công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp chuyển gen ở thực vật và các ứng dụng

Biến nạp gen ở thực vật là gì?• Chuyển gen /Biến nạp gen/ kỹ thuật di truyền ở thực vật là khái niệm dùng mô tả quá trình chuyển một hoặc một số gen ngoại bào vào trong tế bào thực vật

CÔNG NGHỆ SINH ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

Giảng viên hướng dẫn: …….

CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

VÀ CÁC HƯỚNG ỨNG DỤNG

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Biến nạp gen ở thực vật là gì?

• Chuyển gen /Biến nạp gen/ kỹ thuật di truyền ở thực

vật là khái niệm dùng mô tả quá trình chuyển một hoặc một số gen ngoại bào vào trong tế bào thực vật nhằm tạo ra một tính trạng mới mà trước đó cơ thể thực vật

đó không có.

• Gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc

gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen

• Các gen biến nạp có thể có nguồn gốc khác nhau Nó

có thể được tách ra từ một nguồn tế bào khác có trong

tự nhiên, hoặc được tổng hợp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

• Quá trình biến nạp gen được coi là thành công khi

gen biến nạp sau quá trình chuyển gen kết hợp ổn định của ADN của hệ gen nhân của tế bào biến nạp Tế bào biến nạp này sau đó được tái sinh thành cây hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen biến nạp, và duy trì ổn định trong các thế hệ sau nhờ quá trình thụ tinh bình thường.

Biến nạp gen ở thực vật là gì?

Mục đích biến nạp gen ở thực vật

Việc biến nạp gen ở thực vật th-ờng nhằm các mục đích sau:

1 Nghiên cứu và làm sáng tỏ chức năng của một gen đ-ợc quan tâm hay

từng phần của gen đó.

2 Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào.

3 Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu

nhận đ-ợc các tính trạng mới ở tế bào và cây chuyển gen.

Trong đó, các gen quy định các tính trạng mong muốn sau đ-ợc quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả:

+ Các gen kháng bệnh (virus, nấm, vi khuẩn, sâu bệnh, giun tròn…)

+ Gen chịu hạn, lạnh, và các diều kiện bất lợi khác của môi tr-ờng

+ Gen kháng thuốc diệt cỏ

+ Gen cải tạo các đặc tính về chất l-ợng (thay đổi thành phần axít béo, tăng c-ờng thành phần axít không no, tăng c-ờng thành phần các axít amin không thay thế, gen chín chậm, v.v…)

+ Sản xuất cỏc hơp chất sinh học nhõn tạo, nhiờn liệu sinh học

quá tr ình biến nạp gen ở thực vật

Giai đoạn 1. Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp).

Trong giai đoạn này, gen mong muốn th-ờng đ-ợc chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật.

Giai đoạn 2. Giai đoạn tái sinh cây.

Trong giai đoạn này, các mô tế bào đ-ợc chuyển gen đ-ợc chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây.

Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp ch-a thành công.

Giai ®o¹n ChuyÓn gen

•Gene mục tiêu

•Promoter

•Gene chọn lọc/ chỉ thị

C¸c vÐct¬ mang gen biÕn n¹p ®-îc chuyÓn

vµo tÕ bµo thùc vËt nh- thÕ nµo?

C¸c ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen

®-îc sö dông phæ biÕn gåm cã:

1 Ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen gi¸n tiÕp

- Th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens / A rhizogens

2 C¸c ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp

- Ph-¬ng ph¸p dïng sóng b¾n gen (particle inflow gun / bommbardment)

- Ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê xung ®iÖn (electroporation)

- Ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê PEG (polyethylene glycol)

- Ph-¬ng ph¸p vi tiªm (microinjection)

ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê

Agrobacterium

Agrobacterium spp là vi khuẩn đất, Gram (-) có hình

rod-shaped, thường gây ra một số bệnh hại cây trồng

Nghiên cứu ít hơn nhưng có đặc tính sinh học rất giống

A tumefaciens

Giíi thiÖu vÒ vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens vµ A rhizogens

Cơ chế gây bệnh của Agrobacterium ?

-Tìm ra thành phần plasmid lớn chính là nguyên nhân gây

bệnh Plasmid của A tumefaciens này đƣợc gọi là Ti

(tumour inducing) plasmid (140-130 kb).

-Các plasmid này đƣợc giả thuyết là chuyển một cách chủ động vào tế bào chủ nhƣng sự phát triển của công nghệ lúc đó chƣa cho phép phát hiện lƣợng nhỏ ADN đƣợc thêm vào bộ genom khá lớn của thực vật.

- Với sự phát triển của công nghệ ADN tái tổ hợp (e.g.restriction enzymes; DNA-DNA blot hybridization), các tiến bộ về hóa sinh và di truyền, người ta đã chứng minh được rằng chỉ có một phần nhỏ của Ti plasmid đã được chuyển vào tế bào chủ

và phần nhỏ này chính là một đoạn ADN (T-DNA, DNA) được tổ hợp vào bộ genom của cây chủ.

R-A Tumefaciens Ti Plasmid

T-DNA chứa 2 nhóm gen:

 Oncogen: mã hóa các gen sinh tổng hợp phytohormone

(auxin and cytokinin)

 Opines: mã hóa các gen sinh tổng hợp và đồng hóa các

opines

 Các gen này chỉ được phiên mã trong giới thực vật

Auxin và Cytokinin

 Vùng T-DNA mã hóa cho một số gen tổng

hợp các hormon thực vật như auxin và

cytokinin

 Auxins và cytokinins kích thích sự sinh

trưởng mạnh mẽ của tế bào thực vật và gây

ra sự phát triển các khối u

 vùng bờ phải đóng vai trò quan trọng trong

việc cắt T-DNA Vùng bờ trái đóng vai trò

trong việc ghép T-ADN vào genom cây chủ.

RB: 5’ TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN 3’

LB: 5’ TGGCAGGATATATNNNNNTGTAAAN 3’

Virulence (vir) Genes

 Các phân tử nhỏ được tiết ra ở các thực vật bị thương (i.e., acetosyringone) cảm ứng sự hoạt

động của các gen vir (là vùng chứa khoảng 35

kb bao gồm 6-9 đơn vị sao mã (virA, B, C, D,

E, F, G, H, J) mã hóa trên Ti plasmid

 Các gen vir cần thiết cho việc chuyển và tổ

Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật

Đầu tiên, là sự hình thành một vết đứt (nick) tại vị trí vùng biên phải RB của

đoạn T-ADN Đoạn gen này sau đó đ-ợc tách ra khỏi plasmid nhờ sự hình thành một đoạn đứt thứ hai Đoạn đứt này th-ờng không có định đối với các plasmid khác nhau Trong khi các axít nucléic trống tạo ra trên plasmid

đ-ợc lấp đầy theo nguyên tắc bổ trợ của các axít nucléic thì đoạn T-ADN

đ-ợc tách ra đ-ợc bám bởi một prôtêin bám sợi đơn (SSBP - single strand binding prôtêin) Nhờ phức hợp với SSBP này mà đoạn gen T-ADN đ-ợc chuyển vào nhiễm sắc thể cây chủ theo một cơ chế đến nay ch-a biết rõ.

Ti plasmid

Sự kết hợp của gen biến nạp với gen nhân thực vật

Các hệ thống vector chuyển gen

 Các gen vir cần thiết cho quá trình chuyển và tổ hợp đoạn T-DNAhai

hệ thống vector được phát triển nhằm đảm bảo được chức năng của

các gen vir

1 Hệ thống vector đồng liên hợp (Cointegrate vector system)

2 Hệ thống vector kép (Binary vector system)

Vector đồng liên hợp

Vectors kép

Các b-ớc thực hiện ph-ơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

1 Thiết kế véctơ mang gen biến nạp

2. Nhân (tách dòng – cloning) véctơ nhờ Vi khuẩn E coli

3. Chuyển véctơ mang gen biến nạp từ vi khuẩn E coli sang Agrobacterium

4. Lây nhiễm Agrobacterium mang véctơ chứa gen biến nạp với tế bào / mô

thực vật để tiến quá trình chuyển gen biến nạp sang mô / tế bào đích

5 Chọn lọc các tế bào / mô đã đ-ợc biến nạp thành công

6 Tái sinh mô / tế bào đã đ-ợc biến nạp thành công thành cây biến nạp

hoàn chỉnh (và đánh giá sự biểu hiện của gen biến nạp)

Qu¸ tr ×nh chuyÓn gen biÕn n¹p vµo tÕ bµo thùc vËt vµ t¸i sinh c©y

Ph-¬ng ph¸p biÕn n¹p nhê vi khuÈn Agrobacterium

Ti plasmid mang gen biÕn n¹p

TÕ bµo thùc vËt

ADN nh©n

Gen biÕn n¹p

Qu¸ tr×nh biÕn n¹p

TÕ bµo mang gen biÕn n¹p ph©n chia

C©y chuyÓn gen

Kỹ thuật đĩa lá

ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen TRỰC TIẾP

Ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp

Kü thuËt sö dông sóng b¾n gen

• Kü thuËt Xung điện

Kỹ thuật sử dụng súng bắn gen

• Các hạt cấu tạo từ vàng hoặc tungsten hỡnh cầu có đ-ờng kính

1-1,5  m đ-ợc bao bọc bằng các vectơ tái tổ hợp chứa DNA cần chuyển nạp (đã đ-ợc ng-ng kết tr-ớc đó với CaCl2, spermidine hoặc polyethylene glycol).

• Các hạt này đ-ợc đẩy đi với tốc độ cao (300 đến 600 m/s) nhờ

một thiết bị đặc biệt gọi là súng bắn gen sử dụng không khí nén, hoặc helium để cung cấp lực đẩy.

• ở các tốc độ trên, các hạt sẽ xâm nhập qua thành tế bào và các

màng

• Mật độ sử dụng của hạt không gây ra các h- hại nghiêm trọng

đến tế bào.

Ph-¬ng ph¸p biÕn n¹p gen b»ng sóng b¾n gen

Dßng khÝ Heli Dßng khÝ Heli

Mµng næ

Mµng bay

H¹t mang ADN L-íi ch¾n

Buång ch©n kh«ng

M« thùc vËt M«i tr-êng nu«i cÊy m«

TV

Ph-¬ng ph¸p biÕn n¹p gen b»ng sóng b¾n gen

He

Vacuum chamber

Target tissue Biolistic Transformation or

Microprojectile Bombardment

Rupture disk

High pressure gas inlet

BioRad ‘Helios’ portable gene gun

Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen

Nh-ợc điểm -u điểm

1 Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế

4 Các véctơ mang gen tái tổ hợp có cấu tạo đơn

giản Không đòi hỏi cấu trúc gen kiểu T-ADN

Agrobacterium.

5 Chỉ cần một l-ợng nhỏ plasmid ADN.

6 Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể

quan sát thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp.

1 Nhiều bản sao của gen biến nạp có thể đ-ợc chuyển vào tế bào cùng lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững.

2 Hiệu quả chuyển gen thấp.

3 Đòi hỏi thiết bị đắt tiền (không phải PTN nào cũng có thể đầu t-) Chi phí vật t- đắt (v.d hạt vàng, volfram, )

Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng xung điện

 Ph-ơng pháp chuyển gen nhờ xung điện

th-ờng đ-ợc sử dụng cho việc chuyển gen vào

các tế bào trần (protoplast).

 Tế bào trần là tế bào đã đ-ợc loại bỏ thành

tế bào bằng việc xử lý với các enzym

(xenlulaza, pectinaza) để thu đ-ợc cấu trúc tế

bào chỉ còn chất nguyên sinh và màng nguyên

sinh chất.

 Ng-ời ta th-ờng sử dụng dòng điện có hiệu

điện thế cao phát xung trong thời gian cực

ngắn (khoảng 5 - 6 / 1000 giây) để tạo ra trên

bề mặt tế bào trần tạm thời các lỗ có đ-ờng

kính khoảng 30  m, mà qua đó các ADN biến

nạp có thể thâm nhập vào tế bào.

Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng xung điện

1 Hiệu quả chuyển gen cao,

ổn định, đặc biệt đối với

các gen đơn.

Nh-ợc điểm -u điểm

1 Hệ thống tái sinh của các tế

bào trần của nhiều loài còn gặp khó khăn.

2 Cho đến nay, nhìn chung còn

ch-a đ-ợc sử dụng thông dụng Mới đ-ợc sử dụng trong các nghiên cứu tạm thời của gen.

Ph-ơng pháp biến nạp gen nhờ PEG (polyethylene glycol)

 Cũng giống nh- ph-ơng pháp chuyển gen

bằng xung điện, ph-ơng pháp chuyển gen

nhờ PEG th-ờng đ-ợc sử dụng để chuyển

gen vào các tế bào trần.

 ở nồng độ cao, PEG làm ADN cần biến

nạp không còn ở trạng thái hoà tan nữa mà

kết dính lại trên màng sinh chất Sau đó,

bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao

của Ca 2+ hoặc ở độ pH cao, ADN biến nạp

sẽ đ-ợc chuyển nạp vào trong tế bào

protoplast.

Kỹ thuật chuyển gen và ứng dụng trong chọn giống thực vật

1 Hiệu quả chuyển

1 Quá trình biến nạp khó điều khiển Số

bản copy của gen trong tế bào biến nạp

có thể lớn.

2 Tần số biến nạp thành công biến động

giữa các thí nghiệm.

3 Dễ dẫn đến hiện t-ợng dung hợp của

các tế bào trần, gây khó kh ăn cho việc phân tích biểu hiện của gen.

4 Đòi hỏi một hệ thống tái sinh tế bào

trần, vốn còn gặp khó khăn ở nhiều loài cây trồng.

Ph-ơng pháp biến nạp gen nhờ PEG (polyethylene glycol)

Ph-ơng pháp chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)

 Ph-ơng pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là ph-ơng pháp sử dụng các

thiết bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào Đến nay, các tế bào đã đ-ợc sử dụng ph-ơng pháp này để chuyển gen gồm các tế bào protoplast (Chnorf và cs., 1991), các tế bào tiền phôi của hợp tử hay hạt phấn (Neuhaus, 1987).

Kỹ thuật chuyển gen bằng vi tiêm

(microinjection)

• Vi tiêm là kỹ thuật chính xác nhằm chuyển

những phân tử lớn vào trong các ô đặc biệt

bên trong tế bào

1 Mỗi lần biến nạp chỉ đ-a đ-ợc

ADN vào một tế bào duy nhất,

do vậy đây là một ph-ơng pháp tốn nhiều thời gian và công sức.

2 Chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ

thuật viên có kỹ n ăng cao.

3 Đòi hỏi thiết bị t-ơng đối đắt

tiền.

Ph-ơng pháp chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)

Kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn

(polen tuber)

• Các ADN mục tiêu được đưa qua đường

ống phấn để vào bầu nhuỵ cái và tạo nên

sự chuyển gen ngay sau khi hạt phấn nảy mầm, ống phấn mọc qua vòi nhị để đưa

tinh tử vào thụ tinh với tế bào trứng

trong noãn

Trong một số tr-ờng hợp ng-ời ta có thể kết hợp các ph-ơng pháp với nhau Chẳng hạn trong biến nạp gen ở ngô ng-ời ta

sử dụng kết hợp ph-ơng pháp súng bắn gen để gây tổn th-ơng tế bào biến nạp tr-ớc khi chuyển nạp gen bằng

Agrobacterium .

Các đặc điểm -u việt của ph-ơng pháp biến nạp gen ở thực vật

so với các ph-ơng pháp chọn tạo giống truyền thống

- Quá trình biến nạp gen thực hiện trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc nhiều vào thời gian, không gian, mùa vụ, thời tiết, v.v

- Các gen đ-ợc chuyển có tính đặc thù cao hơn nhiều Các gen t-ơng ứng chính xác với các tính trạng mong muốn đ-ợc lựa chọn dùng cho quá trình biến nạp, loại bỏ đ-ợc các tính trạng không mong muốn.

- Quá trình chuyển một gen mong muốn vào một cá thể diễn ra nhanh hơn nhiều Chỉ cần sau một thế hệ, tính trạng mong muốn đ-ợc biểu hiện và thu nhận, trong khi các ph-ơng pháp truyền thống th-ờng cần nhiều thế hệ.

- Mức độ “linh động” của các gen đ-ợc chuyển lớn hơn nhiều Nhiều gen của loài này có thể đ-ợc chuyển vào loài khác và biểu hiện thành các tính trạng hoàn toàn mới Điều này không thể thực hiện đ-ợc khi sử dụng các ph-ơng pháp tạo giống truyền thống.

- Tăng năng suất nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất Điều này đặc biệt đúng khi các gen đ-ợc dùng cho biến nạp vào thực vật th-ờng là các gen làm tăng năng suất, giảm thời gian trồng trọt, tăng khả năng trao đổi chất, kháng các loại sâu bệnh Nhờ vậy, thời gian, công lao động, vật t- hoá chất cần cho quá trình sản xuất nông nghiệp sẽ đ-ợc giảm đi nhiều dẫn đến sự giảm chi phí sản xuất và hạn chế ô nhiễm môi tr-ờng.

Các đặc điểm -u việt của ph-ơng pháp biến nạp gen ở thực vật

so với các ph-ơng pháp chọn tạo giống truyền thống

TRAD’L PLANT BREEDING

DNA is a strand of genes, much like a strand of beads Traditional plant breeding combines many genes at once.

Desired Gene

X

Many genes are transferred

Donor Plant

Commercial Plant Variety

New Plant Variety

+

A single gene is transferred

Desired Gene

Commercial Plant Variety

Improved Commercial Plant Variety

PLANT BIOTECHNOLOGY / GENETIC ENGINEERING

Using plant biotechnology, you can add a single gene to the strand.

Desired Gene

Donor Plant

Uu thÕ cña c«ng nghÖ gen/ph-¬ng

ph¸p chän t¹o truyÒn thèng

CÁC HƯỚNG TẠO CÂY CHUYỂN

GEN

• Kháng các điều kiện bất lợi phi sinh

• Tăng thời gian bảo quản

• Tăng dinh dưỡng

• Tăng cường chất lượng

•Tăng dinh dưỡng

•Thay đổi thành phần dầu

•Tăng cường chất lượng gỗ

• Sản xuất hoạt chất sinh học

• Sản xuất nhiên liệu sinh học

CÁC ĐẶC TÍNH ĐANG ĐƯỢC NGHIÊN CỨU

Phát triển cây trồng có khả năng kháng

thuốc trừ cỏ, sâu, bệnh

Soybean with no herbicides Soybean after herbicides

Thuốc trừ cỏ được sử dụng để phòng chống cỏ dại

Cỏ dại làm giảm năng suất và

chất lượng cây trồng

Phát triển cây trồng có khả năng

Thuốc trừ cỏ: 2 nhóm

Diệt một số loài cỏ ,

Không gây hại một số cây trồng

Trifluralin: control of grass and

broadleaf weeds in cabbage

(diệt cả cỏ và cây trồng)

Glyphosate (Roundup) Glyphosate (roundup)

Tồn tại của thuốc trừ cỏ chọn lọc

Tồn lại hàng năm hoặc lâu dài  ảnh hưởng đến cây trồng sau (Thuốc trừ cỏ không chọn lọc phân giải nhanh hơn).

Chlorosis and necrosis of lower leaves

Việc sử dụng thuốc trừ cỏ dẫn đến hiện

tƣợng kháng thuốc của cỏ dại

Tác động của Glyphosate

đến cây trồng mẫn cảm và kháng thuốc

susceptible resistant

• Nâng cao hoạt tính của các enzym bị hại do thuốc trừ cỏ

• Tạo ra các enzym đột biến không bị ảnh hưởng của thuốc trừ cỏ.

• Tạo các enzym làm mất tính độc của thuốc trừ cỏ

• Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosat-Round up (Montsato)

– kìm hãm hoạt động của một enzym biến đổi sản phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng sikimic tên là enzym enol pyruvat

sikimat phosphat synthetase (EPSPS)

• Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Basta

– Ức chế enzyme tổng hợp glutamin làm tích tụ ammoniagen bar

(phosphinothricin-N-acetyltransferase )

Chiến lược nâng cao tính chống chịu thuốc trừ cỏ

Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ bromoxynil

Chuyển gen tổng hợp enzyme nitrilase (soil bacteria Klebsiella ozaenae) làm mất hoạt tính của bromoxynil