Vài trò của vi sinh vật trong sản xuất enzyme amylaza

Một trong những thành tựu khoa học và công nghệ trong những năm gần đây llà các nghiên cứu và ứng dụng về enzymes.Nó đặc trưng cho sự phát triển của khoa học trong mấy thập niên qua: Đó là những khám phá về cấu trúc hoá họcvà cơ chế xúc tác kỳ diệu của enzymes – chất xúc tác sinh học.Enzymes đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong ngành công nghệ sinh họchiện đại và cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lý thuyết,các ứng dụng của enzyme ngày càng được mở rộng và đạt được hiệu quả cao.

Đề tài: “sản xuất enzym amylase”

I.Đặt Vấn Đề

• Một trong những thành tựu khoa học và công nghệ trong những năm gần đây llà các nghiên cứu và ứng dụng về enzymes.Nó đặc trưng

cho sự phát triển của khoa học trong mấy thập niên qua: Đó là những khám phá về cấu trúc

hoá họcvà cơ chế xúc tác kỳ diệu của enzymes – chất xúc tác sinh học.Enzymes đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong ngành công nghệ sinh họchiện đại và cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lý thuyết,các ứng dụng của enzyme ngày càng được mở rộng và đạt được hiệu quả cao.

• Ở Việt Nam công nghệ enzymes đang được

quan tâm và đàu tư mạnh để đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ở nước ta sản xuất enzymes còn nhỏ chủ yếu ở các phòng thí nghiệm ở Vện công nghệ Thực Phẩm và ở các trường đại học

lớn,việc áp dụng vào các ngànhcông, nông

nghiệpvà đời sống còn rất hạn chế.Cho tơi nay mới có khoảng 30 loại enzymes được ứng dụng

ở quy mô lớn và được sử dụng nhiều nhất là

enzymes Amylase trong nhiều lĩnh vực: công

nghiệp dệt, công nghiệp giấy,nông nghiệp, y

học, xử lý môi trường , đặc biệt trong công

nghiệp thực phẩm

• Với phạm vi ứng dụng rộng rãi cung như lợi ích mà

enzymes Amylase mang lại cho các ngành công

nghiệp do đó nhu cầu enzymes ngày càng lớn,tuy

nhiên số chế phẩm enzymes amylase vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ma vẫn phải nhập từ nước ngoài nên việc ứng dụng các chế phẩm còn hạn chế

• Vì vậy yêu cầu đặt ra cho các nhà nghiên cứu để tim

ra quy trình sản xuất enzymes với số lượng cao, chấy lượng tốt, giá thành rẻ

• Trong các nguồn thu nhận ezymes amylase thì việc thu hồi enzymes amylase từ VSVlà phương pháp tối

ưu nhất.Do VSV sinh sản nhanh, tạo sinh khối lớn,

quy trình sản xuất không gặp nhiều khó khăn, hiệu

suất thu hồi cao…Vậy chung tôi đề xuất quy trình:”

Sản Xuất Enzymes Amylase Từ Vi Sinh Vật”

II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.

• *Ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt

gồm những giai đoạn sau:

• -Chuẩn bị:

• a.Nguyên liệu chuẩn bị nuôi cấy có thể là bột ngô, cám gạo,vỏ

trấu, vỏ lạc …và được phối trộn theo tỷ lệ sau:

II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.

• b.Hấp phối liệu.

• -Sau khi trộn đều ta đưa phối liệu vào hấp

nhằm hai mục đích: hấp chín nguyên liệu và tiệt trùng.Thời gian hấp kéo dài từ 3,4-4h nếu tiến hành ở áp suất thường và 2h nếu ở áp

suất 2kg/cm2.Nguyên liệu khi chin phải có mùi thơm nhẹ và dễ chịu.

• -Tiếp theo đem vò tơi và làm nguội tới

34-350C rồi trộn giống vào tuỳ theo chất lượng

của giống(Tỷ lệ giống có thể đưa vào từ

0,2-1%.

• -Tốt nhất là hoà nấm giống vào dung dịch HCl

0.1N Để yên khoảng 30 phút loại tạp khuẩn sau đó vẩy vào môi trường và trộn đều

II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.

• d.Tải canh trường vào mành mành phải

được vệ sinh, thanh trùng và làm ráo

nước,Khi tải canh trường vào mành mành phải chú ý giữ vệ sinh tay chân và dụng cụ nhằm tránh bị lẫn tạp các loại VSV bất

lợi.Chiều dầy canh trường phải đều, là

3cm nếu vào mùa đông và 2cm nếu vào

mùa hè, xung quanh mép mành nên vun dầy hơn để tránh bị khô

II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.

• e.Phòng nuôi mốc.

• - Tuỳ thuộc vào năng suất và cách bố trí sản xuất của xí nghiệp mà phòng nuôi có thể khác nhau.Chiều cao nên từ3-3.5m ,có hệ thống

điều hoà giúp giữ nhiệt độ và độ ẩm ổn định nếu không có thể bố trí hệ thống ống phun

nước quanh tường ,phun nước lạnh vào mùa

hè ,nước ấm vào mùa đông.Giá đặt mành nên

có chiều cao vừa phải để dễ thao tác, khoảng cách giữa các mành là 0.2m, mỗi giá đặt 6-7 mành.

• *Quá trình phát triển của nắm chia làm 3 giai đoạn.

• -Gđ1:Nầm phát triển chậm, nhiệt đọ chưa tăng mùa đông cần giữ ẩm để nâm phat triển bình thương.

• -Gđ2: Nầm phát triển mạnh , toả nhiệt, nhiệt độ canh có thể đạt tới 400C vị vậy phải tải nhiệt kịp thời Cần tăng cường không khí lạnh , ẩm để làm ổn đinh nhiệt độ và cung cấp oxygen để cho nầm phat triển bình thường.Sau 20-24h nấm tạo nhiều sợi lien kết thành mảng lớn cần dung que vô trùng lật dưới lên trên nhằm tạo điều kiện toả nhiệt tốt(không làm vỡ nấm thành

những miếng bé gây tổn thương tới sự phát triển của sợi nấm)

• -Gđ3:Nấm phát triển chậm dần, nhiệt độ giảm nhưng enzymes vẫn được tích tụvà đạt cao ở cuối giai đoạn khi trên bề mặt

nấm lơ thơ xuất hiện các bào tử.Nếu kéo dài để bào tử mọc

nhiều sẽ làm giảm hoạt độ của enzymes.Khi kết thúc chu kỳ

nuôi cấy ta có thể sử dụng ngay sản phẩm để đương hoá tinh bột hoăc đem sấy ở 40-500C đến độ ẩm còn 8-10% sau đó

đưa đi bảo quản

III.Sản xuất enzymes từ vi khuẩn.

• -α Amylase được sản xuất từ vi khuẩn

Bacillus stearothermophillus và Bacillus

licheniformis Đặc biệt người ta phát hiện ra

α Amylase từ Bacillus licheniformis có nhiều

ưu điểm hơn hẳn so với các vi khuẩn khác

đó là khả năng chịu nhiệt cao(nhiệt độ tối ưu

là 90-950C) thậm chí có thể chịu đựng được nhiệt độ từ 105-1100C.Chủng vi khuẩn

Bacillus licheniformis tham gia suất α

Amylase là Bacillus licheniformis B.56

III.Sản xuất enzymes từ vi khuẩn.

• 3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus licheniformis

• -Là trực khuẩn Gram(+), sinh bào tử hình

ovan,không phình thuộc nhóm II theo phâm loại của priest và (S)

• -Các tế bào vi khuẩn này đứng riêng lẻ hoặc sắp xếp với nhau thành từng chuỗi tế bào ngắn ,

nhỏ, có chiều dài thay đổi tuỳ từng chủng từ 5μm, đường kính từ 0.5-1μm

1-III.Sản xuất enzymes từ vi khuẩn.

• 3.2.Sản xuất α Amylase từ Bacillus licheniformisB56.

• *Môi trường nuôi cấy:Dùng môi trường tinh bột gạo, ngô,

sắn tuy nhiên qua nghiên cứu cho thấy nuôi cấy từ môi trương tinh bột gạo cho hiệu quả kinh tế lớn nhất.

• *Phương pháp nuôi cấy:Thời gian lên men thích hợp nhất để thu hồi là 48h sau đó nuôi cấy với chế độ lắc 200vòng/phút, ở 370C,pH = 6.5

• *Thu hồi:Lượng enzymes được sản xút ra thu hồi qua kết tủa bằng enthanol nồng độ 75%,tỷ lệ enthanol/ dịch enzymes thích hợp là 3.5/1

• -sau khi kết tủa đem sấy nhan ở 500C để đuổi hết lượng

enthanol dư.

• -Lượng enzymes kết tủa sẽ đựoc thu hồi bằng cách cho ly

tâm với tốc độ 500vòng/phút trong thời gian 2phút

IV.Sử dụng nấm men E.fibuligera

E.capsularis (Endomycopis) lên men

chìm để sản xuất amylase.

• E.fibuligera là loại protease acid ,phạm vi pH ổn

định4.5-7 và pH tốt nhất 2.3-2.6.Có khả năng lên men chậm và yếu các đường

glucose,sacarose,mantose.Đồng hoá được mantose, sacarose,eritose, không lên men galactose, không

đồng hoá galactose,xilase,Bào tử hình dạng mũ

• E.capsularis lên men chậm glucose, mantose,đồng

hoá mantose,eritose, không lên men được

galactose,sacarose.Không đồng hoá được

galactose,sacarose,xilase.Bào tử hình bầu dục

IV.Sử dụng nấm men E.fibuligera

E.capsularis (Endomycopis) lên men

chìm để sản xuất amylase.

• Endomycopis để phát triển tốt và sinh sản nhiều

amylase cần nguồn cacbon là tinh bột, nitơ là cám, (NH4)2SO4 và cần các chất khoáng(K,P ) và acid

béo,lipid chứa trong(dầu cám,dầu hạt bôngdầu hạt cải).Có thể sử dụng các môi trường với tỷ lệ sau:

• 1:tinh bột(0.8%),cao ngô(1.5%),bột cá(0.5%),

(NH4)2SO40.33% ,CaCl20.04, KH2PO40.15%

• 2:Bột ngô 4.75%,bột đậu tương 6.2%, cao ngô 2.7%,KH2PO42.25%

• 3:Cám tiểu mạch 5%, tinh bột 1% ,dầu cám 3-5%, KH2PO40.1%

IV.Những biến đổi chủ yếu xảy ra khi nuôi cấy VSV với mục đích thu nhận

enzymes.

• Để sinh trưởng và phát triển các VSV cần năng lượng được cung cấp bởi quá trình oxyhoa Glucid hoàn toàn hoặc không hoàn toàn:

• *Tinh bột + đường→CO2 + H2O +Q1

• CO2 + Rượu + acid hữu cơ

• *protid→pepton→polypeptidđaciamin

• Song song với quá trình thuỷ phân là quá trình tổng

hợp protid và tinh bột tử acid amin và đương đơn

giản

• 3C6H12O6+3O2→ 6CH3CHO+6H2O+ 6CO2

• 6CH3CHO+ 3NH3 +9/2O2 →C12H20N3O4+ 6.5H2O

VI.Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh

trưởng và phát triển của VSV và tích

luỹ enzymes

• 6.1.Chủng VSV: Đây là điều quan trọng hàng

đầu ,muốn có chế phẩm với hoạt độ cao trước hết phải tuyển chọn nghiên cứu xemchủng ,giống nào

có khả năng tích tụ nhiều enzymes mà ta mong

• 6.2.Môi trường dinh dưỡng:Khi nuôi cấy ta có

thể sử dụng nhiều chất khác nhau để chuẩn bị môi trường.Cho tới nay sử dụng nguyên liệu là thực vật là chủ yếu.Trong sản xuất chế phẩm amylase theo phương pháp bề mặt hay dung nhất là cám lúa mỳ(Chứa khoảng 20-30%tinh bột và 10-12% là protid ngoài ra còn chứa các nguyên tố vi lượng, muôí khoáng,vitamin.)Ở

nước ta do không có cám lúa mỳ nên thay thế bằng bột ngô vàng ,cám ngô, trấu đem trộn lẫn theo tỷ lệ khác nhau.

• Ngoài tinh bột môi trường cần chứa mantose và

dextrin.Sựcó mặt của glucose ,fructose, sacarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự tích tụ enzymes.Ngược lại khi cho

thêm lactose và MgO vào môi trường thì nấm mốc kém phát triển nhưng lại tích tụ nhiều amylase

• Ngoài Glucid để phát triển và tổng hợp enzymes

VSV đều cần đến protid và các sản phẩm thuỷ phân của chúng.Nguồn nitơ có thể có sẵn trong nghuyên liệu hoặc bổ xung từ tinh dầu lạc, khô dầu đậu

tương hoặc từ các muối amonium hoăc urê.Nấm

mốc Asp.awanori có thể phát triển tốt trong môi

trường chứa 0.05% đạm vô cơ nhưng để tạo ra

α-amylase thì cần tăng nồng độ lên0.15%,để tạo ra

glucoamylase thì cần tăng lên 0.4%

• 6.3.Điều kiện nuôi cấy

• *Nhiệt độ:Nấm men và nấm mốc có nhiệt độ tối

ưu 28-320C vi khuẩn 34-380C.Biết rằng trong quá trình sinh trưởng và phát triển VSV phải

đồng hoá chất dinh dưỡng và thải ra một lượng nhiệt khá lớn, do đó cần có trang thiết bị phù

hợp để duy trì ổn định nhiệt độ canh trường

• *Độ ẩm môi trường:Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu nằm trong giới hạn65-70%.Trong thực tê sản xuất với mức độ

vô trùng không bằng trong phòng thí nghiệm

nên thưòng nuôi cấy ở ẩm độ thấp hơn nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn(50-60%)

• Oxygene:Rất cần thiết trong quá trình tích tụ enzymes, khi nuôi theo phương pháp bề

mặt, nấm men và nấm mốc dễ dàng tiếp

xúc với không khíqua sợi nấm và mixen qua

đó nhận được O2 từ không khí.Do đó môi

trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo

nhiều sợi và tích tụ được nhiều.

• Mức độ hoà tan O2 phụ thuộc vào nhiều

yếu tố:nhiệt độ,nồng độ chất va phương

pháp sục khí,nhiệt độ cao thì O2 hoà tan

kém còn nồng độ tỷ lệ nghịch với hoà tan

O2

V.Kết luận

- Qua nghiên cứu và tìm hiểu các phương

pháp sản xuất enzymes amylase đăc biệt là nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của VSV và quá trình tích luỹ

ezymes chúng ta thấy được tầm quan trọng của E.amylase trong cuộc sống.Qua đó sẽ

nghiên cứu để sản xuất ra enzymes có chất lượng cao và giá thành rẻ và đươc ứng dụng rộng rãi trong đời sống.

-