NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía

NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN tử xác ĐỊNH PHYTOPLASMA gây BỆNH TRÊN cây mía

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

*****************************

NGÔ GIA BÔN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XÁC ðỊNH PHYTOPLASMA GÂY BỆNH TRÊN CÂY MÍA

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học

TS Trịnh Xuân Hoạt

Hà Nội - 2014

LỜI CAM ðOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi với sự giúp đỡ tận tình của TS Trịnh Xuân Hoạt, Phĩ Viện trưởng Viện bảo vệ thực vật cùng tồn thể các anh /chị trong Nhĩm nghiên cứu bệnh cây - Bộ mơn Chẩn đốn, Giám định dịch hại và Thiên địch Các kết quả và số liệu nêu trong luận văn là hồn

tồn trung thực

Tác giả luận văn

Ngơ Gia Bơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành ựến các thầy cô trong Ban đào tạo sau đại học-Viện KHNN Việt Nam ựã tạo ựiều kiện thuận lợi ựể tôi hoàn thành học tập chương trình cao học cũng như hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành ựối với sự quan tâm của thầy giáo hướng dẫn, sự giúp ựỡ nhiệt tình và ựộng viên của lãnh ựạo Viện Bảo vệ thực vật, lãnh ựạo và cán bộ Bộ Môn Chẩn ựoán giám ựịnh dịch hại và thiên ựịch Viện Bảo vệ thực vật

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia ựình và bạn bè ựã tạo ựiều kiện thuận lợi, giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2014

Tác giả luận văn

Ngô Gia Bôn

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ….ii

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ðẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

1.1 Cơ sở khoa học của ñề tài 4

1.2 Tình hình sản xuất mía trên thế giới và Việt Nam 5

1.2.1 Tình hình sản xuất mía ñường trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình sản xuất mía tại Việt Nam 5

1.2.3 Nguồn gốc và lịch sử phát triển của cây mía 6

1.2.4 Vị trí phân loại 6

1.2.5 ðặc ñiểm sinh trưởng 6

1.2.6 Giá trị kinh tế 8

1.3 Tổng quan nghiên cứu về bệnh hại thực vật do phytoplasma 9

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu phytoplasma 9

1.3.2 Hình thái phytoplasma 9

1.3.3 Tầm quan trọng của bệnh do phytoplasma trên thực vật 10

1.3.4 Vị trí phân loại phytoplasma 10

1.3.5 Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra 16

1.3.7 Phát hiện và ñịnh loại phytoplasma gây bệnh thực vật 17

1.3.8 Những nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại mía 20

1.3.9 Biện pháp quản lý bệnh thực vật do phytoplasma gây ra 22

1.4 Các nghiên cứu về Phytoplasma hại cây trồng ở Việt Nam 24

CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 25

2.1.1 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu 25

2.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xác ñịnh bệnh phytoplasma hại trên mía 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả ñiều tra sự phân bố và gây hại của nhóm bệnh do phytoplasma gây hại trên cây mía 35

3.1.1 Kết quả ñiều tra thu thập mẫu bệnh tại Nghệ An 35

3.1.2 Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây hại trên mía 39

3.2 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh bệnh do phytoplasma gây hại trên mía 42

3.2.1 Kết quả xác ñịnh phytoplasma trong mô mía bằng kính hiển vi ñiện tử 42

3.2.2 Xác ñịnh phytoplasma trong mô cây mía biểu hiện triệu chứng bệnh chồi cỏ bằng phương pháp PCR 44

3.2.3 Phân tích trình tự gen secA 70

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 84

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3.4 Mức sai khác trình tự nucleotide của SCGSNA so với các

ñại diện của các nhóm Phytoplasma khác nhau………

58

3.5 Phytoplasma sử dụng trong phân tích phả hệ……… 61 3.6 Phytoplasma sử dụng trong phân tích phả hệ……… 67

Dương ………

42

3.6 Hình ảnh hiển vi ñiện tử chụp mô cây mía biểu hiện và

không biểu hiện triệu chứng chồi cỏ mía thu tại Nghệ An …

ñể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mía ………

48

3.17 Nested PCR sử dụng cặp mồi P1/P7-R16(I)F2/R16(I)R1 ñể

phát hiện Phytopalsma trong mô cây mía ………

51

3.18 Nested PCR sử dụng cặp mồi P1/P7-R16(III)F2/R16(III)R1

ñể phát hiện Phytoplasma trong mô cây mía ………

3.21 Sản phẩm PCR ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm của ðại

học Tottingham, Vương quốc Anh ………

3.24 So sánh mức ñộ tương ñồng giữa trình tự gen 16SrRNA của

Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mía tại Nghệ An-Việt Nam với Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mía tại Ấn ðộ bằng phần mềm so sánh trình tự ClustalW2 ………

60

3.25 Cây phả hệ ñược xây dựng theo phương pháp

Neighbor-joining ………

63

3.26 Sản phẩm nested-PCR với cặp primer P1/P7-R16F2n/R16R2

khuếch ñại từ mẫu mía biểu hiện triệu chứng trắng lá ………

3.30 Cây phả hệ thể hiện mối tương quan giữa các Phytoplasma

gây bệnh trên mía và cỏ dựa trên trình tự gen SecA ………

71

3.31 Cây phả hệ thể hiện mối tương quan giữa các Phytoplasma

gây bệnh trên mía và cỏ dựa trên trình tự gen 16SrRNA ……

72

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Mía (Saccharum officinarum L.) là cây cơng nghiệp quan trọng nhất cho

ngành sản xuất mía đường tại Việt Nam Tuy nhiên những năm gần đây xuất hiện một số loại bệnh nguy hiểm do Phytoplasma gây ra Phytoplasma thuộc họ

Acholeplasmataceae, lồi Candidatus Phytoplasma (Ca Phytoplasma) đã trở

thành một trong những đối tượng gây hại nghiêm trọng nhất đối với cây trồng nơng nghiệp trên thế giới và Việt Nam trong những năm gần đây

Trên cây mía cĩ hai bệnh nguy hiểm do Phytoplasma gây ra đĩ là bệnh chồi cỏ mía và bệnh trắng lá mía (Sdoodee et al., 1999) Năm 2009 bệnh chồi cỏ mía đã phát triển thành dịch tại Nghệ An, trên 6000 hecta mía bị nhiễm bệnh chồi cỏ, gây thiệt hại lớn cho người sản xuất và cho ngành cơng nghiệp chế biến Bệnh chồi cỏ mía là một trong những bệnh gây thiệt hại lớn nhất cho ngành cơng nghiệp mía đường trên thế giới do bệnh lan truyền rất nhanh Bệnh chồi cỏ đã xuất hiện gây hại từ lâu ở các nước Ấn ðộ, Australia, Bangladesh, Malaysia, Nepal, Sri Lanka và Pakistan Phytoplasma là một nhĩm tác nhân gây bệnh đặc biệt nguy hiểm khơng chỉ đối với cây mía mà cịn trên nhiều loại cây trồng khác thuộc họ hịa thảo Bên cạnh bệnh chồi cỏ mía gây hại ở Nghệ An, bệnh trắng lá mía cũng xuất hiện và gây hại tại Bình Dương và các tỉnh phía Nam Cây mía bị nhiễm bệnh chồi cỏ sẽ mọc nhiều chồi bên từ gốc và từ các đốt thân Các chồi bên này khơng thể phát triển thành cây mía bình thường được, từ một khĩm mía

cĩ thể mọc hàng chục đến trăm chồi bên Phiến lá mềm, hẹp cĩ màu xanh, hoặc xanh nhạt

ðể xây dựng phương pháp chẩn đốn giám định Phytoplasma hại cây trồng nĩi chung và Phytoplasma hại mía nĩi riêng, chúng tơi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử xác định Phytoplasma gây bệnh trên cây mía” Kết quả sẽ gĩp phần chẩn đốn nhanh, chính xác nguyên

nhân gây bệnh trên mía, cũng như gĩp phần xây dựng thành cơng các giải pháp phịng trừ bệnh hại mía, phát triển bền vững ngành sản xuất mía đường

2 Mục đích yêu cầu của đề tài

2.1 Mục đích của đề tài

- Nghiên cứu thành cơng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đốn, xác định bệnh

do Phytoplasma gây hại trên cây mía nĩi riêng và ứng dụng trong chẩn đốn bệnh do Phytoplasma gây hại trên cây trồng nĩi chung

2.2 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được tên, sự phân bố, gây hại của các Phytoplasma gây bệnh trên cây

mía, mơ tả được triệu chứng bệnh do các Phytoplasma gây ra trên mía

- Phát hiện và chụp được ảnh hình thái của Phytoplasma gây hại trên mía bằng kính hiển vi điện tử

- Xây dựng được kỹ thuật sinh học phân tử cĩ hiệu quả nhất trong chẩn đốn, xác định Phytoplasma gây hại trên cây mía

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Cung cấp dẫn liệu khoa học về bệnh Phytoplasma gây hại trên cây mía

- Xác định được phương pháp chẩn đốn nhanh và chính xác Phytoplasma gây hại trên cây mía cũng như xác định được sự đa dạng di truyền của các Phytoplasma gây bệnh trên mía

4 ðối tượng, phạm vi và địa điểm nghiên cứu

- ðối tượng nghiên cứu: Phytoplasma gây bệnh trên mía Một số giống mía trồng trong sản xuất

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu và phát triển kỹ thuật phân tử chẩn đốn, giám định Phytoplasma gây ra trên mía ở Nghệ An, Bình Dương

- ðịa điểm nghiên cứu: Viện Bảo vệ thực vật, tỉnh Nghệ An và tỉnh Bình Dương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

Phytoplasma là tác nhân gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma khá phức tạp và gặp nhiều khĩ khăn so với các bệnh trên cây trồng do các lồi vi sinh vật khác gây ra, bởi vì một lồi Phytoplasma cĩ thể gây bệnh trên nhiều loại cây và tùy thuộc vào từng lồi ký chủ, điều kiện mơi trường khác nhau mà triệu chứng bệnh thể hiện khác nhau Trước đây ở Việt Nam, việc chẩn đốn giám định bệnh do Phytoplasma gây ra chủ yếu dựa vào hình ảnh kính hiển vi điện tử (TEM), nhưng biện pháp này chỉ phát hiện cĩ hay khơng Phytoplasma trong mơ cây bị bệnh mà khơng giám định, phân loại và định danh được tác nhân gây bệnh

Năm 2005, trên cây mía tại Nghệ An xuất hiện triệu chứng mới cĩ thể là

do Phytoplasma gây ra Qua quan sát triệu chứng cĩ thể đây là bệnh chồi cỏ mía (Sugarcane grassy shoot) do Phytoplasma gây ra vì giống với các mơ tả về bệnh chồi cỏ mía đã từng gây hại trên mía tại Ấn ðộ, Sri-Lanka…ðể chẩn đốn giám định chính xác nguyên nhân gây bệnh, kỹ thuật phân tử là phương pháp cĩ độ chính xác cao nhất đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới Tuy nhiên ở Việt Nam, việc vận dụng kỹ thuật phân tử trong chẩn đốn giám định Phytoplasma chưa bao giờ được vận dụng và cịn quá mới mẻ Do đĩ, đề tài này xây dựng nhằm nghiên cứu và xác lập các điều kiện tối ưu, xây dựng quy trình ứng dụng

kỹ thuật phân tử trong chẩn đốn giám định Phytoplasma gây bệnh trên mía và làm cơ sở để nghiên cứu các bệnh Phytoplasma trên các loại cây trồng khác ở Việt Nam

1.2 Tình hình sản xuất mía trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất mía ñường trên thế giới

Ngành sản xuất mía ñường trên thế giới ñã phát triển mạnh từ thế kỷ thứ

16 Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (FAO, 2012), hiện nay hàng năm toàn thế giới sản xuất ñược khoảng 1.832.541 ngàn tấn mía Sản lượng mía toàn thế giới năm 2012 gấp 4,09 lần sản lượng năm 1961 (Bảng 1.1) Trong ñó tăng nhiều nhất là vùng Nam Mỹ, tiếp ñến là Châu Á, trong khi ñó sản lượng mía ở Châu Âu năm 2012 lại có xu hướng giảm xuống so với năm 1961

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất mía trên thế giới

(ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng mía (tấn)

Nguồn: Tổ chức Nông Lương Liên hợp quốc (FAO, 2012)

1.2.2 Tình hình sản xuất mía tại Việt Nam

Trong giai ñoạn từ 2008-2012, do giá ñường- giá mía khá cao, các công ty mía ñường và người trồng mía có lãi nên diện tích ñã ñược mở rộng và ổn ñịnh, việc ñầu tư thâm canh ñược quan tâm nên năng suất, sản lượng mía liên tục tăng Theo Bộ Nông nghiệp và PTNT, vụ mía năm 2012-2013, diện tích mía cả nước

là 298.200 ha, tăng hơn so với vụ trước 15.000 ha, năng suất mía bình quân cả nước ñạt 63,9 tấn/ha tăng so với vụ trước 2,2 tấn/ha, sản lượng mía cả nước ñược 19,04 triệu tấn, tăng so với vụ trước 1,5 triệu tấn Diện tích vùng nguyên liệu tập

trung là 285.100 ha, tăng hơn vụ trước 14.139 ha và ựược phân chia khá ựồng ựều giữa 3 miền Về chất lượng, do chăm sóc tốt, chất lượng mắa vụ 2012-2013 tốt hơn vụ trước, trữ lượng ựường bình quân của mắa ựưa vào nhà máy chế biến khoảng 9,8 CCS, cao hơn vụ trước 0,2 CCS

1.2.3 Nguồn gốc và lịch sử phát triển của cây mắa

Mắa có nguồn gốc ở vùng quần ựảo Ghinê, nam Thái Bình Dương Cây mắa có thể ựã xuất hiện từ hàng vạn năm về trước, khi mà lục ựịa Á - Úc còn dắnh liền nhau Người ta ựã tìm thấy những loài cây dại thuộc chi Saccharum phân bố rộng khắp ở Ấn độ, Trung Quốc, các quần ựảo ở nam Thái Bình Dương (Philippin, Indonesia, Australia) Ở Trung Quốc và Ấn độ, nghề trồng mắa làm ựường ựã có cách ựây hơn 2.000 năm Từ hai nước này, nghề trồng mắa ựược phổ biến rộng khắp vùng đông Nam Á trong ựó có Việt Nam (http://www.kilobooks.com/nguon-goc-cay-mia)

thích hợp cho thời kì mía chín từ 15-200C Hàm lượng ñường trong mía thường ñạt ở mức cao nhất cho các vùng có khí hậu lục ñịa hay ở vùng cao.

1.2.5.2 Ánh sáng

Mía là cây nhạy cảm với ánh sáng và có nhu cầu cao về ánh sáng Thiếu ánh sáng, mía phát triển không tốt, hàm lượng ñường thấp Mía cần thời gian tối thiểu là 1200 giờ, tốt nhất là trên 2000 giờ Quang hợp của cây mía tỉ lệ thuận với cường ñộ và ñộ dài chiếu sáng Thiếu ánh sáng cây hút phân kém, ở vùng nhiệt ñới và á nhiệt ñới mía vươn cao mạnh nhất khi bắt ñầu vào mùa hè có ñộ dài ngày tăng lên

1.2.5.3 ðộ ẩm

Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại không chịu ñược úng nước Mía có thể phát triển tốt ở những vùng có lượng mưa từ 1500mm/năm.Giai ñoạn sinh trưởng mía yêu cầu lượng mưa từ 100-170mm/tháng Khi chín cần khô ráo, mía thu hoạch sau một thời gian khô ráo khoảng 2 tháng sẽ cho tỉ lệ ñường cao

1.2.5.4 ðộ cao

ðộ cao có liên quan ñến cường ñộ chiếu sáng cũng như mức chênh lệch nhiệt ñộ giữa ngày và ñêm, do ñó ảnh hưởng ñến khả năng tích tụ ñường trong mía, các khâu trong qui trình chế biến Giới hạn về ñộ cao ảnh hưởng ñến hoạt ñộng sinh trưởng và phát triển của cây mía, ñiều kiện tốt nhất vùng xích ñạo là 1600m, ở vùng nhiệt ñới là 700-800 m

1.2.5.5 ðất trồng

Mía là loại cây công nghiệp khoẻ, dễ tính, không kén ñất, có thể trồng mía trên nhiều loại ñất khác nhau, từ ñất có tỷ lệ sét tới 70% cho tới các loại ñất có ñất chứa 70% cát ðất thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển của mía là những loại ñất xốp, tầng canh tác sâu, có ñộ phì cao, giữ ẩm tốt và dễ thoát nước

Mía có thể phát triển ở ñất có ñộ pH trong khoảng 4-9, nhưng ñộ pH thích hợp là 5,5-7,5 ðộ dốc ñịa hình không vượt quá 15 ñộ, ñất không ngập úng thường xuyên Những vùng ñất ñai bằng phẳng cơ giới vận tải tương ñối thuận lợi ñều

có thể bố trí trồng mía Ngoài ra người ta có thể canh tác mía ở cả những vùng

gò ñồi có ñộ dốc không lớn lắm ở vùng trung du miền núi

1.2.6 Giá trị kinh tế

Mía là cây nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp chế biến ñường ðường là một loại thực phẩm cần có trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều quốc gia trên thế giới, cũng như là loại nguyên liệu quan trọng của nhiều ngành sản xuất công nghiệp nhẹ và hàng tiêu dùng như bánh kẹo Lượng nước trong mía chiếm khoảng 80-90% khối lượng thân, trong ñó hàm lượng ñường chiếm 16-18%

- Bã mía chiếm 25-30% khối lượng mía ép Bã mía có thể dùng làm nguyên liệu ñốt lò, hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm

ra Furfural là nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp

- Mật gỉ chiếm 3-5% khối lượng mía ép Từ mật gỉ cho lên men chưng cất rượu rum, một ha mía với kỹ thuật sản xuất hiện ñại của thế kỷ 21 có thể sản xuất 7000-8000 lít cồn ñể làm nhiên liệu Từ một tấn mía tốt người ta có thể sản xuất ra 35-50 lít cồn 960

- Bùn lọc chiếm 1,5-3% khối lượng mía ép Từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía

ñể sản xuất nhựa xêrin làm sơn, xi ñánh giầy, vv Sau khi lấy sáp bùn lọc dùng làm phân bón rất tốt

Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ ñất rất tốt Mía là cây rễ chùm và rễ phát triển mạnh trong tầng ñất từ 0-60cm Một ha mía tốt có thể có 13-15 tấn rễ,

sau khi thu hoạch bộ rễ ñể lại trong ñất cùng với bộ lá sẽ phân hủy ra các chất hữu cơ làm tăng ñộ phì của ñất (http://vi.wikipedia.org/wiki)

1.3 Tổng quan nghiên cứu về bệnh hại thực vật do Phytoplasma

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu Phytoplasma

Năm 1967, các nhà khoa học người Nhật ñã xác ñịnh ñược nguyên nhân của nhiều bệnh biến vàng trên cây trồng là do Mycoplasma gây ra Các triệu chứng biến vàng trên cây trồng trước kia thường ñược cho là do virus Từ năm

1967 ñến năm 1994, tên Mycoplasma ñã ñược sử dụng ñể nghiên cứu tác nhân của nhiều bệnh biến vàng trên cây trồng ðến năm 1994, tên gọi Phytoplasma ñã ñược công nhận tại hội nghị lần thứ 10 của tổ chức quốc tế về ngành Mycoplasma học thay cho tên gọi “mycoplasma like organism” hay MLOs (Lee

et al., 2000)

1.3.2 Hình thái Phytoplasma

Phytoplasma là một dạng vi khuẩn thiếu vách tế bào nên không có hình dạng cố ñịnh, tế bào của chúng ñược bao bọc bởi một lớp màng nhầy có tính ñàn hồi dày từ 75-100 A0 (Angstron) Khi quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử chúng

có dạng hình cầu, hình ovan, có thể có dạng hình sợi ngắn, dạng hình tròn với ñường kính trung bình từ 200-800 µm (Doi et al., 1967; Kirkpatrick, 1987) Bên trong lớp màng nhầy có tế bào chất, ribosome và nhân ở dạng trần Kích thước

bộ gen của Phytoplasma thay ñổi từ 530 kilobases tới 1130 kilobases (Lee et al., 2000) Phytoplasma là nhóm ký sinh bắt buộc trong mô libe thực vật, và trong một số loài côn trùng thuộc nhóm chích hút (Doi et al., 1967), nó không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

1.3.3 Tầm quan trọng của bệnh do Phytoplasma trên thực vật

Phytoplasma gây bệnh cho hàng trăm loại cây trồng khác nhau ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới với các triệu chứng biến vàng, lùn cây, hoá xanh vỏ quả,

chổi rồng vv (Bertaccini, 2007) Loài Ca Phytopalsma oryzae gây bệnh vàng lùn lúa; hai loài Ca Phytoplasma asteris và Ca Phytoplasma japonicum gây bệnh vàng cây cúc tây; Ca Phytoplasma aurantifolia gây bệnh chổi rồng trên lạc;

ba loài Ca Phytoplasma palmae, Ca Phytoplasma castaneae và Ca Phytoplasma cocosnigeriae gây bệnh chết vàng cây dừa cạn; Ca Phytoplasma

brasiliense gây bệnh chổi rồng hoa dâm bụt

Thiệt hại của cây trồng khi bị bệnh do Phytoplasma gây ra cũng giống như thiệt hại khi cây bị bệnh vi rút, Phytoplasma gây thoái hoá cây trồng dẫn ñến năng suất và phẩm chất giảm, cây tàn lụi, ảnh hưởng rất lớn ñến lợi ích kinh tế của người trồng trọt Nhưng cũng có trường hợp ñặc biệt, Phytoplasma gây bệnh trên cây trồng lại có lợi cho sự phát triển hình thái của cây, như bệnh Phytoplasma gây lùn cây trạng nguyên (Bertaccini, 2007)

1.3.4 Vị trí phân loại Phytoplasma

Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergeys (2004), tất cả các loài

Phytoplasma ñều ñược xếp vào chi Candidatus Phytoplasma, Bộ Acholeplas- -matales, lớp Mollicutes, ngành Firmucutes, giới Bacteria Trên cơ sở so sánh chuỗi RNA ribosome 16S (16S rRNA), các loài Ca Phytoplasma ñược xếp vào

ít nhất 19 nhóm phả hệ (ký hiệu từ 16SrI ñến 16SrXIX), và có trên 70 phân nhóm (Bertaccini, 2007; Lee et al., 2000)

Bảng 1.2 Phân nhóm phytoplasma dựa trên phân tích RFLP của gene 16S

rRNA (Lee et al., 1998a)

Nguồn tài liệu

16SrI: Aster yellows

I-A Aster yellows witches’ broom

(AYWB)

NC_007716 Bai et al., 2006

I-B Onion yellows mild strain (OY-M) NC_005303 Oshima et al., 2004 I-B ‘Ca P asteris’, aster yellows (MAY) M30790 Lee et al., 2004a

I-D Paulownia witches’ broom (PaWB) AY265206 Lee et al., 2004a

I-F Aster yellows apricot – Spain

(A-AY)

X68338 AY265211

(STRAWB2)

U96616 Jomantiene et al.,

1998

I-O Soybean purple stem (SPS) AF268405 Lee et al., 2002 I-P Aster yellows from Populus (PopAY) AF503568 Šeruga et al., 2003

I-R Strawberry phylloid fruit

U15442 Zreik et al., 1995

II-C Faba bean phyllody (FBP) X83432 Seemüller et al., 1998 II-D Sweet potato little leaf (SPLL) AJ289193 Gibb et al., 1995 II-E Pichris echioides phyllody (PEY) Y16393 Seemüller et al., 1998

16SrIII: X-disease

III-A Western X-disease (WX) AF533231 Liefting &

Kirkpatrick, 2003 III-B Clover yellow edge (CYE) L33766 8 Gundersen et al.,1994

III-D Goldenrod yellows (GR1) EF186810 Martini et al., 2007

III-K Strawberry leafy fruit (SLF) AF1477067 Jomantiene & Davis,

2000 III-L Cassava frog skin disease (CFSD) EU346761 Alvarez et al., 2009 III-P Dandelion virescence (DanV) AF370119 Jomantiene & Davis,

2001 III-Q Black raspberry witches’ broom AF302841 Davis et al., 2001 III-T Sweet and sour cherry (ChD) FJ231728 Valiunas et al., 2009

2002b

16SrIV: Coconut lethal yellows

IV-A Coconut lethal yellowing (LYJ-C8) AF498307 Harrison et al., 2002 IV-B Yucatan coconut lethal decline

(LDY)

U18753 Harrison et al., 1994

IV-C Tanzanian coconut lethal decline

AB052876 Jung et al., 2003a

V-D Flavescence dorée (FD-D) AJ548787 Torres et al., 2005

16SrVI: Clover proliferation

VI-A ‘Ca P trifolii’, clover proliferation AY390261 Hiruki & Wang, 2004

VI-B Strawberry multiplier disease

(SMPD)

AF036354 Jomantiene et al.,

1998 VI-C Illinois elm yellows (ILEY) AF268895 Jacobs et al., 2003

16SrVII: Ash yellows

VII-A ‘Ca P fraxini’, ash yellows (AshY) AF092209 Griffiths et al., 1999 VII-B Erigeron witches’ broom AY034608 Barros et al., 2002

16SrVIII: Loofah witches’ broom

VIII-A Loofah witches’ broom (LufWB) AF086621 Ho et al., 2001

16SrIX: Pigeon pea witches’ broom

IX-A Pigeon pea witches’-broom (PPWB) AF248957 Davis & Dally, 2000 IX-C Naxos periwinkle virescence

fruit yellows (ESFY)

AJ542544 Seemüller &

Schneider, 2004 X-C ‘Ca P pyri’, pear decline (PD) AJ542543 Seemüller &

Schneider, 2004 X-D ‘Ca P spartii’, spartium witches’

broom (SpaWB)

X92869 Marcone et al., 2004a

X-E Black alder witches’ broom (BAWB) X76431 Seemüller et al., 1994

16SrXI: Rice yellow dwarf

XI-A ‘Ca P oryzae’, rice yellow dwarf

(RYD)

AB052873 Jung et al., 2003b

XI-B Sugarcane white leaf (SCWL) X76432 Lee et al., 1997

16SrXII: Stolbur

XII-B ‘Ca P australiense’, Australian

grapevine yellows (AUSGY)

L76865 Davis et al., 1997

16SrXIII: Mexican periwinkle virescence

XIII-A Mexican periwinkle virescence

(MPV)

AF248960 Dally et al., 2000

XIII-B Strawberry green petal, Florida U96616 Jomantiene et al.,

1998

16SrXIV: Bermudagrass white leaf

XIV-A ‘Ca P cynodontis’ bermudagrass

AF147708 Montano et al., 2001

16SrXVI: Sugarcane yellow leaf syndrome

16SrXVII: Papaya bunchy top

16SrXVIII: American potato purple top wilt

16SrXIX: Cassia witches’-broom

1.3.5 Triệu chứng bệnh do Phytoplasma gây ra

Phytoplasma xâm nhập vào mạch libe và gây ra hiện tượng biến vàng ở cây bệnh, có thể làm cho các bộ phận của hoa có cấu trúc giống như của lá, nó cũng có thể làm cho cánh hoa chuyển thành màu xanh do mất các sắc tố, lá cây thường có màu vàng do sự phá huỷ của chất diệp lục Nhiều cây bị nhiễm Phytoplasma thường phát triển thành bụi do sự phát triển không bình thường, cây biến dạng, thấp lùn, còi cọc, ñốt thân, ngọn cành, ngọn chính rụt ngắn lại, mọc chồi phụ ở lóng thân, gốc (bệnh chồi cỏ, bệnh chổi rồng) Những cây bị nhiễm Phytoplasma sẽ phát triển nhiều chồi bên và tăng kích thước của lóng, ñốt (Lee

et al., 2000; Pracros et al., 2006)

1.3.6 Sự lan truyền bệnh do Phytoplasma

Phytoplasma không lan truyền qua tiếp xúc cơ học, qua dụng cụ chặt cành, hom, nó ñược lan truyền thông qua hom giống, qua chiết hay ghép mầm từ cây

bị bệnh lên cây khoẻ (Christensen et al., 2005) Phytoplasma không truyền qua hạt giống, lan truyền trong tự nhiên nhờ một số loài rầy thuộc họ Cicadellidea và Fulgoridea theo kiểu bền vững

Côn trùng môi giới thường chích hút dịch cây bị bệnh mang Phytoplasma

và xâm nhập vào cơ thể côn trùng thông qua kim hút, chúng di chuyển trong ñường ruột và ñược hấp thu vào máu, Phytoplasma sẽ tồn tại và nhân lên trong tuyến nước bọt, quá trình này thường mất khoảng 3 tuần Thời gian từ khi Phytoplasma ñược hút bởi côn trùng và tích lũy trong tuyến nước bọt ñến khi ñạt tới mức ñộ có thể lây nhiễm cho cây ñược gọi là giai ñoạn ủ bệnh trong cơ thể côn trùng Sau khi Phytoplasma ñã ñược nhân lên về số lượng trong cơ thể côn trùng môi giới, chúng sẽ theo nước bọt lan truyền gây bệnh cho cây, thông qua

sự chích hút của côn trùng (Lee et al., 2000) Phổ cây ký chủ của Phytoplasma phụ thuộc rất lớn vào côn trùng môi giới cũng như khả năng qua ñông của chúng trong cơ thể côn trùng môi giới hoặc trong cây lưu niên (Chrsitensen et al., 2005)

1.3.7 Phát hiện và ñịnh loại Phytoplasma gây bệnh thực vật

Phương pháp ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ñã ñược thử nghiệm ñể phát hiện Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ từ mô cây mía bị bệnh (Viswanathan., 1997) Tuy nhiên, phương pháp này có ñộ nhạy không cao và không chính xác do kháng huyết thanh ñã tạo ra những phản ứng không ñặc hiệu với cả dịch cây khỏe Việc sử dụng một số ñoạn dò DNA (DNA probe) trong thập niên 80 và 90 ñã phát hiện một số phần DNA ñặc hiệu trong bộ gennome của một số chủng Phytoplasma (Harrison et al., 1994) Phương pháp Southern hybridization và phân tích RFLP sử dụng ñoạn dò DNA ñã có thể phân biệt ñược

3 loài phụ, thuộc về nhóm “aster yellows phytoplasma” và 7 loài phụ trong nhóm

“X-disease” (Lee et al., 1992) Tuy nhiên, phương pháp sử dụng ñoạn dò DNA là quá trình bao gồm nhiều khâu phức tạp, người thực hiện phải có trình ñộ và tay nghề cao

ðể xây dựng bộ primer chung sử dụng trong phản ứng PCR khuyếch ñại gen 16SrDNA của Phytoplasma, hoặc xây dựng phương pháp real-time PCR, trình tự toàn bộ của gen 16SrDNA, ñoạn nằm giữa 16S/23SrDNA và một phần 23SrRNA ñã ñược ñọc, (Namba et al., 1993a, 1993b; Hodgetts et al., 2008,2009) Từ ñó, phương pháp sử dụng primer chung ñặc hiệu của Phytoplasma hoặc primer ñặc hiệu cho từng nhóm Phytoplasma ñược thiết kế dựa trên ñoạn bảo thủ của gen 16SrRNA và 23SrRNA (Lee et al., 1993, 1994)

PCR và một số kỹ thuật khuyếch đại DNA khác là sự lựa chọn tốt nhất để chẩn đốn Phytoplasma Các phương pháp này cĩ một số ưu điểm so với các phương pháp khác do linh hoạt, tương đối đơn giản, độ nhạy và tính đặc hiệu cao ðặc biệt, độ nhạy cĩ thể được gia tăng khi thực hiện phản ứng PCR 2 lần (nested PCR), một lượng nhỏ sản phẩm PCR lần thứ nhất được đưa vào dung dịch phản ứng của phản ứng PCR lần thứ 2, mà cặp primer sử dụng là cặp primer nằm phía bên trong của cặp primer sử dụng trong phản ứng PCR lần thứ 1 Từ đĩ

cĩ thể tách biệt, xác định và phân loại Phytoplasma dựa trên cây phát sinh lồi từ trình tự đoạn gen rRNA thu được bằng kỹ thuật PCR (Lee et al., 1998, 2000) Phương pháp nested PCR đã phát hiện được một số lồi và nhĩm phụ, trong số

đĩ cĩ nhĩm rice yellow dwarf (RYD) Phytoplasma hay cịn gọi là nhĩm 16SrXI bao gồm Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mía (SCGS) và bệnh trắng lá mía (SCWL) cùng với một số chủng Phytoplasma khác gây bệnh chủ yếu trên cây thuộc họ hịa thảo và trắng lá cỏ gà (BGWL) (Hanboonsong et al., 2002)

Dựa trên sự phân tích cây phát sinh lồi sử dụng trình tự gen 16SrRNA hoặc 16SrRNA và gen ribosomal protein, đã xác định được vị trí của đối tượng gây bệnh mới Phytoplasma (Seemüller et al., 1994) Nhiều nhà khoa học đã nỗ lực xác định và phân loại chủng Phytoplasma lạ dựa trên phương pháp phân tích trình tự gen 16SrDNA hoặc đoạn trình tự nằm giữa 16SrDNA và 23SrRNA (Kirkpatrick et al, 1994)

Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng các enzyme giới hạn để phân tích tính

đa hình của đoạn trình tự 16SrDNA từ sản phẩm PCR thu được (Schneider et al., 1993) ðây là phương pháp đơn giản, hiệu quả và dễ thực hiện Việc phân loại nhĩm Phytoplasma dựa trên việc phân tích RFLP sử dụng enzyme giới hạn đã mang tính đồng nhất so với việc phân nhĩm phát sinh lồi dựa trên số liệu về

trình tự gen phân tích (Gundersen et al., 1994) Dựa trên việc phân tích RFLP sử dụng trình tự ñoạn gen 16SrDNA của Phytoplasma, Lee và cộng sự ñã xác ñịnh

10 nhóm Phytoplasma chính và 15 nhóm phụ (Lee et al., 1993) Về sau phương pháp này ñược phát triển, mở rộng và ñã xác ñịnh ñược 14 nhóm và 38 nhóm phụ (Lee et al., 1998) Sau ñó, một số nhà nghiên cứu ñã tách biệt rõ hơn các nhóm phụ trong mỗi nhóm chính dựa trên những ñoạn trình tự ít bảo thủ hơn như

sử dụng khối gen ribosomal protein hoặc ñoạn trình tự nằm giữa gen 16S và 23SrRNA, từ ñó ñã xác ñịnh ñược một số nhóm phụ khác (Gundersen et al.,

1994, 1996) Những nhóm phụ ñược xác ñịnh bằng phương pháp này ñã ñồng nhất với những khối genome phụ ñược xác ñịnh từ trước dựa trên những nghiên cứu về tính tương ñồng trình tự DNA sử dụng phép lai phân tử (Lee et al., 1994) Tuy nhiên phương pháp này cũng không thể phân biệt sâu hơn trong từng nhóm phụ do sự biến ñộng của các marker có mặt trên gen 16SrRNA còn ở mức ñộ hạn chế (Martini et al., 2007) Ví dụ, Phytoplasma gây bệnh chồi cỏ mía và Phytoplasma gây bệnh trắng lá mía có sự tương ñồng về mặt di truyền tới 99%

và thường gây ra những triệu chứng khá giống nhau khó có thể phân biệt Một số cuộc khảo sát cho thấy, ñoạn 5’-end của gen 16SrRNA có chứa nhiều thông tin quan trọng phục vụ cho việc phân biệt SCWLD và SCGSD (Sdoodee et al., 1999; Marcone, 2002)

ðối với vi khuẩn, gen ribosomal protein (rp) là những gen có cùng nguồn gốc

phát sinh và mang những dấu hiệu phát sinh loài rất cao Sự phát sinh loài dựa

vào trình tự gen rp ñã làm rõ hơn về mối tương quan phát sinh loài trong số các chủng Phytoplasma (Martini et al., 2007) Việc sử dụng một gen khác, gen secA

ñể tăng cường khả năng phân biệt sự phát sinh loài Với khả năng biến ñổi cao

hơn so với gen 16SrRNA, gen rp và secA cung cấp nhiều marker hữu ích hơn ñể

tách biệt những chủng sinh thái trước ñây chưa thể phân biệt ñược khi áp dụng gen 16SrRNA (Hodgetts et al., 2008)

Gần ñây phương pháp “loop-mediated isothermal amplification” (LAMP) ñã ñược phát triển ñể giám ñịnh bệnh do Phtytoplasma Phương pháp này nhanh hơn phương pháp PCR và không cần nhiều bước thực hiện như phương pháp nested PCR, do ñó sẽ giảm khả năng bị nhiễm tạp của mẫu phân tích LAMP là phương pháp nhân bản DNA nhanh, ñược phát triển bởi Notomi (Notomi et al, 2000) Kỹ thuật này ñược ứng dụng ñể phát hiện virus, vi khuẩn, Phytoplasma, nấm và ký sinh gây bệnh trên cả cây trồng và vật nuôi Phương pháp này yêu cầu một bộ mồi ñặc biệt ñể nhận ra từ 2-6 vùng trên gen ñích, do vậy làm tăng ñộ nhạy và ñộ nhanh của phản ứng Kết quả của phản ứng LAMP có thể ñược quan sát bằng mắt thường hay bằng ñiện di trên gel agarose, hoặc thêm thuốc nhuộm phát quang dưới tia cực tím Kỹ thuật LAMP ñược thực hiện trong ñiều kiện ñẳng nhiệt Vì vậy, cần sử dụng các thiết bị giữ nhiệt như bể ổn nhiệt, tủ ấm Kỹ thuật LAMP có thể kết hợp với kỹ thuật tách chiết DNA tổng số theo một cách mới, quy trình có thể ñược thực hiện trong một giờ (Sugawa et al., 2012)

Dickinson ñã thiết kế primer ñể giám ñịnh nhóm Phytoplasma thuộc nhóm 16SrXI và XIV bao gồm cả SCGSD và SCWLD và các phương pháp này ñã ñược kết hợp thành hệ thống phát hiện nhanh những chủng Phytoplasma này (Dickinson, công trình chưa công bố)

1.3.8 Những nghiên cứu về bệnh Phytoplasma hại mía

Bệnh chồi cỏ mía (sugarcane grassy shoot disease - SCGSD) ñược ghi nhận ñầu tiên ở Ấn ðộ, Bangladesh, Malaysia, Nepal và Pakistan (Chona et al., 1960) Tại Sri Lanka, bệnh xuất hiện ñầu tiên ở bang Kantale của Sri Lanka năm

1972 và ñược gọi là bệnh chồi cỏ Bệnh gây thiệt hại lớn ñến năng suất trong

nhiều năm và ựã trở thành bệnh nghiêm trọng nhất trong ngành trồng mắa của bang này Triệu chứng bệnh thường gặp nhất là làm cho lá nhỏ và một phần hoặc toàn bộ phiến lá bị biến màu, cây bị lùn, hình thành nhiều chồi rễ và chồi bên từ gốc cho ựến ngọn của thân Những cây non thường có hình dạng giống như chồi

cỏ hình hoa thị màu vàng hoặc màu trắng và thậm chắ có thể bị chết (Jayathilake, 1973)

Bệnh trắng lá mắa là một trong những bệnh nguy hiểm nhất của cây mắa tại đài Loan (Matsumoto et al 1968), Thái Lan (Nakashima et al., 1994; Wongkaew et al, 1997), Sri Lanka (Ariyarathna et al., 2007; Chandrasene et al., 2003; Kumarasinghe and Jones, 2001), và Lào (Burgess 2010) Một số loại cỏ

xung quanh ruộng mắa bị nhiễm bệnh trắng lá như cỏ Bermuda (Cynodon dactylon L.), crowfoot grass (Dactyloctenium aegyptium L.) and brachiaria grass (Brachiaria distachya L.) cũng bị nhiễm bệnh (Rishi and Chen 1989) Phân tắch

tắnh ựa hình ựã chỉ ra rằng Phytoplasma gây bệnh trắng lá trên cỏ bermuda (BGWL) có quan hệ gần gũi với Phytoplasma gây bệnh trắng lá mắa (Nakashima

et al., 1996) Tuy nhiên, phân tắch trình tự gen cho thấy không có chủng Phytoplasma nào gây bệnh trắng lá trên cỏ có ựộ tương ựồng với Phytoplasma gây bệnh trắng lá mắa (Wongkaew et al., 1997) Dựa vào việc phân tắch trình tự gen 16SrDNA chủng Phytoplasma này ựược xếp vào nhóm 16SrXI-B (Lee et al., 1998) Phytoplasma gây bệnh trắng lá mắa ựược truyền bởi loài rầy

Matsumuratettix hiroglyphicus (Matsumura) và Yamatotettix flavovittatus

(Matsumoto et al., 1968; Hanboonsong et al., 2002; Wongkaew et al., 1997)

Rầy M hiroglyphicus và rầy Y flavovittatus có vai trò vừa là nguồn bệnh di

ựộng vừa là môi giới của bệnh trắng lá mắa, chúng là ựối tượng quan trọng cần ựược quản lý (Hanboonsong et al., 2006)

Tắnh ựa dạng của Phytoplasma trên mắa và cỏ ựã ựược nghiên cứu tại phắa Bắc Australia (Tran-Nguyen et al., 2000) Mối liên hệ giữa Phytoplasma và bệnh

ựã ựược thiết lập ựầu tiên vào năm 1997, một số mẫu Phytoplasma mắa thu thập

từ vùng Sevangala và Uda Walawe ựược ghi nhận là tương tự với Phytoplasma gây bệnh trắng lá mắa ở Thái Lan, đài Loan và Nhật Bản (Chen, 1973; Nakashima et al., 1994) Mặc dù khó có thể phân biệt bệnh chồi cỏ mắa và trắng

lá mắa thông qua triệu chứng nhưng có thể phân biệt thông qua giải mã gene

Việc xác ựịnh phương thức lan truyền bệnh chồi cỏ mắa cho thấy Phytoplasma ựược truyền từ cây này sang cây khác thông qua quá trình ghép, trồng bằng hom giống và còn ựược truyền bằng côn trùng chắch hút, ựặc biệt là nhóm rầy (McCoy et al., 1989) Một số nghiên cứu cho thấy loài rầy

Deltocephalus vulgaris là môi giới truyền bệnh chồi cỏ (Singh et al., 2002;

Srivastava et al., 2006); và phương pháp nested PCR ựã ựược sử dụng thành

công ựể phát hiện Phytoplasma trong cơ thể rầy D vulgaris (Srivastava et al., 2006) Ngược lại, một số nghiên cứu khác lại ghi nhận rằng loài Proutista moesta có khả năng truyền bệnh chồi cỏ ở Ấn độ (Edison, 1976; Rishi &Chen, 1989) Tuy nhiên, loài P moesta không ựược ghi nhận tại Australia, do ựó sẽ có

một loài côn trùng khác là môi giới truyền bệnh chồi cỏ mắa ở Australia Nguyen et al., 2000)

(Tran-1.3.9 Biện pháp quản lý bệnh thực vật do Phytoplasma gây ra

Việc phòng trừ Phytoplasma chủ yếu thông qua việc tạo và trồng giống kháng bệnh kết hợp với việc phòng trừ côn trùng môi giới Có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy mô ựể tạo ra dòng vô tắnh sạch bệnh (Lee et al., 2000)

Phương pháp truyền thống sử dụng thuốc hóa học ựể phòng trừ côn trùng môi giới ựược xem là chưa ựầy ựủ ựể quản lý bệnh do Phytoplasma gây ra

(Wally et al., 2004; Weintraub and Beanland, 2006) Sử dụng lưới chống côn trùng bao phủ toàn bộ cây là biện pháp hữu hiệu nhất, tuy nhiên biện pháp này không thắch hợp ựối với những phạm vi rộng lớn (Weintraub, 2007)

Weintraub (2007) thông báo về khả năng phòng chống côn trùng môi giới bằng việc sử dụng hợp chất carbohydrate có khả năng kết hợp với lectin thực vật

và có thể hạn chế sự chắch hút của côn trùng môi giới vào mô thực vật Một nghiên cứu khác ựã tiến hành phun hoạt chất kắch kháng thực vật, có tên gọi là

benzothiadiazole (BTH) lên cây Arabidopsis thalianab trước khi lây bệnh

ỘX-diseaseỢ ựã làm giảm ựáng kể tỷ lệ bệnh (Bressan and Purcell, 2005) Các hợp chất kháng sinh, các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc hữu cơ và vô cơ ựược sử dụng ựể phòng chống bệnh do Phytoplasma hại cây trồng Tuy nhiên, biện pháp

này mới chỉ áp dụng trong ựiều kiện in vitro và chậu vại (Durrant and Dong,

2004; Vallad and Goodman, 2004; Mandal et al., 2008; Hammerschmidt, 2009; Vlot et al., 2009; Hayat et al., 2010) Biện pháp xử lý hom giống bằng nước nóng có hiệu quả phòng chống bệnh do Phytoplasma gây hại trên cây mắa một cách rõ rệt tại Thái Lan và đài Loan (Marcone, 2002; Kaewmanee and Hanboonsong, 2011)

để quản lý bệnh Phytoplasma hại cây trồng, các biện pháp sau thường ựược áp dụng trong sản xuất:

- Nhổ bỏ, tiêu hủy tàn dư cây bệnh kết hợp với vệ sinh ựồng ruộng, làm sạch cỏ dại và ký chủ phụ của tác nhân gây bệnh

- Không vận chuyển trao ựổi hom giống từ các vùng bị bệnh ựến các vùng chưa

bị bệnh hay vùng trồng mới Cần kiểm tra chặt chẽ khâu nhập giống mới từ nước ngoài về, nếu nhập cần phải có thời gian ựánh giá trong ựiều kiện cách ly

- Chọn giống kháng/chống chịu bệnh

- Sử dụng cây giống sạch bệnh, không sử dụng cây ñã bị nhiễm bệnh hoặc cây từ vùng ñã bị nhiễm bệnh làm hom giống

- Xử lý hom giống bằng nước nóng ñể tiêu diệt mầm bệnh trong hom giống

- Quản lý môi giới truyền bệnh (nếu có)

1.4 Các nghiên cứu về Phytoplasma hại cây trồng ở Việt Nam

Ở Việt Nam các nghiên cứu về Phytoplasma gây bệnh cây còn rất ít và hạn chế Nghiên cứu trình tự gen ñầu tiên ñối với Phytoplasma tại Viêt Nam là một nghiên cứu của các nhà khoa học Anh và Mỹ thực hiện trên mẫu cây xoan ta

(Melia azedarach) bị bệnh biến vàng thu thập tại Huế năm 2003 Dựa vào các kỹ

thuật PCR, RFLP kết hợp giải trình tự gen, các tác giả ñã xác ñịnh ñược tác nhân gây bệnh là do Phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (aster yellows group) và ñặt tên

là Vietnam chinaberry yellows phytoplasma với mã số GenBank là AY863003

(Harrison et al., 2006)

Vũ Triệu Mân và cộng sự (2002) khi sử dụng phương pháp cắt lát và chụp ảnh trên kính hiển vi ñiện tử trên các mẫu cây mía bị bệnh trắng lá ñã phát hiện các thể Phytoplasma có hình tròn, ovan hay dạng không ñịnh hình Các tác giả

ñã cho rằng nguyên nhân gây bệnh trắng lá mía tại một số vùng trồng mía của Việt Nam là do Phytoplasma gây ra Nhóm tác giả cũng xác ñịnh rằng rệp mía

(Aphis sacchari), rệp bông (Aphis gossypii), rệp ñào (Myzus persicae) và bọ phấn (Bemisia sp.) ñều không phải là môi giới truyền bệnh trắng lá mía Ngoài

ra, nhóm tác giả cũng ñã nghiên cứu và phát hiện một số bệnh do Phytoplasma gây ra trên một số cây trồng khác như lúa tại Thanh Hóa

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu

- Cây mía khỏe và cây biểu hiện triệu chứng bệnh được thu thập làm vật liệu

nghiên cứu trong phịng thí nghiệm

- Dụng cụ, máy mĩc thí nghiệm: máy tạo nước cất, bộ Pipet, máy li tâm eppendorf5415R, hệ thống PCR MyCycleTM, thermal Cycler Eppendorf, máy Geldoc-ITTM, tủ hút khí độc, máy lắc, cân điện tử, tủ lạnh âm sâu, nồi hấp, máy khuấy từ, pH meter, lị vi sĩng, bình tam giác, ống thủy tinh, ống effendorf, ống PCR, cối chày sứ, bình đựng nitơ lỏng,

- Hĩa chất dùng trong thí nghiệm: isopropanol, alcohol, nước cất, agarose, cetyl trimethyl ammonium bromide, ethanol, chloroform, potasium chlorie, HCl, Tris, EDTA, ethidium Bromide, Taq DNA polymerase, Gene ruler 1kb DNA Lader, các loại enzim cắt giới hạn, nitơ lỏng, dNTPmix, primers, Tris-HCl, CTAB,…

2.1.2 ðịa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu trong phịng: Tại phịng thí nghiệm chẩn đốn bệnh cây - Bộ mơn Chẩn đốn, Giám định dịch hại và Thiên địch - Viện Bảo vệ thực vật

- Nghiên cứu ngồi đồng ruộng: Thu thập mẫu bệnh đại diện tại tỉnh trồng mía

cĩ xuất hiện bệnh là: Nghệ An và Bình Dương

- Trình tự gen được đọc tại cơng ty Bioneer của Hàn Quốc

- Kết hợp gửi mẫu giám định tại phịng thí nghiệm Phytoplasma của trường ðại học Nottingham, Vương quốc Anh để so sánh

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu sự phân bố và gây hại của nhóm bệnh do

Phytoplasma gây ra trên cây mắa

- điều tra thu thập mẫu bệnh nghi do Phytoplasma gây ra tại tỉnh Nghệ An và tỉnh Bình Dương

- Mô tả chi tiết các triệu chứng bệnh do Phytoplasma gây ra trên mắa tại các ựịa ựiểm ựiều tra

- đánh giá sự phân bố, mức ựộ gây hại của bệnh do Phytoplasma gây ra tại các ựiểm ựiều tra

Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật phân tử xác ựịnh bệnh do Phytoplasma gây hại trên mắa

- Nghiên cứu phát hiện Phytoplasma bằng phương pháp kắnh hiển vi ựiện tử

- Nghiên cứu kỹ thuật phân tử chẩn ựoán Phytoplasma gây bệnh trên mắa bằng phương pháp PCR, giải mã DNA và phân tắch trình tự gene, xây dựng cây phả

hệ, phân tắch tắnh ựa hình RFLP bằng một số enzyme giới hạn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp ựiều tra phát hiện bệnh hại do Phytoplasma gây ra

2.3.1.1 Phương pháp ựiều tra

điều tra phát hiện bệnh hại do Phytoplasma gây ra trên cây mắa theo phương pháp ựiều tra phát hiện dịch hại cây trồng của Viện Bảo vệ thực vật,

1997

2.3.1.1 Chọn vùng ựiều tra và ruộng ựiều tra

Tiến hành ựiều tra tại tỉnh hiện ựang có bệnh là Nghệ An, Bình Dương, trên các giống, các ựịa hình trồng mắa và các phương pháp canh tác khác nhau, trên mắa tơ và mắa lưu gốcẦ

- Phương pháp thu mẫu:

Lấy mẫu tại thân hoặc lá của những cây biểu hiện triệu chứng bất thường như vàng lá, trắng lá, chồi cỏ và cất giữ trong ống chứa hạt Sillicagel rồi chuyển sang cất trữ ở ñiều kiện -20oC cho ñến khi chiết suất DNA Mẫu cây khỏe cũng ñược thu thập ñể làm ñối chứng âm

ðối với mẫu bệnh sử dụng chụp ảnh hiển vi ñiện tử phải là mẫu tươi, chọn lọc tại phần thân ngọn mềm nhất

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xác ñịnh bệnh Phytoplasma hại trên mía

2.3.2.1 Phương pháp chụp ảnh hiển vi ñiện tử:

Kiểm tra sự có mặt của Phytoplasma trong mô lá cây mía thu thập ñược bằng kính hiển vi ñiện tử tại Viện Vệ sinh dịch tễ TW theo phương pháp của Wongkaew and Fletcher (2004) với một số ñiều chỉnh như sau: Mẫu lá tươi từ cây bị nhiễm bệnh ñược sử dụng, cắt mẫu lá thành những mẩu nhỏ kích thước 1-2mm và cố ñịnh bằng 2,5% glutaraldehyde (pha trong dung dịch 0.1 M phosphate, pH 7,2) trong vòng 24 giờ ở ñiều kiện 4oC Mẫu ñược rửa bằng dung dịch 0,1 M phosphate có chứa 0,5% sucrose và sau ñó ñược cố ñịnh bằng dung dịch 1% osmium tetroxide trong vòng 2 giờ ở ñiều kiện 4oC Sau ñó, mẫu ñược loại nước bằng cách rửa bằng acetone với các mức nồng ñộ khác nhau bao gồm

20, 50, 70, 90, và 100%, mỗi mức nồng ñộ kéo dài 30 phút, và tiếp tục rửa bằng acetone nguyên chất trong 3 lần, mỗi lần 30 phút, và ñược gắn vào nhựa Spurr ở ñiều kiện 60oC trong 8 giờ Ngâm mẫu trong hỗn hợp aceton-Spurr theo tỷ lệ (1:1) trong vòng 60 phút ñể tạo các lỗ hổng giúp nhựa Spurr có khả năng xâm nhập vào trong mô cây Mẫu cắt lát ñược nhuộm bằng chì và uranyl acetate và ñược quan sát bằng kính hiển vi ñiện tử JEOL 1010 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) 2.3.2.2 Chiết suất DNA

DNA tổng số từ mô mẫu thu về ñược chiết bằng dung dịch ñệm CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) theo phương pháp của Doyle & Doyle

(1987), Wang et al (1993) như sau:

- Ủ dung dịch hỗn hợp CTAB + β-ME (10 µl β-ME + 1 ml CTAB) ở ñiều kiện nhiệt ñộ 65oC, trong thời gian 30 phút

- Cho mẫu thực vật vào cối sứ sạch và cho dung dịch CTAB+ β-ME theo tỷ lệ 0,1 g/1 ml, nghiền nhuyễn hỗn hợp

- Cho dung dịch nghiền vào ống eppendorf 1,5 ml

- Ủ mẫu ở ñiều kiện 65oC trong 10 phút, tiến hành lắc mẫu mỗi 2-3 phút

- Ly tâm 10 phút ở ñiều kiện 15000 vòng/phút

- Dùng pipet hút lấy phần dịch phía trên (khoảng 400-500 µl) và loại bỏ phần cặn phía dưới

- Cho một thể tích tương ñương (khoảng 500 µl) dung dịch Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) vào phần dung dịch phía trên và lắc ñều

- Ly tâm trong 5-10 phút ở ñiều kiện 15000 vòng/phút

- Hút lấy phần dung dịch phía trên và loại bỏ phần dung dịch phía dưới

- Chiết suất lần 2 với một lượng tương ñương Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), lắc ñều

- Ly tâm trong 10 phút ở ñiều kiện 15000 vòng/phút

- Hút lấy phần dung dịch phía trên

- Bổ sung một thể tích tương ñương khoảng 400 µl isopropanol lạnh

- Lắc ñều, ly tâm trong 10 phút ở ñiều kiện 15000 vòng/phút (hoặc cất trong tủ lạnh -20oC trong vòng 1 giờ trước khi ly tâm

- Loại bỏ dung dịch trên tủa, giữ lại phần kết tủa

- Rửa phần kết tủa 3 lần bằng Ethanol 70% (khoảng 700 µl)

- Mở nắp eppendorf ñể trong ñiều kiện nhiệt ñộ phòng trong vòng 5-10 phút ñể mẫu khô tự nhiên

- Cho 50 µl H2O vô trùng hoặc TE buffer ñể hòa tan DNA trước khi cất giữ trong ñiều kiện nhiệt ñộ - 20oC

2.3.2.3 Khuyếch ñại DNA của Phytoplasma bằng cặp mồi chung

Phản ứng PCR ñược thực hiện trong 50 µl chứa 15 ng template DNA, 100

ng mỗi primer; 150 µM mỗi dNTP; 4 mM MgCl2; 1 unit Dream Taq Polymerase trong môi trường 1xPCR buffer (Fermentas, Germany) Phản ứng ñược thực hiện bằng Hệ thống MyCycleTM Thermal Cycler (Eppendorf, Germany), với chu trình như sau: 5 phút khởi ñầu ở 95oC tiếp theo 35 chu kỳ với 95oC trong 30 giây,

TmoC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút và giai ñoạn kéo dài trong vòng 10 phút ở nhiệt ñộ 72oC Trong ñó, Tm thay ñổi theo mức nhiệt ñộ từ 500C, 520C, 550C,

580C và 600C với từng cặp primer khác nhau Cặp oligonucleotide primer P1 (5’-AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T-3’) và P7 (5’-CGT CCT TCA TCG GCT CTT-3’)(Deng và Hiruki, 1991; Smart et al., 1996) ñược sử dụng trong PCR trực tiếp ñể khuyếch ñại ñoạn trình tự nằm giữa 16S và 23SrRNA của Phytoplasma

Sau khi kết thúc phản ứng, lấy 1µl sản phẩm PCR lần thứ nhất cho vào hỗn hợp phản ứng nested-PCR tương tự như trên nhưng với cặp oligonucleotide

có ñộ dài nucleotide ngắn hơn cặp P1/P7 nhằm tăng tính ñặc hiệu Phản ứng PCR cũng ñược thực hiện với ñiều kiện tương tự như PCR lần thứ nhất Hai ñối chứng âm (negative control) bao gồm nước và DNA chiết suất từ mẫu cây mía khỏe ñược sử dụng trong các lần PCR ðiện di 10µl từ mỗi phản ứng Nested-PCR bằng 1% (w/v) agarose gel trong dung dịch 1×TAE, nhuộm bằng dung dịch

chứa ethidium bromide (0,5 µg/ml), và chụp ảnh DNA bằng máy GelDoc-ItTM

310 Imaging System (UK)

2.3.2.4 Chạy ñiện di trên gel agarose ñể kiểm tra sản phẩm PCR

Quá trình này ñược tiến hành theo các bước như sau:

- Pha 1 lít dung dịch ñệm ñiện di TAE 1X từ dung dịch TAE 50X ñã ñược pha sẵn từ trước: lấy 20ml TAE 50X cho vào cốc ñong, bổ sung thêm 980ml nước

cất, lắc ñều

- Chuẩn bị bản gel: Cân 01gram agarose cho vào bình tam giác, bổ sung 100ml TAE 1X vào, cho vào lò vi sóng quay sôi ñể hòa tan agarose hoàn toàn

- ðặt lược tạo lỗ khuôn: Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 500C thì

ñổ vào khuôn dày khoảng ½ chiều dài lược ðể khuôn ở nhiệt ñộ phòng ñến khi agarose ñông Sau khoảng 30 phút thì tiến hành rút lược

- ðặt cả khay khuôn gel vào bể ñiện di, bổ sung dịch ñệm TAE 1X phủ ngập gel khoảng 1mm

- Nhỏ mẫu vào giếng: Dùng pipet hút 10µl sản phẩm PCR ñã nhân gen trộn với 2µl dung dịch nhuộm màu Loadding dye rồi hút cho vào 1 giếng Ngoài các mẫu PCR còn nhỏ thêm một giếng DNA Marker làm thước chuẩn ñể so sánh

- Cắm nguồn ñiện cho máy ñiện di, ñạt hiệu ñiện thế 100V trong khoảng 30 phút Sau ñó tắt máy ñiện di, ñặt bản gel lên máy phát tia UV, quan sát kết quả

và chụp ảnh bằng hệ thống máy chụp ảnh Geldoc-ItTM Imaging System

2.3.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen

Tinh chiết sản phẩm PCR trên bản ñiện di agarose gel dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, các bước tiến hành bao gồm: