Công nghệ chuyển gen ở thực vật

CÁC HƯỚNG TẠO CÂY CHUYỂN GEN Các biện pháp phòng chống sâu hại đang sử dụng Các chiến lược tạo cây trồng chuyển gen kháng sâu Các vấn đề liên quan đến thuốc trừ sâu Chuyển gen tạo protoxin Bt vào cây Chuyển gen tạo các protein ức chế enzym tiêu hoá của sâu vào cây ...

CÔNG NGHỆ

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

Chuyên đề cao học 2013

PHẦN II

CÁC HƯỚNG TẠO CÂY CHUYỂN GEN

Trong thời gian sinh trưởng

Trong sự sinh trưởng sinh sản, hình thành hạt, quả…

 Sâu gây hại ở nhiều phần khác nhau của cây:

Bộ phận bên trên mặt đất: thân lá, cơ quan sinh sản

Bộ phận dưới mặt đất: hệ rễ, các cơ quan dự trữ…

1 Tạo giống kháng sâu

CÁC BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG SÂU HẠI ĐANG SỬ DỤNG

 Phòng chống bằng thuốc hóa học

 Sử dụng các giải pháp kỹ thuật trồng trọt tổng hợp

để hạn chế côn trùng (IPM)

 Chọn tạo giống về mặt di truyền bằng các phương pháp tạo giống truyền thống

CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN

THUỐC TRỪ SÂU

 Thuốc trừ sâu đầu tiên là dicloro diphenyl

triclorethan (DDT) được tổng hợp từ 1870 và

giảm mạnh vào 1930-1980 Các thuốc hoá học lân hữu cơ (malathion, parathion, …) tác động rất mạnh đến hệ thần kinh vận động và thần kinh não.

 Thuốc có ảnh hưởng lâu dài, gián tiến lên hệ

sinh thái DDT bền vững trong môi trường trên

20 năm, tích tụ ngày càng tăng qua chuỗi thức

ăn Nhiều loài chim giảm rõ rệt

CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN

THUỐC TRỪ SÂU

 Thuốc tồn tại không lâu nên phải phun lại nhiều lần.

 Thuốc khó xâm nhập vào đúng vị trí mà sâu ăn -> phải phun toàn cây.

 Thuốc có thể diệt cả sâu hại lẫn sâu có ích

 Côn trùng cũng phát triển, tính kháng thuốc

khiến thuốc giảm hay không còn hiệu lực.

 Sử dụng thuốc sâu còn liên quan đến độ an toàn của thuốc, tác động của thuốc đến môi trường, o nhiễm nước ngầm.

CÁC GI ẢI PHÁP CẢI TIẾN NHẰM

PH ÒNG CHỐNG SÂU HẠI

 Sử dụng IPM nhiều hơn

 Phát triển các loại thuốc ít tác động đến môi trường

chuyển gen

C ÁC CHIẾN LƯỢC TẠO CÂY TRỒNG

CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU

của sâu vào cây

LỊCH SỬ BACILLUS THURINGIENSIS

 Bt được nhà vi khuẩn học Nhật bản phát hiện lần đầu tiên trên bệnh tằm năm 1901

 Năm 1911 được nhà vi khuẩn học Berliner đặt tên

 Bt là một loại vi khuẩn đất có trong tự nhiên, rất phổ biến nhưng ở hàm lượng thấp.

 Có thể dùng làm thuốc trừ sâu có hiệu lực

và không ảnh hưởng xấu đến môi trường.

 Bt được xem là một nhân tố gây bệnh côn trùng, một loại vi khuẩn xâm nhiễm tạo bào tử đơn giản.

 Bào tử Bt sản sinh ra tinh thể độc tố chúng

là các chất endotoxin nhất định ở dạng tinh thể.

HOW DOES BT WORK AS AN

INSECTICIDE?

 Các chất Bt endotoxin được hoạt hóa đồng loạt bởi độ kiềm trong ruột sâu

 Phân giải tế bào biểu mô của ruột sâu

 Cân bằng thẩm thấu của sâu bị đảo lộn theo hướng làm giảm pH -> sâu chết

WHY CAN BT BE USEFUL?

 Là chất diệt sâu thân thiện với môi trường

 Chỉ độc với côn trùng ăn miệng và một số thủy sản

 Không độc với người và không ảnh hưởng tới giá trị lợi nhuận của cây và động vật

 Dễ dàng trồng trọt

Bacillus thuringiensis subsp kurstaki Lepidoptera

Bacillus thuringiensis subsp israelensis Diptera

Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis Coleoptera Bacillus thuringiensis subsp aizawai Lepidoptera

Subspecies of Bacillus thuringiensis

• cryI genes encoded proteins toxic to lepidopterans

• cryII genes encoded proteins toxic to both lepidopterans and

dipterans

• cryIII genes encoded proteins toxic to coleopterans

• cryIV genes encoded proteins toxic to dipterans alone

Crystal proteins of Bacillus thuringiensis

ĐỊNH NGHĨA CRY PROTEIN

 Là một protein (tinh thể) tách từ B Thuringiensis,

có tác dụng độc rõ rệt trên các cơ thể mục tiêu hoặc một protein nào đó có trình tự tương tự như protein cry đã biết

Properties and classification of B.t insecticidal toxins

Glick and Pasternak, 1998

Further classification of B.t toxins

Toxicity and specificity of B.t toxins

Glick and Pasternak, 1998

CÁCH PHÂN LOẠI MỚI ĐỘC TỐ BT

 Trước kia: phân loại dựa theo hoạt tính trừ sâu của độc tố

 Ngày nay: dựa vào sự sai khác thành phần axit amin ở mức 95, 78, 45% tương đồng chữ số 1, 2, 3… để phân biệt các cry có độ tương đồng axit amin nhỏ hơn 45%; chữ cái viết hoa (cry 1A, cry1B) có mức tương đồng

từ 45-78%; chữ cái nhỏ viết sau (cry 1Ab, cry1Ac) có độ tương đồng từ 78-95%

Relationship of different

cry genes

BT CRYSTALLINE DELTA-ENDOTOXIN

Hoạt tính của độc tố

• protoxin bị phân giải ở ruột giữa bởi protease và pH kiềm

• protoxin gắn vào vị trí đặc hiệu ở thành ruột giữa

•Gây loét thành ruột-gây phản ứng ngắn ăn

• gây thủng ruột và sâu non chết

Efflux of ATP and cations

Channel consisting

of toxin proteins

Epithel membrane

in the gut outside

inside

Integration of B.t toxin into membranes

Glick and Pasternak, 1998

BACTERIAL SPORES:

Spore formation in Bacilli:

Picture of Bacillus thuringiensis producing endospores

Glick and Pasternak, 1998

http://www.cf.ac.uk/biosi/staff/berry/chime/rintro.html

Development of Insect-Resistant Crops

X ác định chủng Bt đặc hiệu cho sâu cần diệt

Chi ết tách ADN mã hoá cho proten cry t ừ vi khuẩn

Chuyển DNA m ã hoá protein cry v ào cây trồng

Đánh giá sự biểu hiện, sự ổn định, hiệu quả và độ an toàn

Plants expressing Bt toxins

Corn Potato Sunflower Rapeseed Tobacco Apple

Cotton

http://www.agbios.com/main.php

Expression of some B.t insecticidal proteins in plants

Glick and Pasternak, 1998

Susceptibility of different plants to insect damage

Glick and Pasternak, 1998

Corn rootworm control

Effective

COTTON: RESISTANCE AGAINST COTTON BOLLWORM THROUGH B.T.-TOXIN

 Các biện pháp giảm tính kháng theo Bt của sâu

 Cải tiến làm tăng cường hiệu quả cây trồng

chuyển gen

a.a, chọn codon phù hợp, Promotor mạnh

2. Chuyển vào lục lạp:

TB nhiều lục lạp thể hiện theo procaryot Không lan tỏa qua hạt phấn

A 2TH STRATEGY:

genes in transgenic plants

CÁC CHẤT KÌM HÃM ENZYM TIÊU HOÁ

 Các chất kìm hãm α amylase, amylase

 Protein kìm hãm α amylase ngăn cản sự

sinh trưởng của sâu non bộ cánh cứng gây hại nhiều loại đậu.

 Gen mã hóa chất kìm hãm α amylase đã chiết tách được từ nhiều loại đậu

 Một promoter mạnh đã được thiết kế với

gen mục tiêu nhằm thể hiện mạnh protein này trong quá trình phát triển của hạt.

 Đã tạo được đậu chuyển gen theo hướng này.

AN EXAMPLE: TRANSGENIC PEAS EXPRESSING AMYLASE INHIBITOR FROM BEAN

 The result:

commercialization showed that the amylase

inhibitor from beans when expressed in peas may induce inflammatory symptons in th lungs of

mice, when spraed as a aerosol