Công nghệ vi sinh cơ bản

IV. Phân lập vi sinh vật 1. Mục đích Tách rời các tế bào vi sinh vật Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc 2. Phương pháp Mẫu được pha loãng theo nồng độ cần thiết (105, 106, 107, 108) Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp Dùng que trang trải đều mẫu khắp mặt thạch Hộp petri được đề ngày phân lập, đề mẫu phân lập, nồng độ pha loãng và được gói bằng giấy Ủ các đĩa trên ở nhiệt độ thích hợp trong một khoảng thời gian nhất định ta sẽ thu được các khuẩn lạc riêng rẽ Vi khuẩn: 32 – 350C  Thời gian 1 – 2 ngày đêm Nấm, xạ khuẩn 26 – 280C  Nấm men, mốc: 3 – 4 ngày Xạ khuẩn: 5 – 7 ngày

BÀI 1: PHÂN LẬP VI SINH VẬT

I Mục đích và yêu cầu của bài

Sinh viên nắm được các thao tác cơ bản của quá trình phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

II Hóa chất, nguyên liệu và dụng cụ

1 Nguyên liệu, hóa chất

Môi trường thạch trong đĩa petri (môi trường Pikovskaya, Hansen, Czapek – Dox)

Pikovskaya

(pH = 7)

Glucose Cao nấm men (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O Ca3(PO4)2 KCl MnSO4 2H2O FeSO4.7H2O Agar

10 0,5 0,5 0,1 5 0,2 0,002 0,002 20

Hansen

pH = 5 – 6,5

Glucose (Saccharose)

Pepton KH2PO4 MgSO4.7H2O Agar

50 10 3 2 20

Czapek – Dox

pH = 5,0 – 5,5

Saccharose NaNO3 KCl FeSO4 MgSO4 K2HPO4 Agar

30 3,5 0,5 0,01 0,5 1,5 20

- Nguồn mẫu để phân lập: Đất, nước dưa chua, bánh men…

2 Dụng cụ

- Que trang, pipet (hút lượng 1ml, 100 µm)

- Ống nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri

- Đèn cồn, đèn ga

III Cách thức pha loãng mẫu

1 Mục đích

Mẫu pha loãng ở nồng độ thích hợp sẽ giúp ích trong quá trình định lượng và phân tích vi sinh vật

2 Phương pháp

- Đối với mẫu chất lỏng (nước dưa, dịch quả, …): Dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng → ta thu được nồng độ pha loãng là

10-1

- Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng → ta được độ pha loãng là 10-2

- Tiếp tục như vậy cho đến nồng độ cần thiết

- Đối với mẫu chất rắn (đất, nem chua, bánh men, …): Nghiền nhỏ mẫu, lấy 1 g chất rắn cho vào 10 ml nước vô trùng, lắc đều Lấy 1 ml huyền phù này cho vào 9

ml nước sạch vô trùng → ta có độ pha loãng là 10-1

- Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng → ta được độ pha loãng là 10-2

- Tiếp tục như vậy cho đến nồng độ cần thiết

IV Phân lập vi sinh vật

1 Mục đích

- Tách rời các tế bào vi sinh vật

- Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc

2 Phương pháp

- Mẫu được pha loãng theo nồng độ cần thiết (10-5, 10-6, 10-7, 10-8)

- Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp

- Dùng que trang trải đều mẫu khắp mặt thạch

- Hộp petri được đề ngày phân lập, đề mẫu phân lập, nồng độ pha loãng và được gói bằng giấy

- Ủ các đĩa trên ở nhiệt độ thích hợp trong một khoảng thời gian nhất định ta sẽ thu được các khuẩn lạc riêng rẽ

- Vi khuẩn: 32 – 350C ⇒ Thời gian 1 – 2 ngày đêm

- Nấm, xạ khuẩn 26 – 280C ⇒ Nấm men, mốc: 3 – 4 ngày

Xạ khuẩn: 5 – 7 ngày

3 Yêu cầu

- Xác định số lượng và mô tả đặc điểm khuẩn lạc (màu sắc, kích thước, mép khuẩn lạc…) của các chủng vi sinh vật phân lập được

BÀI 2: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

CỦA VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI

I Mục đích và yêu cầu

- Sinh viên biết cách sử dụng kính hiển vi quang học; cách làm tiêu bản tạm thời, tiêu bản cố định

- Nắm được cách nhuộm màu các tiêu bản

II Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ

1 Hóa chất

- Dung dịch Fucxin, xanh metylen, tím gentian

- Dung dịch Lugol (dung dịch được giữ trong lọ thủy tinh màu tối; dùng iốt trong vòng 30 ngày): 1g iot tinh thể; 2g KI; 300 ml nước cất

- Cồn 700

2 Nguyên liệu

- Ống thạch nghiêng hoặc đĩa petri có các loài vi sinh vật cần nghiên cứu (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc)

3 Dụng cụ

- Lamen, lam kính

- Que cấy, đèn cồn, giấy lọc, bình tia

- Kính hiển vi, dầu soi

III Các cách làm tiêu bản

1 Tiêu bản tạm thời

a/ Đặc điểm

-Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh

-Quan sát được trạng thái sống của tế bào: Hình dạng, kích thước, sự sắp xếp của các tế bào

- Chỉ sử dụng một lần rồi bỏ

Cách tiến hành:

-Trên phiến kính khô và sạch, nhỏ một giọt nước sạch vô trùng, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật mọc trên môi trường đặc; đặt nhẹ vào phiến kính chỗ có nước , hòa đều

- Nếu vi sinh vật cần xem đang sống trong canh trường thì dùng que cấy vòng đưa ngay một giọt canh trường lên phiến kính

- Đặt lamen lên giọt canh trường khéo léo sao cho không tạo thành bọt khí nhỏ ở trong tiêu bản, làm cản trở khi xem tiêu bản trên kính hiển vi

- Nếu giọt dịch quá nhiều, tràn ra ngoài lamen thì dùng giấy thấm bớt nước đi

- Quan sát trên kính hiển vi (nấm men, nấm mốc): Vật kính x10; x40

Làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu

+ Nhỏ một giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen lên lam kính

+ Nhỏ một giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm

+ Đậy lamen

+ Quan sát tiêu bản ở vật kính x10; x40

2 Làm tiêu bản cố định nhuộm màu

* Làm vết bôi:

- Chọn lam kính sạch và khô (cho một ít nước cất lên lam kính)

- Lấy sinh khối vi sinh vật dàn đều trong giọt nước cất

- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí

Chú ý: Lượng vi sinh vật lấy vừa phải, vết bôi tròn, gọn thật mỏng

* Cố định vết bôi:

- Dùng kẹp gắp giữ phiến kính sao cho vết dịch có vi sinh vật ở phía trên,

- Hơ mặt dưới của lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, tránh không để quá nóng

* Nhuộm màu tiêu bản cố định:

+ Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím gentian (trong 1 – 2 phút); rửa nước + Nhuộm Lugol (1 phút); rửa nước

+ Tẩy cồn 30 giây (nhỏ từ từ giọt cồn cho đến khi tan hết màu); rửa nước

+ Nhuộm bổ sung Fucshin hoặc safranin 10 – 30 giây

+ Rửa nước làm khô tiêu bản và soi với vật kính dầu (x10; x100)

3 Yêu cầu

- Biết được hình dạng của tế bào, cách sắp xếp của các tế bào, vị trí của bào tử trong tế bào

- Cấu tạo sợi nấm (có vách ngăn hay không)

- Cấu tạo cơ quan sinh sản: Cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản;

- Bào tử: Hình dạng, cách sắp xếp bào tử

BÀI 3: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

SỨC NỞ CỦA BỘT MỲ

I Mục đích và yêu cầu

- Sinh viên biết được quy trình làm bánh mỳ, các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình làm bánh

- Nắm được vai trò của nấm men trong sản xuất bánh mỳ

II Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ

- 1 kg bột mỳ, men

- Đường, muối

- Nước cất, dầu ăn

- Ống đong V= 250 ml, 500 ml;

- Bể ổn nhiệt

III.Cơ sở lý thuyết

Dựa vào hoạt động của nấm men Saccharomyces cerevisiae chuyển hóa đường

có trong bột mỳ thành C2H5OH và CO2 Chính CO2 là tác nhân làm bánh mì nở do CO2 được giữ lại trong các mạng gluten (là một loại protein đặc biệt, được tạo thành khi glutenin (glutelin) liên kết với gliadin (prolamin), có tính chất đàn hồi và tạo mạng) trong bột mỳ Khả năng lên men càng mạnh, độ xốp của bánh càng nhiều, bánh càng nở Trong quá trình lên men cũng xảy ra lên men acid tạo độ acid cho bột; các phản ứng hóa sinh tạo các sản phẩm ester, aldehyde nhằm tích tụ hương thơm và mùi vị đặc trưng cho bánh mỳ

Quy trình làm bánh mỳ:

IV.Các bước tiến hành

1.Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ men đến sức nở bột mì

CT1: 100g bột mì + 1g men + 5g đường + 1g muối + 60ml nước

CT2: 100 g bột mì + 2g men + 5g đường + 1g muối + 60ml nước

CT3: 100 g bột mì + 3g men + 5 g đường + 1g muối + 60 ml nước

- Thứ tự bổ sung các thành phần:

Bột-> men->Đường->muối-> trộn đều-> nước

- Cho bột nhào đã chuẩn bị vào 3 ống đong và đo thời gian để khối bột tăng thể tích gấp 2

2.Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ khác nhau đến sức nở bột mì

Công thức trộn: 100 g bột mì + 1g men + 5 g đường + 1g muối + 60 ml nước

- Thứ tự bổ sung các thành phần:

Bột-> men->Đường->muối-> trộn đều-> nước

- Cho bột nhào đã chuẩn bị vào 3 ống đong và để ở 3 nhiệt độ khác nhau 300C,

400C, 500C ; đo thời gian để khối bột tăng thể tích gấp 2

3.Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của độ ẩm ủ khác nhau đến sức nở của bột mì:

CT1: 100g bột mì + 1g men + 5g đường + 1g muối + 50 ml nước

CT2: 100 g bột mì + 1g men + 5g đường + 1g muối + 60 ml nước

CT3: 100 g bột mì + 1g men + 5 g đường + 1g muối + 70 ml nước

- Thứ tự bổ sung các thành phần:

Bột-> men->Đường->muối-> trộn đều-> nước

Lên men

Khía bánh Nướng

Làm nguội, Bảo quản

-Cho bột nhào đã chuẩn bị vào 3 ống đong và đo thời gian để khối bột tăng thể tích gấp 2

4 Yêu cầu

- Xác định được thời gian để khối bột tăng thể tích gấp 2 trong từng thí nghiệm và đưa ra nhận xét

BÀI 4: LÊN MEN SỮA CHUA I.Mục tiêu:

- Sinh viên trình bày được cơ chế của quá trình lên men sữa chua, quy trình làm sữa chua, yêu cầu chất lượng sữa chua

- Biết cách chuẩn độ, quan sát đánh giá cảm quan sản phẩm sữa chua

II.Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ

2.1 Nguyên vật liệu

- Sữa đặc: 1hộp

- Sữa chua Vinamilk: 1hộp

- NaOH 0,1N

- Phenolphtalein 1%

2.2 Dụng cụ - thiết bị

- Bình lớn, bể điều nhiệt

- Nhiệt kế, máy đo pH

- Buret, bình tam giác

- Đũa, thìa, bát, cốc nhựa

III Các bước tiến hành

3.1 Chuẩn bị sữa

- Hòa tan 3 thìa sữa đặc trong 200 ml nước ấm (40oC)

3.2 Cấy giống

Cấy giống từ hộp sữa chua Vinamilk (5 thìa)

3.3 Lên men

- Dịch lên men chia làm 2 phần;

- Lên men ở 2 nhiệt độ 40oC, nhiệt độ phòng (25oC) trong 2-3h

3.4 Làm lạnh

- Làm lạnh nhanh trong bể nước đá

3.5 Yêu cầu

3.5.1 Xác định độ chua tính theo acid lactic

- Dùng một dung dịch kiềm chuẩn (NaOH hoặc KOH) để trung hoà hết các acid trong thực phẩm, với phenolphtalein làm chỉ thị màu

- Xác định độ chua của sữa sau 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút lên men

- Kết quả được tính theo công thức: X % = V* K* 100/P

Trong đó:

X: hàm lượng acid lactic sinh ra (%)

K: hệ số sử dụng cho từng loại acid (K = 0,009)

V: thể tích NaOH 0,1N

P: khối lượng hoặc thể tích mẫu

3.5.2 Xác định các chỉ tiêu cảm quan của sữa chua (màu sắc, mùi vị,

trạng thái)

BÀI 5: LÊN MEN CƠM RƯỢU

I Mục tiêu

-Sinh viên nắm được cơ sở khoa học của quá trình sản xuất cơm rượu, vi sinh vật tham gia trong quá trình sản xuất

- Biết quy trình lên men rượu; quan sát, đánh giá sản phẩm tạo thành

II Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ

2.1 Nguyên vật liệu

- 1kg nếp thường

- Bánh men

- Muối, nước sôi để nguội

2.2 Thiết bị và dụng cụ

- Khay (mâm), bình (lọ) nhựa rộng miệng, có nắp đậy (5 cái)

- Chày, cối

III Các bước tiến hành

- 1kg nếp ngon, đãi vo sạch đã được nấu chín thành xôi

- 50 g bánh men được giã nhuyễn (lọ 1); và 25 g bánh men được giã nhuyễn (lọ 2)

- Pha loãng 1 muỗng cà phê muối + 200 ml nước

- Trải mỏng xôi ra khay (mâm) cho mau đi hơi, rắc đều men lên mặt xôi, trộn đều, cho vào trong lọ 1 và 2 khoảng 3/5 dung tích, đậy kín trong 4- 7 ngày

IV Yêu cầu

-Sinh viên báo cáo kết quả thí nghiệm (đánh giá cảm quan chất lượng cơm rượu, màu sắc, mùi vị…), giải thích được cơ chế quá trình lên men, quy trình công nghệ

- Cơm rượu đạt là có nước rượu ứa ra đọng lại từ từ, mùi rượu ngào ngạt