào bình thường, feedback control làm dừng quá trình tạo lysine

Feedback Control

• Con đường đơn giản tổng hợp Lysine ở

Aerobacter aerogenes

Tạo đột biến Sản xuất Lysine sử dụng

Aerobacter aerogenes (tt)

• Sử dụng “dual fermentation”

– Nuôi cấy riêng biệt 2 chủng khác nhau (A và B), sau

đó trộn lại trong sự hiện diện của acetone

• Chủng A

• Chủng B

– Là chủng hoang dại (wild strain)

– Tế bào có chứa đầy đủ các enzyme của con đường chuyển hóa mà thiếu ở chủng A

Tạo đột biến

Điều gì xảy ra khi trộn 2 chủng

A và B?

• Hỗn hợp lên men (mixture) có chứa:

– Lượng lớn L,L và Meso DAP (từ chủng A)

– Các enzyme cần thiết cho sự chuyển hóa L,L

và Meso DAP thành lysine (từ chủng B)

• Kết quả là sản xuất lượng lớn lysine

Tạo đột biến Feedback control trong các con đường

phân nhánh (branched pathway)

• Sản phẩm ở cuối các nhánh được kiểm soát ở điểm trước phân nhánh của con đường

Control Point

Tạo đột biến

Sản xuất Lysine sử dụng

Corynebacterium glutamicum (tt)

• Sử dụng một đột biến mà không thể chuyển hóa

aspartate semi-aldehyde thành homoserine

Sản xuất acid succinic ở Mannheimia

succiniciproducens

Bất hoạt hoặc loại bỏ gen ldhA và pflB?

Sản xuất acid succinic ở Mannheimia

succiniciproducens (tt)

crossover

Ví dụ: Sản xuất acid succinic ở

Mannheimia succiniciproducens (tt)

crossover

Kỹ thuật nâng cao chất lượng giống vsv

Tạo dòng gene (gene cloning)

• Phân lập gen quan tâm

• Chèn gen mục tiêu vào vector chuyển gen

• Chuyển vector vào vào tế bào chủ

• Sự biến nạp của các tế bào của sinh vật

• Chọn lọc các sinh vật biến đổi gen

Tạo dòng gene

Cắt DNA (Cleaving DNA)

Tạo dòng gene

Phân tích các phân đoạn DNA

Tạo dòng gene

Creating a Library

Ví dụ: Sản xuất phenylalanine

1 Loại bỏ feedback inhibition (select strains

resistant to phenylalanine analogues)

2 Bất hoạt gen ức chế tổng hợp

phenylalanine

3 Loại bỏ con đường cạnh tranh (delete

tyr and trp specific genes)

4 Biểu hiện gen đặc hiệu tổng hợp

phenylalanine (Overexpress)

5 Tăng tổng hợp E4P và PEP