Kỹ thuật phân tử PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (tiếng Anh: Polymerase Chain Reaction, viết tắt: PCR), cũng có sách gọi là phản ứng khuếch đại gen. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men.

KỸ THUẬT PCR

Khó có thể diễn tả hết ý nghĩa và vai trò của

kỹ thuật PCR trong lĩnh vực công nghệ sinh học ngày nay

học ngày nay Đ Đây là một phương pháp dễ ây là một phương pháp dễ dàng và nhanh chóng để có thể tách dòng và nhân lên một số lượng vô hạn mọi đoạn tr

nhân lên một số lượng vô hạn mọi đoạn trìình nh

tự ADN Sự phát minh của kỹ thuật này xứng

đáng được coi là một “bước ngoặt” hay “một

kỹ thuật mang tính cách mạng”

kỹ thuật mang tính cách mạng” thúc đẩy sự thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh học hiện đại.

J Watson

Khái niệm

•• Kỹ Kỹ thuật thuật PCR PCR là là một một ph phư ương ơng pháp pháp cho cho phép phép nhân nhân nhanh

nhanh in in vitro vitro số số llư ượng ợng lớn lớn một một đoạn đoạn AND AND

•• Ph Phư ương ơng pháp pháp này này có có độ độ nhạy nhạy rất rất cao cao và và ngày ngày nay nay đã đã trở trở thành

thành một một công công cụ cụ nghiên nghiên cứu cứu đầu đầu tay tay trong trong phần phần lớn lớn các các phòng

phòng thí thí nghiệm nghiệm có có liên liên quan quan đến đến gen gen và và ADN ADN thuộc thuộc các các lĩnh

lĩnh vực vực khoa khoa học học sinh sinh học, học, nông nông nghiệp, nghiệp, môi môi tr trư ường, ờng, yy

tế,

tế, dược dược phẩm, phẩm, pháp pháp y y… …

Sự tái bản DNA trong cơ thể sống

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

•• Kỹ Kỹ thuật thuật PCR PCR dựa dựa trên trên sự sự xúc xúc tác tác của của enzym enzym AND

AND polymeraza polymeraza để để nhân nhân bản bản một một đoạn đoạn ADN ADN nhờ

nhờ hai hai đoạn đoạn mồi mồi oligonucleotít oligonucleotít (primer) (primer) ttư ương ơng

Các yêu cầu cần thiết cho PCR

•• 22 mmồiồi tổngtổng hợphợp oligonucleotideoligonucleotide ((mỗimỗi

mồi

mồi cócó khoảngkhoảng 2020 5050 nucleotide)

(đầu

(đầu33'' ––OHOH tựtự do)do)

•• ADNADN khukhuônôn

•• DNA polymerase chịu nhiệt

•• DNA polymerase chịu nhiệt

(Ta

(Taqqpolymerase)polymerase)

•• 44 loạiloại nucleotidenucleotide dNTP'sdNTP's:: A,A, T,T, G,G, CC

•• Mg++,Mg++, dungdung dịchdịch đệm,đệm, pH,pH, etcetc

− u điểm nổi bật của kỹ thuật PCR

Có Có thể thể sử sử dụng dụng trực trực tiếp tiếp ADN ADN vừa vừa chiết chiết xuất,

xuất, không không cần cần tinh tinh chế chế

xuất,

xuất, không không cần cần tinh tinh chế chế

Chuỗi Chuỗi ADN ADN làm làm khuôn khuôn không không cần cần tách tách chiết,

chiết, và và tính tính đặc đặc hiệu hiệu của của ph phả ả nn ứng ứng do do các

các oligo oligo nucleotid nucleotid làm làm mồi mồi quyết quyết định định

Phương pháp tính nhiệt độ gắn mồi Tm

Tm của primer: của primer:

• Chiều dài của primer

Cặp mồi để nhân gen chống bệnh đạo ôn (nằm trên NST 12) ở lúa

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả PCR

• ADN khuụn (ADN template)

Lượng ADN khuụn: 20ng

Lượng ADN khuụn: 20ng 100ng Rất cần trỏnh lẫn 100ng Rất cần trỏnh lẫn tạp

ADN khuụn phải cú độ nguyờn vẹn cao

đầu 3' của mạch khuụn 5' 3' Mồi ngược (antisense 3' Mồi ngược (antisense primer) bắt cặp gắn ở đầu 3' của mạch khuụn 3'

primer) bắt cặp gắn ở đầu 3' của mạch khuụn 3' 5'.5'.Trỏnh cú sự bổ sung giữa cỏc mồi

• Thời gian gắn mồi

Dao động: 30

Dao động: 30 60 giây60 giây

Thời gian dài: gây sai lệch phản ứng,

Thời gian dài: gây sai lệch phản ứng,⇒⇒ suy giảm hoạt động enzyme Taq

[NTP] thường dùng 200µµM

Nồng độ cao sẽ liên kết với Mg++

Nồng độ cao sẽ liên kết với Mg++ ==>==> ảnh hưởng xấu ảnh hưởng xấu tới phản ứng

Sau 35 chu kỳ dNTP bị suy giảm

Môi trường axit làm dNTP biến đổi thành dNDP hoặc dNMP

Thể tích PCR: 25µµl cần 1 l cần 1 2 đơn vị enzyme2 đơn vị enzyme

Nồng độ enzyme nhiều hay ít đều ảnh hưởng đến chất lượng PCR

• Nồng độ mồi: Nồng độ mồi: khoảng 100 khoảng 100 500nM 500nM

Thấp:

Thấp: Không đủ cho phản ứng Không đủ cho phản ứng ==> ==> không có không có

băng hoặc băng mờ nhạt

Cao:

Cao: ức chế phản ứng, gây sai lệch phản ứng ức chế phản ứng, gây sai lệch phản ứng.

0,2 0,2 µ µ µM M M primers primers

0,2 0,2 µ0,2 µ0,2 µ µM µµM M M primersM M primersprimersprimers0,2

0,2 µ µ µM M M primers primers 0,6 µ0,6 0,6 µ 0,6 µµM µ µM M M primersM M primersprimersprimers 1 1 µ1 1 µµµM µ µM M M primersM M primersprimersprimers

A8 B8 C8 D8

T-Các ứng dụng chủ yếu của PCR

Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn

ADN riêng biệt

Chuẩn đoán nhanh, nhạy tất cả các bệnh di truyền và nhiễm trùng (ung thư, virus, vi khuẩn, nấm )

Xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hỡnh sự

từ những dấu vết rất nhỏ: giọt máu, nước d9i, sợ tóc

Xỏc định giới tinh sớm ngay ở giai đoạn phoi thai

Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục triệu năm

Là phương pháp nền của công nghệ ADN

Một số phương pháp PCR cải tiến

•• Reverse Reverse transcriptase transcriptase PCR PCR

Một số nhược điểm của

•• Thiếu chức n Thiếu chức năăng sửa ch ng sửa chữữa lỗi trong quá tr a lỗi trong quá trìình tổng hợp nh tổng hợp phân tử ADN mới

•• Có thể lắp ghép nhầm dNTP vào sợi khuôn không

theo nguyên tắc bổ trợ (xác suất thấp), dẫn đến có lỗi

về tr

về trìình tự trong một số trường hợp nh tự trong một số trường hợp.

•• Một số enzym mới được phát triển gần đây, như Một số enzym mới được phát triển gần đây, như Tli

Tli ((Thermococcus litoralis )và và Pfu Pfu polymeraza

((Pyrococcus furiosus)) , có độ chính xác cao hơn nhưng , có độ chính xác cao hơn nhưng tốc độ tổng hợp ADN và hiệu suất phản ứng PCR

không cao bằng

không cao bằng Taq Taq polymeraza polymeraza.

Long PCR

• Có thể sử dụng kỹ thuật PCR để tách trực tiếp gen từ genom.

• Hạn chế của kỹ thuật PCR:

–– Các điều kiện tiêu chuẩn của PCR chỉ phù cho việc Các điều kiện tiêu chuẩn của PCR chỉ phù cho việc

–– Các điều kiện tiêu chuẩn của PCR chỉ phù cho việc Các điều kiện tiêu chuẩn của PCR chỉ phù cho việc

nhân bản các sản phẩm ngắn Tối đa là 5Kb và

• Cần Cần phải phải có có những những cải cải tiến tiến để để có có thể thể nhân nhân bản bản đoạn

đoạn dài dài hơn hơn::

Real-time PCR

Giới thiệu phương pháp PCR

PCR được Kary mullis phát minh vào1984 Ông

được nhận giải thưởng Nobel hóa học năm 1993

Phương pháp này đã mở ra một cuộc cách mạng về

các phương pháp nghiên cứu sinh học , đặc biệt

trong lĩnh vực sinh học phân tử và trở nên phần

không thể tách rời và không thể thay thế trong các

nghiên cứu ở mức phân tử

nghiên cứu ở mức phân tử

Trong tất cả các phương pháp PCR nói chung, đều

có 3 bước cơ bản

Gây biến tính nhiệt :

Trong bước này DNAs được biến tính hoàn toàn

bởi nhiệt độ cao khoảng 94˚c & tạo ra 2 sợi đơn

( trong một số trường hợp có thể nhờ helicase )

Gắn mồi:

Trong bước này các mồi được gắn vào các sợi đơn

Trong bước này các mồi được gắn vào các sợi đơn

DNA nhờ các vùng bổ sung

Kéo dài hay polyme hóa:

Được thực hiện nhờ enzym polymerase chịu nhiệt

Taq polymerase chiết tách từ Thermus aquaticus

Lịch sử phát triển kỹ thuật Real

time PCR

1 Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P S., and Griffith, R 1992

Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences Biotechnology 10:413–417.

2 Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R 1993 Kinetic

PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions

Biotechnology 11:1026–1030.

Higuchi et al 1,2 Đi tiên phong trong phân tích động học PCR –

phát hiện ngay sản phẩm PCR khi nó vừa được tạo ra Dựa vào tính chất của ethidium bromide – hầu như chỉ phát quang khi chui vào sợi đôi của phân tử DNA Ở trạng thái tự do ethidium bromide phát

quang rất yếu Tín hiệu phát quang được kích hoạt khi chiếu tia UV

và thu nhận nhờ phần mềm máy tính nhờ CCD camera ngay tại thời điểm sản phẩm tạo ra = Real-time PCR.

- 1960 nghiên cứu về các tác nhân đan xen trong ADN (DNA intercalating agents) nhằm tìn hiểu khả năng ứng dụng

trong hóa điều trị

- 1965, Waring lần đầu tiên đã sử dụng thiết bị quang phổ khả kiến tử ngoại (UV-visible spectroscopy) để phân tích sự

Lịch sử phát triển kỹ thuật Real

time PCR

khả kiến tử ngoại (UV-visible spectroscopy) để phân tích sự tương tác giữa DNA và EtBr.

- 1967, LePecq and Paoletti phát hiện phức hợp DNA/EtBr

có cường độ huỳnh quang cao hơn 21 lần so với EtBr đơn

độc trong dung dịch

- Từ đó dẫn đến việc sử dụng EtBr như một thuốc nhuộm

AND trên gel agarose khi điện di và dẫn đến những ứng

dụng trong real time PCR

2

Double-Stranded DNA Binding Dyes

các phân tử nhỏ gắn vào chuỗi xoắn kép AND được chia thành 2

nhóm:

intercalators (chất đan xen) và minor groove binders (chất gắn

vào rãnh thứ cấp) Higuchi et al đã sử dụng chất đan xen ethidium

bromide trong phản ứng real-time PCR

có 2 tiêu chuẩn cần thiết cho một chất màu được gắn vào AND

trong phản ứng real time PCR:

Lịch sử phát triển kỹ thuật Real

time PCR

trong phản ứng real time PCR:

1 Tăng cường huỳnh quang khi được gắn vào chuỗi xoắn kép

2 Không ảnh hưởng kìm hãm ảnh hưởng phản ứng PCR

PE Biosystems đã phát triển các điều kiện cho phép sử dụng chất

nhuộm màu SYBR Green I trong kỹ thuật real time PCR Chất này

làm tăng cường độ phát quang hơn hẳn EtBr ethidium bromide

Cơ chế tương tác với AND của SYBR Green I còn chưa rõ (đan xen

hay gắn vào rãnh)

1 Nielsen, P.E 1991 “Sequence-selective DNA recognition by

synthetic ligands,” Bioconjugate Chemistry 2:1–12.

2 PE Biosystems Molecular Probes

2

Fluorogenic Probes

Kỹ thuật Real-time PCR đã được cải tiến khi sử dụng phương pháp phát hiện sản phẩm PCR dựa trên mẫu dò (probe-based), phương pháp

phát hiện cũ dựa trên sự phát huỳnh quang của các chất gắn

(intercalator-based) cho phép phát hiện sản phẩm PCR tổng số (cả sản phẩm đặc hiệu lẫn không đặc hiệu - specific and nonspecific products) trong khi phương pháp mới dựa vào phản ứng 5' nuclease assay cho

Lịch sử phát triển kỹ thuật Real

time PCR

trong khi phương pháp mới dựa vào phản ứng 5' nuclease assay cho phép chỉ phát hiện sản phẩm đặc hiệu được nhân bản (only specific

amplification products).

- Holland, P M., Abramson, R D., Watson, R., and Gelfand, D H 1991

đã sử dụng hoạt tính 5' to 3' exonuclease của Thermus aquaticus DNA polymerase để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu

Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88:7276–7280 (a probe labeled with 32P on its 5' end and blocked at its 3' end,

measured cleavage of the probe by using thin layer chromatography

to separate cleavage fragments from intact probe)

2

Fluorogenic Probes

Mẫu dò là một oligonucleotide được gắn với cả 2 chất màu có khả năng phát huỳnh quang reporter fluorescent dye và quencher dye (phát huỳnh quang) Khi mẫu dò trạng thái nguyên thể, khoảng cách giữa reporter fluorescent dye và quencher dye rất gần và phản ứng phát huỳnh quang bị ức chế do cơ chế Förster resonance energy

Lịch sử phát triển kỹ thuật Real

quenched

probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid

hybridization PCR Methods and Applications 4:357–362

PCR phases in linear view

PCR phases

◦ Nếu hiệu quả 100%– Sự nhân đôi sản phẩm đặc hiệu và chính xác

Things which are needed for PCR(1)

Template DNA that is going to be amplified.this

DNA must be pure & all other contaminations like

RNAs must be removed by RNase

Primers (forward & reverse )which are attached to

their complementary sequence in 3´ of each strand

Taq or any other polymerase which must have

Sự xâm nhiễm như lẫn tạp RNAs phải được loại

trừ nhờ RNase

Taq or any other polymerase which must have

activity in high temprature

dNTPs which are the main substances in DNA

composition

Buffer which makes a perfect condition to process

Cations that are essential for polymerase activity

Ưu điểm& Nhược điểm

The Basic of Real time PCR

Baseline – Pha baseline gồm toàn bộ sự nhân bản ở dưới mức phát hiện sản phẩm nhờ

công cụ real time i.

Threshold – Nơi threshold và đường nhân bản được gọi là CT Có theer đặt bằng tay hoặc tự

∆∆∆∆ Rn Số chu kỳ nhân tạo nên đường nhân bản so với giá trị CT

REAL TIME PCR & IT’S FUNCTIONS IN DIAGNOSIS

Sử dụng phương trình PCR

Xn = sản phẩm PCR sau n chu kỳ

Sự khác biệt 0.1 hệ số hiệu quả tạo ra sự sai khác 5 lần về tỷ lệ

sản phẩm PCR cuối cùng sau 30 chu kỳ.

Instruments, Accessories and Software

1 ) Light Cycler® Relative Quantification Software

The first commercially available software was the Light

Cycler® Relative Quantification Software (2001)

2 ) REST

In 2002, the relative expression software tool (REST )

was established as a new tool

3 ) Q-Gene

Recently a second software tool, Q-Gene, was

Recently a second software tool, Q-Gene, was

developed, which is able to perform a statistical test of

the real-time data.Q-Gene manages and expedites the

planning, performance and evaluation of quantitative

real-time PCR experiments

4 ) qBASE

QBASE is an Excel®-based tool for the management

and automatic analysis of real-time quantitative PCR

data

REAL TIME PCR & IT’S FUNCTIONS IN DIAGNOSIS

5 ) SoFAR

The algorithms implemented in SoFAR (distributed

by Metralabs) allow fully automatic analysis of

real-time PCR data obtained with a Roch LightCycler®

(Roche Diagnostics) instrument The software yields

results with considerably increased precision and

accuracy of real-time quantification

6 ) DART-PCR

more…

6 ) DART-PCR

DART-PCR (Data Analysis for Real-Time PCR)

provides a simple means of analyzing real-time PCR

data from raw fluorescence data.This allows an

automatic calculation of amplification kinetics, as

well as performing the subsequent calculations for

the relative quantification and calculation of assay

variability

REAL TIME PCR & IT’S FUNCTIONS IN DIAGNOSIS

Real time PCR so sánh với các kỹ thuật khác

Thời gian thu được kết quả ngắn

Phát hiện được sản phẩm phản ứng sau mỗi chu kỳ PCR thông qua sự phát

Real time PCR là phương pháp chính xác nhất trong sự phát hiện:

- Số băng copy của mỗi gen;

- Mức độ biểu hiện gen;

- Hiệu quả của các loại thuốc;

-Mức nhiễm virus;

- Các nhân tố gây bệnh khác nhau;

( CMV, streptococcus, mycobacterium,HIV & …

)

- Sự Metyl hóa AND;

- Các kiểu đột biến khác nhau;

- Hiệu ứng thải loại của của cây ghép cơ quan …

Có 3 phương pháp chính để phát hiện phản ứng

Real Time PCR thống qua sử dụng huỳnh

quang nh ư là một tín hiệu báo cáo:

1 Thủy phân mẫu dò

(TaqMan, Beacons, Scorpions)

Sự phát hiện trong phản ứng Real time

* DNA binding dye

* Binds to minor groove (dsDNA)

* Emits light when bound

More double stranded DNA =

more binding = more

fluorescence

SY BR Green chỉ phát huỳnh quang khi gắn vào chuỗi kép DNA (dsDNA)

fluorescence

* Forensically, can be used to

calculate how much DNA was

present before reaction

* Unspecific

* Dissociation curve

Ưu điểm: Tương đối rẻ, không đòi hỏi

thiết kế mẫu dò;

Nhược điểm: không đặc hiệu, không

phát hiện được đồng thời nhiều bệnh

1 )) 2)

1) Biến tính và lai mẫu dò;

2) Kéo dài mồi và chuỗi

thay thế mẫu dò 3) Phân giải mẫu dò và

Sự phát huỳnh quang từ reporter

dye tỷ lệ thuận trực tiếp với số

bản sao được nhân bản

REAL TIME PCR & IT’S FUNCTIONS IN DIAGNOSIS

Molecular Beacons

MIDLAND is licensed by The Public Health Research Institute

of New York, Inc to manufacture and sell Molecular Beacon

Probes These probes, first described by Dr Fred Russell

Kramer and his colleagues, make possible the in situ visual

detection of target DNA, and they also enable real-time PCR

quantitation Use of different fluorophores coupled with careful

design of the probes permits distinguishing between sequences

differing by as little as one base.

Sự truyền và phát tín hiệu huỳnh quang của tế bào PtK2 đưa vào với ß-1

andrenergic mRNA MB trong vòng 18 phút (cách quãng 3 phút)