Bcao tong ket đề tài nghiên cứu về e coli

Bệnh tiêu chảy do E.coli là bệnh thường xuyên xảy ra ở lợn đặc biệt là lợn con theo mẹ từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi, bởi ở giai đoạn này hệ thống tiêu hóa ở lợn chưa hoàn chỉnh, hệ miễn dịch của lợn còn yếu trong khi đó lượng sữa mẹ lại ít và kém vệ sinh, môi trường không được quan tâm, nhiệt độ chuồng trại không thích hợp. Bệnh xảy ra không những gây chết nhiều lợn mà còn làm giảm tỷ lệ tăng trọng, làm tăng tỷ lệ cảm nhiễm với các bệnh khác ở những con sống sót. Những con mắc bệnh còn là nguồn lây nhiễm gây ngộ độc thực phẩm do E.coli ở người. Bởi từ những con lợn mắc bệnh tiêu chảy, E.coli sẽ được thải qua phân ra môi trường bên ngoài, và từ đây lây nhiễm vào thức ăn, nước uống dùng cho con người đặc biệt trong quá trình giết mổ, sơ chế thịt và phủ tạng nếu không được vệ sinh sạch sẽ.

Trong những năm gần đây, tình hình dịch bệnh trên đàn lợn có nhiềudiễn biến phức tạp, nhiều dịch bệnh xảy ra gây thiệt hại lớn cho ngành chănnuôi như: Bệnh Lở mồm long móng, Tai xanh, Dịch tả lợn và Liên cầu khuẩn,Bệnh Tiêu chảy do E.coli

Hội chứng tiêu chảy phân trắng ở lợn con hay bệnh lợn con phân trắng làbệnh thường gặp ở lợn con theo mẹ, xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau.Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh là do vi sinh vật (điển hình là

E.coli, Salmonella, Clostridial, Coccidiosis ), hoặc do hiện tượng stress saukhi sinh, stress do thay đổi thời tiết, do chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng lợn mẹ,chế độ dinh dưỡng, chăm sóc, tập cho lợn con, tình trạng vệ sinh kém trongchăn nuôi, chuồng trại ẩm thấp không đủ tiêu chuẩn vệ sinh thú y, …

Bệnh tiêu chảy do E.coli là bệnh thường xuyên xảy ra ở lợn đặc biệt làlợn con theo mẹ từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi, bởi ở giai đoạn này hệ thống tiêuhóa ở lợn chưa hoàn chỉnh, hệ miễn dịch của lợn còn yếu trong khi đó lượngsữa mẹ lại ít và kém vệ sinh, môi trường không được quan tâm, nhiệt độchuồng trại không thích hợp Bệnh xảy ra không những gây chết nhiều lợn màcòn làm giảm tỷ lệ tăng trọng, làm tăng tỷ lệ cảm nhiễm với các bệnh khác ởnhững con sống sót Những con mắc bệnh còn là nguồn lây nhiễm gây ngộ độcthực phẩm do E.coli ở người Bởi từ những con lợn mắc bệnh tiêu chảy, E.coli

sẽ được thải qua phân ra môi trường bên ngoài, và từ đây lây nhiễm vào thức

ăn, nước uống dùng cho con người đặc biệt trong quá trình giết mổ, sơ chế thịt

và phủ tạng nếu không được vệ sinh sạch sẽ

Chính vì vậy E.coli không chỉ là mối quan tâm lo ngại của nhiều nhàchăn nuôi mà là vấn đề của cả cộng đồng Do bệnh thường xuyên xảy ra vàhiệu quả điều trị bằng kháng sinh cũng như hiệu quả tiêm phòng bằng vác-xinchưa cao nên những hiểu biết cơ bản về bệnh rất quan trọng trong chăm sóc,bảo vệ sức khỏe của đàn lợn và sức khỏe cộng đồng, hạn chế thiệt hại kinh tế

- Đề xuất biện pháp phòng bệnh

PHẦN II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ LỢN CON

Cũng như các gia súc non khác, lợn con có một số đặc điểm khác so vớilợn trưởng thành

Hệ thần kinh phát triển chưa hoàn thiện, lớp mỡ dưới da mỏng, diện tích

bề mặt lớn so với khối lượng cơ thể nên khả năng điều tiết thân nhiệt kém, dễ

bị mất nhiệt, đặc biệt là sau khi sinh, khi trời lạnh Vì vậy, lợn con rất mẫn cảmvới sự thay đổi của thời tiết, nhiệt độ, độ ẩm của chuồng nuôi

Bộ máy tiêu hoá phát triển nhanh nhưng chưa hoàn thiện Trong thời kì

bú sữa, dung tích dạ dày tăng 50 - 60 lần, chiều dài ruột non tăng 5 đến 6 lần,diện tích tăng 50 đến 60 lần Chưa thành lập phản xạ tiết dịch có điều kiện, sau

20 đến 25 ngày mới hoàn thiện chức năng này

Chức năng của bộ máy tiêu hoá dần hoàn thiện, trước 1 tháng chưa cóaxit HCl tự do trong dạ dày Nên khả năng tiêu hoá protein và diệt khuẩn củadịch vị kém, hoạt tính của các men thấp

Lợn con mới sinh, trong máu hầu như không có kháng thể, khả năngmiễn dịch hoàn toàn thụ động, phụ thuộc lượng kháng thể từ sữa mẹ, khả nănghấp thu kháng thể giảm theo giờ Đến tuần thứ ba, lợn con mới tự tổng hợpđược kháng thể Cho nên cần cho lợn con bú sữa đầu càng sớm càng tốt

Lợn con mọc răng sớm, sau khi sinh từ 6 đến 10 ngày đã mọc răng nênhay gặm, cắn lung tung Vì vậy, một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường dễ dàngxâm nhập vào đường tiêu hoá

Lợn con sinh trưởng nhanh nên nhu cầu dinh dưỡng cao, thức ăn chủ yếu

là sữa mẹ nhưng hàm lượng sắt trong sữa thấp Lợn con cần khoảng 7 mgFe/ngày, sữa mẹ chỉ cung cấp khoảng 1 mg Fe/ngày, nên cần bổ sung sắt cholợn con sau khi sinh được 4 ngày tuổi (đặc biệt là lợn siêu nạc)

2.2 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E.coli)

Trong các vi khuẩn đường ruột, E.coli là loại phổ biến nhất Theo

Nguyễn Như Thanh (1974) [24], bình thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột,

ít khi có mặt ở dạ dày hay phía trước của ruột non Chỉ khi nào sức đề kháng

của vật chủ yếu đi, E.coli mới phát triển mạnh về số lượng và tăng cường độc

lực, gây bệnh cho vật chủ

2.2.1 Đặc tính sinh vật học

E.coli là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông, di động

được, không hình thành nha bào, bắt màu gram (-) thường thẫm ở 2 đầu, ở giữanhạt Trong cơ thể, vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng rẽ, đôi khi xếpthành chuỗi ngắn

2.2.2 Đặc tính nuôi cấy

E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tuỳ tiện, dễ dàng nuôi cấy ở các

môi trường thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp 7,2 - 7,4.Nhưng vẫn phát triển được trong môi trường pH 5,5- 8

- Môi trường nước thịt: E.coli phát triển rất nhanh, môi trường đục đều,

có cặn lắng xuống đáy, màu tro nhạt, trên mặt có màng mỏng màu ghi nhạtdính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối

- Môi trường thạch thường: nuôi cấy ở 37oC/24h, vi khuẩn hình thànhkhuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi, đường kính khuẩnlạc khoảng 2 - 3 mm

- Môi trường MacConkey: E.coli hình thành những khuẩn lạc dạng S,

màu hồng cánh sen

- Môi trường Birilliant Green Agar: khuẩn lạc E.coli dạng S, màu vàng chanh.

- Môi trường thạch máu: vi khuẩn E.coli có thể gây dung huyết

2.2.3 Đặc tính sinh hoá

Các chủng E.coli đều lên men sinh hơi mạnh các loại đường glucose, galactose, fructose, levulose Tất cả các E.coli đều lên men đường lactose

nhanh và sinh hơi, đó là một đặc điểm quan trọng, dựa vào đó để phân biệt

E.coli và Salmonella sp Có thể lên men không sinh hơi: Saccaroza, Rafinoza,

Xanixin, Glyxezol ít khi lên men: Inulin, Pectin, Adonid, không lên menDextrin, Glycogen, Xenlobioza

Các phản ứng sinh hoá: Indol (+), MR (+); VP(+), phản ứng sinh H2S

(- ), hoàn nguyên nitrat thành nitrit.

2.2.4 Cấu trúc kháng nguyên

E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, bao gồm kháng nguyên

thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên K, kháng nguyên bám dính F.Ngày nay, người ta phát hiện một cách nhanh chóng số lượng các khángnguyên F Chức năng của kháng nguyên này là giúp vi khuẩn bám giữ vào giáthể (màng nhầy của đường tiêu hoá) hay còn gọi là bám dính Phần lớn cáckháng nguyên bám dính đều sản sinh độc tố (Vũ Khắc Hùng, 2005) [9]

2.2.5 Đặc tính gây bệnh

E.coli gây bệnh bởi tổng hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu

tố không phải là độc tố Bao gồm:

- Khả năng bám dính:

Bám dính là một khái niệm chỉ mối quan hệ của sự liên hệ vững chắc,thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn và tế bào vật chủ Tất cả các cấu trúc thểhiện chức năng bám dính được gọi là yếu tố bám dính (Jones G.W, 1981) [41]

Đây là yếu tố gây bệnh đặc biệt quan trọng, nó giúp vi khuẩn thực hiệnbước đầu tiên của quá trình gây bệnh là bám dính lên niêm mạc ruột nhờ 1 hay

nhiều yếu tố bám dính E.coli có 4 loại yếu tố bám dính, đặc biệt quan trọng là

F4 (K88), F5(K99), F6(987p), F41

- Khả năng xâm nhập:

Là khả năng của vi khuẩn qua được hàng rào bảo vệ lớp mucosa trên bềmặt niêm mạc ruột non và tế bào biểu mô, đồng thời sản sinh và phát triểntrong lớp tế bào này, tránh các tế bào đại thực bào

- Khả năng gây dung huyết:

Khả năng sản sinh ra Haemolysin của E.coli có thể được coi như là một

yếu tố độc lực quan trọng, nhằm mục đích dung giải hồng cầu giải phóng sắttrong nhân Hem và tranferin để cung cấp cho quá trình trao đổi chất của vikhuẩn Có 4 kiểu dung huyết tố nhưng quan trọng nhất là 2 kiểu  và 

- Khả năng tạo Colicin V:

Trong quá trình phát triển, E.coli thường xuyên sản sinh ra Colicin V khi

tồn tại cộng sinh với các loại vi khuẩn khác và trở nên chiếm ưu thế trongđường ruột Colicin V là một loại chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc

tiêu diệt các loại vi khuẩn khác E.coli sản sinh Colicin V thông qua plasmid

col Colicin V được coi là một bacteriocin, chất này chỉ có tác dụng độc với

các vi khuẩn trong họ Enterobacteriacea Có khoảng 40% số chủng E.coli của

người và động vật có khả năng sản sinh Colicingenic Nếu Colicin V được sản

sinh ra từ các chủng E.coli cường độc ký sinh trong cơ thể vật chủ thì trong

trường hợp này có thể coi Colicin V là một yếu tố gây bệnh Đào Trọng Đạt và

cs (1996) [4], Brown V (1981) [36] trong hầu hết các chủng E.coli gây bệnhđều có Colicin V

- Tính kháng kháng sinh:

Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh của E.coli nằm trong

plasmid Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột

nói chung và E.coli nói riêng có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa

các chủng vi khuẩn Do vậy nó có vai trò hết sức quan trọng trong việc gieo rắc

tính kháng thuốc Sử dụng một loại thuốc hoá học trị liệu nào điều trị E.coli

trong một thời gian dài dẫn đến khả năng kháng không chỉ thuốc đó còn kháng

cả các thuốc khác nữa (Bùi Thị Tho, 1996) [26], Phạm Khắc Hiếu (1998) [7]

cho biết 5% số chủng E.coli kháng lại 7 loại kháng sinh, 25% kháng lại 4 loại.

Đồng thời, tác giả cũng đã chứng minh khả năng truyền tính kháng kháng sinh

của E.coli cho nhiều loại vi khuẩn khác.

- Khả năng sản sinh độc tố:

Sản sinh độc tố được xem như là một khả năng đặc biệt quan trọng của

E.coli Cũng như khả năng bám dính, khả năng sản sinh độc tố là một nhân tố gây bệnh quan trọng của vi khuẩn E.coli

Theo Lê Thanh Hoà (2006) [5], có hai loại độc tố, đó là loại kém chịunhiệt (heat - labile toxin [LT]) và loại chịu nhiệt bền vững hay còn gọi là bềnnhiệt (heat - stable toxin [ST]) Cả hai loại độc tố kém chịu nhiệt LT và bền

nhiệt ST đều do các nhóm vi khuẩn E.coli độc lực có tên gọi là ETEC sản xuất (ETEC = Enterotoxigenic E.coli) Thực chất, yếu tố độc lực mà ETEC thừa

hưởng được chính là nhờ sự hỗ trợ tương tác cộng sinh của nhiều loại plasmid

có các gen sản xuất cả hai loại độc tố nói trên.

Loại LT được nghiên cứu khá đầy đủ Đó là một loại Protein có hainhóm phụ: nhóm phụ A có phân tử lượng 25,5 kDa; và nhóm phụ B có phân

tử lượng 11 kDa Mỗi một nhóm phụ A liên kết với 4 hoặc 5 nhóm phụ B và

có sự hợp nhất với một phần toxin do vi khuẩn tả Vibrio cholerae sản xuất.Huyết thanh kháng độc tố vi khuẩn tả có khả năng trung hoà độc tố LT của

E.coli Giữa độc tố của vi khuẩn tả và LT toxin của E.coli có mối quan hệ cấu

trúc, và có nguồn gốc từ cùng một tổ tiên, tuy rằng trật tự ADN trong mỗi gensản xuất chúng có nhiều sự khác biệt Độc tố vi khuẩn tả do gen có trên hệ

gen vi khuẩn tả sản xuất, còn sản xuất độc tố LT ở vi khuẩn E.coli do plasmid

chịu trách nhiệm

Cả hai loại độc tố, LT của E.coli và độc tố của vi khuẩn tả đều có cùng

một cách tác động lên tế bào mẫn cảm của động vật và người Nhóm phụ B củađộc tố LT bám vào thụ thể glycolipit, có tên gọi là gangliosid GM1, có trênmàng tế bào Nhóm phụ A xuyên qua màng và hoạt hoá enzym adenylatcyclase Sự hoạt hoá này có liên quan đến sự adenosin diphosphat (ADP) -ribosyl hoá một loại Protein có mặt ở ngay mặt trong của màng tế bào.Nicotinamid adenosin diphosphat (NAD) cũng là một yếu tố đồng tác dụngtham gia phản ứng Dưới sự kích thích của enzym adenylat cyclase, nồng độcủa adenosin monophosphat mạch vòng (AMP mạch vòng) được tăng cường

và do vậy, kích thích quá trình bài xuất nước và chất điện giải vào khoang ruột,gây nên hiện tượng tiêu chảy

Loại độc tố chịu nhiệt ST lại không liên quan mật thiết đến độc tố LT.Độc tố ST là một loại Protein có phân tử lượng nhỏ, khoảng 5 kDa, và có tínhkháng nguyên rất yếu, xét về góc độ miễn dịch Cơ chế tác động lên tế bào của

ST cũng khác LT ST kích thích enzym guanylat cyclase Có thể dùng môitrường nuôi cấy tế bào để phát hiện và chuẩn độ độc tố LT thông qua phản ứngmiễn dịch tại chỗ với kháng nguyên là độc tố và kháng thể là kháng độc tố, vìchúng có thể làm biến hình tế bào, làm cho tế bào co tròn lại Ngược lại, STkhông được phát hiện và chuẩn độ theo phương pháp này Người ta thường căn

cứ vào độ tích tụ dịch bài xuất trong khoang ruột của chuột con để chuẩn độđộc tố ST, sau khi tiêm độc tố này vào dạ dày của chuột thí nghiệm.

Gen sản xuất độc tố ST là một phần của một loại tiểu phần chuyển vị

(transposon) được phát hiện định vị trên một loại plasmid của E.coli, đó là

transposon kí hiệu Tn1681 Tn1681 có độ dài khoảng 2040 Nucleotid bao gồm

3 phần, ở giữa là gen chịu trách nhiệm sản xuất độc tố ST, nằm ở hai đầu là haitiểu phần gài - lắp kí hiệu là IS1, mỗi một tiểu phần có độ dài 768 Nucleotid và

có cấu trúc đối xứng ngược

Gen sản xuất độc tố LT còn phát hiện có trên hệ gen của một loại phage

ôn hoà Phage này sau khi nhập gen vào một chủng E.coli đã làm thay đổi vi

khuẩn chủ và chuyển chúng thành chủng sản xuất độc tố

Nhóm sản sinh độc tố EAST1: EAST1 là độc tố bán chịu nhiệt, có genquy định nằm trên plasmid Vai trò của độc tố này đến nay vẫn chưa được biết

rõ Tuy nhiên khi nghiên cứu về mối tương quan giữa EAST1 với yếu tố bámdính và độc tố chịu nhiệt STb, người ta thấy giữa chúng có mối tương quanthuận cho phép nhận định vai trò gây nên tiêu chảy của EAST1

Các chủng ETEC gây bệnh bằng cách bám dính và xâm nhập vào các tếbào biểu mô niêm mạc ruột của vật chủ rồi sản xuất độc tố đường ruột Baogồm độc tố chịu nhiệt (STa và STb), độc tố không chịu nhiệt (LT) Các độc tốnày làm thay đổi cân bằng nước và điện giải ở tế bào niêm mạc ruột của vậtchủ gây nên tiêu chảy (Vũ Khắc Hùng, 2005) [9]

Các chủng VTEC sản sinh độc tố Shigatoxin (Stx2e), độc tố này gây pháhuỷ các mạch máu ở nhiều cơ quan khác nhau Độc tố gây dung huyết đườngniệu ở người và gây chứng phù đầu ở lợn con

Fairbother J.M và cs (1992) [37] cho biết: độc tố đường ruột Enterotoxin

do E.coli tạo ra (ETEC) gây ỉa chảy trầm trọng cho lợn sơ sinh từ 1- 4 ngày tuổi.

2.3 BỆNH TIÊU CHẢY DO E.COLI Ở LỢN

Bệnh do vi khuẩn E.coli có sẵn trong đường ruột của lợn gây ra do mất

cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại trong đường tiêu hoá, do các

yếu tố stress Bệnh có thể xảy ra ngay từ những ngày đầu mới sinh, tỷ lệ chết

từ 20-100% Trong số những loại bệnh tiêu chảy như tiêu chảy vi khuẩnClostridial, Coccidiosis, TGE và PED thì tiêu chảy do vi khuẩn E.Coli đượcxem là phổ biến Lý do, hệ thống tiêu hoá ở lợn chưa hoàn chỉnh, đặc biệt là hệmiễn dịch của lợn còn yếu trong khi đó lượng sữa mẹ lại ít và kém vệ sinh, môitrường không được quan tâm, nhiệt độ chuồng trại không thích hợp Có thể gặp

ở bất cứ độ tuổi nào nhưng tập trung vào hai giai đoạn khi lợn được 5 ngày tuổi

và giai đoạn hai từ 7-14 ngày tuổi

Trong khi sức đề kháng yếu, nếu dịch tiêu chảy xảy ra thì tỷ lệ mắc bệnhrất cao, trong đó tiêu chảy do khuẩn E.Coli thường gặp ở nhóm lợn được 5ngày tuổi Trong trường hợp phải nuôi bộ do lợn mẹ bị ốm nếu không cho ănđúng cách như dùng sữa có quá nhiều đường cũng có thể gây tiêu chảy Ngoài

ra còn do các nguyên nhân khác như quản lý chăm sóc chưa hợp lý, vệ sinhchuồng trại kém

Những nguyên nhân chính làm tăng độ nhiễm E.coli ở lợn con

Giai đoạn sơ sinh:

- Lợn con không bú được nhiều sữa đầu, sữa lợn mẹ có chất lượng

không tốt

- Lợn con bị lạnh: do không được úm, gió lùa, độ ẩm cao…

- Chăm sóc lợn mẹ không tốt: khâu đỡ đẻ không tốt, thức ăn chất lượng kém, thay đổi thức ăn liên tục dẫn đến: lợn mẹ bị MMA, sữa lợn mẹ quá ít, lợn con không đủ sữa bú…

- Chuồng nuôi ô nhiễm, áp lực mầm bệnh cao

Giai đoạn tập ăn:

- Chọn thức ăn tập ăn không tốt: không phù hợp với sinh lý tiêu hoá dẫn tới rối loạn tiêu hóa

- Tập ăn không đúng phương pháp: Không bổ xung men sống hỗ trợ, đổ quá nhiều thức ăn, thức ăn lưu cữu quá lâu dẫn đến ôi thiu, nhiễm khuẩn…

Giai đoạn sau cai sữa:

- Cai sữa không đúng phương pháp: Cho ăn quá nhiều, không dùng men

- Lợn có thể nôn, bụng thóp lại, mắt lõm sâu, da tím tái

- Lợn mất nước, lông xù, bỏ bú, suy kiệt trầm trọng, có thể chết

- Nhóm E.coli gây phù đầu thường gặp trên lợn con sau cai sữa 1-2 tuần

và những con lớn trội trong đàn là những con nhiễm đầu tiên

- Lợn giảm ăn, đi đứng siêu vẹo hay nằm liệt, co giật, hôn mê

s Gan bị thoái hoá, màu đất sét, sưng, túi mật căng

- Lách không sưng, bóc lớp vỏ thấy xuất huyết, lách mềm

- Tim to, cơ tim mềm

Những bệnh đồng hành ở lợn con khi bị tiêu chảy:

Khi bị tiêu chảy vì vi khuẩn E.Coli lợn con thường mắc một số chứngbệnh sau:

- Sốt, nhất là ở những nơi dịch sốt đang phát triển mạnh

- Nhiễm Coliform

- Viêm ruột kết

- Nhiễm ký sinh trùng

- Tiêu chảy vì Porcine (PED)

- Viêm nhiễm Rotavirus

- Tiêu chảy vì Spirochaetal

- Tiêm phòng cho lợn mẹ và lợn con: phòng dịch tả, giả dại, thương hàn,tiêu chảy vì khuẩn E.Coli để tạo miễn dịch tốt cho lợn mẹ và lợn con

- Vệ sinh cuống rốn tốt cho lợn con, nếu không sẽ bị viêm nhiễm và phátsinh bệnh Nên cắt rốn, sát trùng bằng iodine liên tục cho đến khi rốn rụng

- Cung cấp dưỡng chất sắt cho lợn con để hạn chế nguy cơ thiếu máudẫn đến tiêu chảy

- Phòng bệnh cho lợn mẹ để hạn chế nguy cơ mắc hội chứng MMA(viêm vú, viêm tử cung và tiết sữa kém)

- Vệ sinh chuồng trại, cho lợn ăn vệ sinh, đủ chất, đủ nước, nước uốngphải sạch sẽ, nên cho kín chuồng khi trời lạnh và thoáng mát về mùa hè

PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU,

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Ca bệnh: lợn có biểu hiện tiêu chảy và kết quả xét nghiệm dương tính với E.coli

- Đàn lợn con dưới 21 ngày tuổi

- Đàn lợn mẹ

- Vi khuẩn E.coli

3.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Tại 4 xã: Tân Phong, Kiến Quốc, Minh Tân, Đại Hà huyện Kiến Thuỵ

- Hải Phòng

3.2.2 Thời gian nghiên cứu: từ 25/4 đến 06/6/2011.

3.3 NGUYÊN LIỆU

- Bảng câu hỏi điều tra các yếu tố nguy cơ

- Danh sách hộ chăn nuôi lợn nái

- Mẫu phân

- Môi trường, hoá chất, Dụng cụ, trang thiết bị phòng thí nghiệm

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

* Điều tra tình hình chăn nuôi, Ảnh hưởng của các yếu tố nguy cơ đếnbệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn dưới 21 ngày tuổi:

- Thức ăn của lợn mẹ (thức ăn công nghiệp hoàn chỉnh, thức ăn tậndụng);

- Nước uống của lợn mẹ (nước chưa qua xử lý, nước đã xử lý);

- Phương pháp vệ sinh khử trùng chuồng trại (tần suất, thuốc sát trùng sửdụng, xử lý chất thải);

- Vác xin phòng bệnh cho lợn mẹ (Phó thương hàn, Tụ - dấu, Dịch tả)

* Lấy 80 mẫu phân xét nghiệm, phân lập E.coli

* Một số phương pháp phòng bệnh

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp nghiên cứu thuần tập

- Phương pháp lấy mẫu: lấy mẫu ngẫu nhiên: Tại 80 hộ chăn nuôi lợn cólợn dưới 21 ngày tuổi:

Lấy ngẫu nhiên một con có triệu chứng lâm sàng (có hiện tượng tiêu chảy) để lấy mẫu phân

Cố định lợn, dùng tăm bông vô trùng ngoáy vào trực tràng lợn để lấymẫu phân, cho mẫu dịch vừa lấy vào ống đựng dung dịch bảo quản mẫu Bảoquản mẫu trong hộp bảo ôn, gửi về Trạm Chẩn đoán – Xét nghiệm bệnh độngvật – Chi cục Thú y Hải Phòng xét nghiệm

- Phương pháp xét nghiệm: Phương pháp nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn: Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương, Cục thú y, FAO, Carter G.R (1995)

- Nuôi cấy phân lập: Mẫu sau khi thu thập về được nuôi cấy trên các môitrường thông thường, môi trường giám định đặc hiệu như: Môi trường nướcthịt, môi trường thạch thường, môi trường thạch máu, v.v

Căn cứ vào đặc tính mọc trên môi trường thông thường, môi trường phânlập và giám định đặc hiệu để chọn riêng các loại khuẩn lạc, nuôi cấy riêng đểtiến hành xác định Các loại vi khuẩn sau khi được phân lập và xác định đượcnuôi cấy, giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo

Quy trình xét nghiệm phân lập vi khuẩn E.Coli

Mẫu bệnh phẩm



Nuôi cấy trong các môi trường:

Nước thịt, thạch máu, thạch thường



Phân lập, thuần khiết khuẩn lạc trên các môi trường thích hợp

 Nhuộm Gram kiểm tra hình thái



Giám định vi khuẩn bằng các đặc tính hình thái và sinh hoá

* Nuôi cấy, phân lập giám định vi khuẩn

- Nuôi cấy, phân lập

Bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường: Thạch máu, thạchMacConkey Nuôi ở 370C trong điều kiện hiếu khí 24 giờ

Trên môi trường thạch MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng đậm, nhám hoặctrơn đường kính 2-4 mm

Thạch máu: E coli gây bệnh phù thường gây dung huyết thạch máu Khuẩnlạc màu trắng xám, tròn, bóng

Cấy khuẩn lạc vào môi trường Endo agar: hình thành khuẩn lạc sinh ánhkim

- Giám định đặc tính sinh hoá

Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn E.coli:

-Chọn khuẩn lạc có màu hồng đậm trên thạch MacConkey cấy vào môitrường nước thịt hay nước peptone để tiếp tục kiểm tra các đặc tính sinh hoá

Phản ứng IMViC

IMViC = sinh Indol, methyl red (MR), Voges-Proskauer (VP) và citrate

Vi khuẩn E coli có IMViC= +/ + /

-/-+ Sinh Indol: cấy vi khuẩn nghi ngờ vào môi trường nước peptone hay môitrường có chứa tryptophan (Simon Citrat), nuôi ở 370C từ 18 giờ đến 24 giờ Nhỏ0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, nếutrên bề mặt môi trường có vòng màu đỏ ở là phản ứng dương tính

+ VP: Cấy vi khuẩn nghi ngờ vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 370Csau 24 giờ nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt thuốc thử VP, đọc kết quảsau 5 phút đến 120 phút, nếu có màu đỏ hồng là dương tính, không biến màuhoặc màu vàng là âm tính

+ MR: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 370C sau 24giờ nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 950

đọc kết quả sau 5 phút, nếu có màu đỏ là phản ứng dương tính, có màu vàng là

âm tính

+ Citrate: kiểm tra sự sử dụng citrate của vi khuẩn Cấy vi khuẩn vào