Xác định hoạt tính các enzyme amylase, protease, cellulase bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Cơ sở lý thuyết của việc xác định hoạt tính (hoạt độ tương đối) của các enzyme bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch là quan sát sự chuyển hóa cơ chất của mỗi enzyme thông qua việc nhuộm màu cơ chất hoặc việc tạo màu của sản phẩm tạo thành. Nguồn enzyme gồm enzyme nội bào thu từ mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật, enzyme ngoại bào thu từ dịch enzym được tiết ra môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Trang 1Bài 1 Xác định hoạt tính các enzyme amylase, protease, cellulase bằng phương pháp
khuếch tán đĩa thạch
Cơ sở lý thuyết của việc xác định hoạt tính (hoạt độ tương đối) của các enzyme bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch là quan sát sự chuyển hóa cơ chất của mỗi enzyme thông qua việc nhuộm màu cơ chất hoặc việc tạo màu của sản phẩm tạo thành
Nguồn enzyme gồm enzyme nội bào thu từ mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật, enzyme ngoại bào thu từ dịch enzym được tiết ra môi trường nuôi cấy vi sinh vật
1 Enzyme thử hoạt tính
- Enzyme protease thu từ dứa, đu đủ
- Enzyme amylase thu từ nước bọt, giá đỗ
- Enzyme cellulose thu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
2 Tách chiết enzyme
- Từ dứa (protease)
Bromelain là một loại protease có nhiều trong phế liệu dứa như vỏ, lõi, chồi
Phế liệu dứa -> nghiền nhỏ, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu được enzyme thô
- Từ đu đủ (protease)
Dùng loại quả đu đủ non, đu đủ già (chưa chín), dùng khăn lau sạch vỏ, lấy dao rạch những đường không quá sâu, hứng nhựa vào cốc Hòa tan nhựa tươi trong đệm phosphate 0,1M pH 7,0 Thu được dịch enzyme thô
- Từ giá đỗ (amylase)
Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm hoặc mang lá mầm ngắn của giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu được enzyme thô
- Từ nước bọt (amylase)
Lấy 1.5 ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong
10 phút, loại bỏ cặn
Lưu ý: Tất cả các thao tác ở 40C
- Từ dịch nuôi cấy vi khuẩn (cellulose)
Lấy 1.5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút, loại bỏ cặn
Trang 23 Môi trường thử hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
- Amylase
50 – 100 µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar và 1
% tinh bột (cơ chất) trong đệm phosphate 0,1M, pH 7.
Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, trong 4h
Thuốc nhuộm là lugol (hòa 2g KI trong 5ml nước cất cho tan hết, sau đó cho thêm 1g I2 vào, sau đó cho nước cất đến đủ 300ml, lắc đều)
- Protease
50 – 100 µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar và
0,1% gelatin (cơ chất) trong đệm phosphate 0,1M, pH 7.
Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, trong 4h
Nhuộm bởi amido đen 10B 0,1% trong dung dịch methanol, axit acetic, nước cất theo tỷ
lệ 3: 1: 6 trong 1 giờ Tẩy bằng dung dịch pha amino đen
- Cellulase
50 – 100 µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar và
1% CMC (Carboxymethyl cellulose) trong đệm phosphate 0,1M, pH 7.
Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, trong 4h
Thuốc nhuộm là lugol
Nếu dịch chiết có hoạt tính amylase, protease, cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh giếng thạch chứa dịch enzyme Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu nâu tím Vùng protein chưa bị phân giải có màu xanh Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu nâu tím
Hoạt độ tương đối của enzyme được xác định qua hệ số phân giải: D – d (mm) Trong đó: D là đường kính vòng phân giải (mm), d là đường kính lỗ thạch (mm)
Trang 3Bài 2 Xác định hoạt độ amylase Xây dựng đồ thị chuẩn Maltose
1 Cơ sở lý thuyết
Enzyme amylase thủy phân tinh bột (amylose, amylopectin), glycogen bằng cách thủy phân liên kết α 1,4 glycosid Sản phẩm sau phản ứng có thể là hỗn hợp của các đường triomaltose, maltose, glucose và các dextrin (tùy thuộc vào nguồn cơ chất)
Sơ đồ phản ứng xúc tác được viết tóm tắt dưới dạng
3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS hoặc DNSA) có màu vàng, khi phản ứng với các đường khử, DNS sẽ bị khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic acid (màu nâu đỏ) có khả năng hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 540 nm
Lượng 3-amino-5-nitrosalicylic được tạo thành phụ thuộc vào hàm lượng đường khử có trong dung dịch Dựa vào mối tương quan này người ta xác định được hoạt độ của enzyme amylase
2 Yêu cầu:
• Sinh viên giải thích được nguyên lý của phương pháp định hoạt độ amylase thông qua việc định lượng đường khử
• Biết cách xây dựng đồ thị chuẩn maltose
• Biết cách xác định hoạt độ amylase dựa vào đồ thị chuẩn
3 Vật liệu
• Dung dịch enzyme amylase (nước bọt, giá đỗ)
• Maltose
• Các dung dịch đệm
4 Chuẩn bị
a Dung dịch tinh bột hòa tan: 1% trong đệm PBS 0.05M pH 6,5 (hoặc đệm acetate)
Cách chuẩn bị:
Cân 0,5 g tinh bột hòa tan cho vào cốc thủy tinh 50 ml đệm PBS 0.05M pH 6,5
Trang 4Hồ hóa bằng lò vi sóng, để nguội, dẫn nước cất lại đến 50 ml Bảo quản ở 40C
b Dung dịch maltose chuẩn 10mM
Cân 36 mg maltose, hòa tan trong 10 ml nước cất
c Thuốc thử DNSA (Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution, 1%)
Hòa tan hỗn hợp gồm có: 1g dinitrosalicylic acid, 200 mg phenol tinh thể, 50mg sodium sulphite , 6 g Potassium sodium tartrate (Rochelle salt), 1 g NaOH trong 100 ml nước
d Mẫu phân tích:
Enzyme amylase từ nước bọt: Lấy 2 ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4ºC, loại bỏ cặn
Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm hoặc mang lá mầm ngắn của giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu được enzyme thô
5 Lập đường chuẩn
Lắc đều các ống nghiệm, đặt vào bể 1000C trong 10 phút, làm nguội đến to phòng
Nồng độ Maltose trong các ống nghiệm
(mM)
Đo quang phổ ở bước sóng 540 nm, cuvette 2 ml, đường kính cuvette 1 cm (Lưu ý có thể phải pha loãng) Mẫu đối chứng tương tự chỉ thay dung dịch maltose chuẩn bằng nước cất Giá trị OD540 của các mẫu được tính bằng OD540 mẫu – OD540 đối chứng Xây dựng đường chuẩn dựa trên 5 điểm thu được, trong đó trục tung là giá trị OD540, trục hoành là hàm lượng maltose (mM)
6 Xác định hoạt độ
Cho vào ống nghiệm
• Đệm PBS 0,1 M pH 6,5 0,48 ml
Ủ ở 370C trong 10 phút (nếu thay đổi thời gian ủ thì cần ghi lại phản ứng đến tính toán sau này)
• Bổ sung thuốc thử 1,0 ml
Trộn đều, đặt trong bể nước sôi 10 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng
Trộn đều đo quang phổ như trên
Mẫu đối chứng tương tự nhưng dung dịch enzyme đã bị làm bất hoạt bằng nhiệt độ cao (95oC trong 30 phút)
Trang 5Giá trị OD540 của các mẫu được tính bằng OD540 mẫu – OD540 đối chứng
7 Cách tính hoạt độ
7.1 Định nghĩa hoạt độ enzyme amylase theo đơn vị quốc tế (IU)
1 Unit (1U) là hoạt độ enzyme (không phải là lượng enzyme) có thể tạo ra 1 mg glucose/ maltose trong 1 phút dưới các điều kiện tối ưu
1Unit (1U) là hoạt độ enzyme (không phải là lượng enzyme) có thể tạo ra 1 μM glucose/ maltose trong 1 phút dưới các điều kiện tối ưu
Starch (polysaccharide) −−−> Oligosaccharides −−−> (mono/disaccharides)Glucose + Maltose [Blue with iodine] [Red with iodine] [Yellow with iodine]
7.2 Cách tính
Tính toán lượng đường khử được tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose đã làm ở bước trên
Tính toán lượng đường khử được tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose đã làm ở bước trên
Hoạt độ thể tích (Unit/ ml mẫu) = (µmol maltose x 50)/10
Hoạt độ riêng (Unit/ mg protein) = Hoạt độ thể tích/ hàm lượng protein
Giải thích: Lượng Maltose (µmol) tương ứng với số Unit Tuy nhiên, thể tích enzyme lấy cho phản ứng
là 0,02 ml do đó phải nhân với 50 Thời gian phản ứng enzyme là 10 phút do đó phải chia cho 10