Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển việt nam

Tổng quan về kỹ thuật FISH: khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH; tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam; các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang t

Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify quickly some

marine toxic algae species in Vietnam

Luu Xuan Hoa

Hanoi University of Science,VNU; Faculty of Biology

Major: Genetics; Code: 60 42 70 Supervisors: Ass Prof Dr Dinh Doan Long

Date of Presenting Thesis: 2011

Abstract Tổng quan về kỹ thuật FISH: khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

(FISH); tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam; các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ FISH; đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu Nghiên cứu về vật liệu và phương pháp nghiên cứu: địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu; phương pháp thu và lưu giữ mẫu; phương pháp phân loại hình thái; phương pháp kiểm tra phân loại bằng AND và thiết kế đầu dò; phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ Trình bày các kết quả nghiên cứu: kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái; ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu; kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu; tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò

Keywords Di truyền học; Kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang; Tảo độc; Biển

Content

MỞ ĐẦU

Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung và vi tảo biển độc hại nói riêng, nhiều nhóm loài sinh vật rất khó hoặc hoàn toàn không thể phân loại đến loài nếu chỉ bằng phương pháp so sánh hình thái Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình thái bên ngoài và khó nhận biết những đặc điểm khác nhau của chúng rất dễ dẫn đến nhầm lẫn trong nghiên cứu phân loại Cùng với số lượng loài rất lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển trong nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian Những điều này đã gây cản trở đối với công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá và quản

lý nguồn lợi sinh vật biển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm loài nói riêng

Kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền tảng của

kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence

in situ hydridization - FISH) đã được phát triển Kể từ khi ra đời, nó đã trở thành một công cụ

mạnh trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà

cả trong các nghiên cứu về sinh thái học, môi trường, trong chẩn đoán và nghiên cứu phát sinh loài Kỹ thuật FISH ra đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh vật Các trở ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời

gian phân tích kéo dài, các yêu cầu đòi hỏi về lượng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc loài… có thể được khắc phục bằng kỹ thuật FISH Bên cạnh đó, bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định tính mà còn có thể định lượng chính xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường của các vi sinh vật Kỹ thuật FISH đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du trong môi trường biển nói chung và các loài tảo độc hại nói riêng

Nhằm từng bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải quyết những khó khăn trong phân loại

các loài vi tảo độc hại biển, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh

quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển Việt Nam” Kết quả mong

đợi của đề tài sẽ giúp cho việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc biến động các loài vi tảo độc hại, cảnh báo các hiện tượng ô nhiễm môi trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh

chóng và hiệu quả hơn

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT FISH

1.1 Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH

Sự ra đời của kỹ thuật FISH dựa trên các cải tiến của kỹ thuật ISH đã ra đời và là sự kết hợp chính xác của phép lai một đoạn oligonucleotit (đầu dò) có gắn tín hiệu huỳnh quang với một trình tự ADN đích đặc trưng Bằng quan sát trực quan từ kính hiển vi huỳnh quang, các phân tử huỳnh quang phát sáng với những màu sinh động cho phép hiển thị các đoạn ADN, nhiễm sắc thể hay tế bào đích Nhờ đó mà các nhà nghiên cứu có thể nhận dạng, liệt kê và định

vị các tế bào sinh vật trong mẫu môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh phẩm

Quy trình này bao gồm các bước cơ bản sau:

- Bước 1: Chuẩn bị mẫu và đầu dò có trình tự nucleotit bổ sung đặc hiệu với trình tự đặc hiệu

cần nhận biết

- Bước 2: Cố định mẫu nghiên cứu

- Bước 3: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu

- Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai (đầu dò tự do)

- Bước 5: Hiển thị, quan sát và phân tích kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang

1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam

Cho đến nay, tại Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y học Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật FISH đã được tiến hành Các nghiên cứu này được dựa trên các trình tự ADN đích thuộc các nhiễm sắc thể nhằm phát hiện một cách chính xác các bất thường trên các nhiễm sắc thể (NST) tương ứng với các bệnh di truyền được quan tâm (Đặng Thị Hồng Nhung và cộng sự, 2008) Trong một

số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang được dùng để chẩn đoán trước sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cũng đã cho kết quả thành công Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đã cho kết quả rất chính xác khi

so sánh với phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối (Trần Thị Thu Hương và cộng

sự, 2005; 2006) Bên cạnh đó, các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong việc phát hiện các lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ cũng đã thành công Trên cơ sở phân tích các mẫu thu từ các phụ nữ mang thai giai đoạn

17 - 25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật, kỹ thuật FISH đã giúp phát hiện 1 trường hợp mắc hội chứng Patau (trisomy 13), 1 trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), 1 trường hợp bất thường cánh dài của NST 16 Kết quả cũng cho thấy 100% mẫu kết quả FISH phù hợp với kết quả phân tích về NST liên quan đến các NST số 13, 18, 21, X, Y Quy trình chuẩn nhằm chẩn đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn cũng đã được hoàn thiện (Nguyễn Thị Tân Sinh và cộng sự, 2011) Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện sự khuếch đại gen NMYC trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đã được tiến hành tại các bệnh viện Nhi

trung ương và cho kết quả tốt đẹp Một số biến đổi di truyền trong u nguyên bào thần kinh có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch đại gen NMYC được xem là yếu tố quan trọng nhất đã được tìm thấy Kết quả thành công này

có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ các bác sỹ lâm sàng trong việc phân nhóm bệnh nhân và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp (Vũ Đình Quang và cộng sự, 2010)

Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH đối với các loài sinh vật thủy sinh tại Việt Nam gần như rất ít Trong một nghiên cứu gần đây tại Viện nghiên cứu hải

sản về ứng dụng kỹ thuật FISH cho việc nhận diện nhanh 2 loài tảo giáp độc hại A tamarense

và A catenella, một số thử nghiệm đã được tiến hành Các trình tự đích thuộc vùng D1- D2

trên nhiễm sắc thể mã hóa cho tiều phần lớn LSU của ribosome của loài được lấy làm cơ sở thiết kế đầu dò Tín hiệu huỳnh quang FITC được thiết kế gắn với đầu dò đặc hiệu Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các trùng lặp, giống nhau về đặc điểm hình thái của các loài tảo giáp từng gây khó khăn trong quan trắc tảo độc hại đã phần nào được giải quyết nhờ kỹ thuật FISH Đây cũng là một trong những cơ sở ban đầu cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong quan trắc cảnh báo về sự bùng phát các đối tượng thủy sinh gây thủy triều đỏ tại Việt Nam (Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự, 2011)

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu

Hai mẫu tảo độc hại được thu tại vùng biển Cát Bà – Hải Phòng, gồm có:

+ Mẫu A sp6 (Alexandrium affine) được thu vào ngày 20/7/2010 tại khu vực cửa biển

thuộc Bến Bèo (Cát Bà, Hải Phòng) với điều kiện môi trường như sau: độ mặn nước biển: 27‰, pH 7,72

+ Mẫu A sp7 (Alexandrium pseudogonyaulax) được thu vào ngày 27/4/2011 tại khu

vực vịnh cảng Cát Bà (Hải Phòng) với các điều kiện môi trường nước biển như sau: độ mặn nước biển: 29‰, pH 7,44

2.2 Phương pháp thu và lưu giữ mẫu

Mẫu được thu bằng lưới thu thực vật phù du có đường kính 20cm, kích thước mắt lưới 20µm, thu theo phương thẳng đứng Mẫu sau đó được bảo quản trong lọ và giữ trong điều kiện nhiệt độ từ 4 – 15oC Mẫu này sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập (Hallegraeff và cộng sự, 1995; Anderson, 1995)

2.3 Phân lập các chủng vi tảo

Theo phương pháp thu tế bào đơn lẻ bằng micropipet của Richmon (2004) và Andersen (2005): Môi trường nuôi được sử dụng là môi trường IMK (Daigo IMK – mua từ hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) dành cho nhóm tảo giáp (Alexandrium)

2.4 Phương pháp nuôi giữ các chủng vi tảo biển

Theo Shoko và cộng sự (2005); Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự (2011):

- Cường độ chiếu sáng: 2.500 lux, bằng hệ thống ánh sáng trắng (đèn neon);

- Chế độ chiếu sáng: 13h sáng liên tục/11h tối liên tục, được điều khiển bởi đồng hồ đóng

ngắt tự động;

- Nhiệt độ nuôi: ổn định ở 24oC liên tục trong buồng có điều hòa nhiệt độ;

- Môi trường nuôi: IMK

2.5 Phương pháp phân loại hình thái

Phân loại các mẫu tảo giáp được thực hiện chủ yếu dựa vào công thức tấm vỏ tế bào đã được nhuộm Calco - fluor, quan sát dưới kính hiển vi quang học Các tài liệu chính để phân loại là: Balech (1995), Abe (1967a,b), Larsen và cộng sự (2004)

2.6 Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn cho PCR

Các ống mẫu chứa tế bào được sốc nhiệt qua lại 3 lần giữa -20oC và 90oC trong thời gian mỗi 20 giây ở mỗi điều kiện, nhằm làm vỡ tế bào và dung giải ADN ra ngoài Các mẫu được lắc rung (votex) và ly tâm trở lại (5.000vòng/phút) chuẩn bị cho phản ứng PCR (Sebastián

và cộng sự (2001)

2.7 Phương pháp Singel cell PCR

Theo Sebastián và cộng sự (2001); Shoko và cộng sự (2005): Phản ứng PCR được tiến hành 2 lần để nhân vùng D1 – D2 của gen mã hóa tiểu đơn vị lớn 28s ARN ribosome Cặp mồi dùng cho PCR lần 1: S1R TACCTGG TTGATCCTG CCAG-3’) và 28-1483R GCTACTACCACCAAGATCTGC-3’) Cặp mồi dùng cho PCR lần 2 là: D1R (5’-ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3’) và D2C (5’-CCTT GGTCCGTTTCAAGA-3’)

2.8 Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN

Giải trình tự ADN vùng D1-D2 trên máy Applied Biosystems 3130 Series Xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp kết nối lân cận (neighbor joining) sử dụng thuật toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1000 lần Cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phần mềm Mega phiên bản 5.03

2.9 Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu

Sử dụng công cụ ClustalW, phần mềm BioEdit để sắp xếp, so sánh các trình tự nucleotit thu được với trình tự của những loài gần gũi về mặt phân loại Trên cơ sở đó, lựa chọn đoạn ADN đặc trưng nhất cho loài để thiết kế đầu dò Đầu dò được chế tạo với yêu cầu gắn thêm chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC) ở đầu 5’ hiển thị sự hiện diện của trình tự đặc trưng

2.10 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (dựa theo phương pháp của Shoko và cộng sự

(2005)):

 Mẫu được đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút ở 4o

C)

 Cố định tế bào bằng 1ml dung dịch PBS (5x) Ly tâm thu mẫu và loại nước trong mẫu lần lượt bằng dung dịch ethanol 50% và 80% Ly tâm thu tế bào, lai với đầu dò trong dung dịch Formamide (40%), SSC (5x) ở các thang nhiệt độ khác nhau: 37°C, 40°C, 43°C, 46°C, 49°C, 52°C trong 5 phút

- Mẫu được rửa 2 lần trong SSC (5x)

Tế bào lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái

Trên cơ sở các mẫu thu được từ vùng biển Cát Bà, 2 chủng vi tảo độc hại đã được phân lập, nuôi giữ và phân loại sơ bộ dựa trên các đặc điểm về hình thái Hai loài tảo giáp được xác định sơ bộ là thuộc chi Alexandrium bao gồm:

3.1.1 Loài Alexandrium affine

Hình dạng ngoài của tế bào (A); Tấm

1' với lỗ bụng và tổ hợp lỗ đỉnh (B, C); Tấm

S.a hình thang, không có phần phụ (D)

3.1.2 Loài A pseudogonyaulax

3.2 Ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu

Trong điều kiện nuôi có độ mặn 30‰ (cường độ chiếu sáng 2500lux, chế độ chiếu sáng

13 giờ sáng: 11 giờ tối) loài A affine phát triển tốt nhất trong các chế độ nuôi cấy Đối với loài

A pseudogonyaulax, kết quả thí nghiệm cho thấy, điều kiện về độ mặn thuận lợi nhất cho sự

sinh trưởng và phát triển của chúng với những điều kiện phòng thí nghiệm như đã nêu trên là ở 29‰

3.3 Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu

Ở mỗi mẫu thí nghiệm, đoạn mồi D1R, D2C đã nhân được một đoạn ADN duy nhất có

kích thước tương ứng với đoạn dự kiến Vùng D1-D2 của mẫu L3 (xác định hình thái là A

affine) có kích thước gồm 651bp Đối với mẫu L4 (xác định hình thái là A pseudogonyaulax),

vùng D1-D2 có trình tự bao gồm 650 bp Kết quả phân tích BLAST 2 trình tự nói trên cũng đã

khẳng định hai loài này là A affine và A pseudogonyaulax

3.4 Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ

Phần mềm Bioedit được sử dụng để sắp xếp, so sánh với các trình tự tham khảo (từ NBCI) tại vùng tương đồng D1 - D2 của các loài thuộc chi Alexandrium Những khác biệt từ các trình tự bảo thủ này so với các loài khác là cơ sở cho việc chọn lọc trình tự phù hợp để thiết

kế đầu dò đặc hiệu cho từng loài Kết quả sắp xếp và so sánh đối với loài A affine tìm ra trình

tự nucleotit từ vị trí 657 đến 676 phù hợp để thiết kế đầu dò Trình tự đầu dò cho loài A affine

được xác định là: 5’-TGTAAGCTCTAGTAGGGTAG-3’ Tương tự như vậy, các kết quả so

sánh đối với trình tự đoạn D1 – D2 của loài A pseudogonyaulax cũng tìm được trình tự 774

đến 794 phù hợp cho thiết kế đầu dò đặc trưng cho loài này Trình tự đầu dò được xác định là: 5’-ACAGCTGACAATCGCAA TTG-3’

Các trình tự này sau đó được đặt sản xuất bởi công ty TOS (Nhật Bản) với điều kiện có gắn tín hiệu Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC) vào đầu 5’ để phục vụ cho các thí nghiệm lai huỳnh quang tiếp theo

3.5 Tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò

Trên cơ sở đầu dò thiết kế được, các thí nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ kiểm tra cho 2

loài A affine và A pseudogonyaulax đã được tiến hành Kết quả thử nghiệm cho thấy, có sự

tương đối giống nhau về nhiệt độ lai lai đối với cả 2 đầu dò trên hai đối tượng vi tảo

Tấm 1’ hình 5 cạnh, không liên kết

với lỗ bụng và có 1 lỗ bụng lớn tròn tiếp

giáp với mép; ở một vài tế bào, lỗ bụng ở vị

trí tiếp giáp của các tấm 1’-4’6”

3.6 Thử nghiệm đầu dò với các mẫu vi tảo thu ngoài tự nhiên

Nhằm hoàn thiện ứng dụng kỹ thuật này, thử nghiệm lai huỳnh quang với các mẫu thu ngoài tự nhiên đã được tiến hành với nhiệt độ lai ở 43°C Kết quả cho thấy, trong số 32 mẫu thu

từ biển Cát Bà, đầu dò cho loài A affine đã phát hiện ra 17 mẫu có sự hiện diện của loài này

với mật độ tế bào khác nhau (Hình 3.11) Trong 15 mẫu còn lại, đầu dò không tìm được trình tự đích nào Trong khi đó, một số phân tích thành phần của mẫu thì chỉ thu được rất ít thành phần loài của nhóm Alexandrium

Quy trình lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) sử dụng đầu dò rARN có gắn tín hiệu FITC

đối với hai loài A affine và A pseudogonyaulax được tổng hợp lại và đề nghị như sau:

 Mẫu (5000-7000 tế bào/ml) được đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4o

C)

 Cố định tế bào bằng 1ml dung dịch PBS (5x) có chứa paraformandehyde (4%), để mẫu trên đá lạnh trong 5 phút

 Ly tâm mẫu 3000vòng/phút trong 1 phút (4o

C)

 Loại nước trong mẫu theo 2 bước:

Đối với loài A affine, nhiệt độ

lai phù hợp là 40°C và 43°C Trong đó,

tín hiệu huỳnh quang thu được rõ nét

nhất ở tại 43°C

Tương tự đối với loài A

pseudogonyaulax, kết quả thử nghiệm

cũng đã cho thấy, đối với mẫu được lai

ở nhiệt độ 43°C cho kết quả tốt nhất,

hình ảnh sắc nét

Lai đầu dò A affine với

mẫu tự nhiên Các mũi tên chỉ

các tế bào A affine dưới ánh

sáng thường (trái) và được

phát hiện với màu xanh đặc

trưng (phải)

Lai đầu dò A

pseudogonyaulax với mẫu tự

nhiên Các mũi tên chỉ các tế

bào A pseudogonyaulax dưới

ánh sáng thường (trái)

và được phát hiện với màu

xanh đặc trưng (phải)

- Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

- Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

 Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh quang (50 pmol))

 Lai tế bào ở 43°C trong 5 phút

 Sau khi lai, mẫu được rửa 2 lần:

- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

Sản phẩm lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang (ECLIPSE E800, Nikon, Tokyo, Japan) với kính lọc sắc B-2A, bước sóng kích thích tín hiệu FITC 490 nm, hiển thị và chụp ảnh tế bào bằng camera DS Nikon Tổng thời gian thao tác cho quá trình này đã được tính toán là khoảng 2,5 giờ Điều này cho phép các thí nghiệm nghiên cứu phát hiện các loài vi tảo biển độc hại chính xác, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp phân tích truyền thống bằng hình thái trước đây

KẾT LUẬN

Chúng tôi đã rút ra được một số kết luận chính sau từ nghiên cứu này:

1 Đã xác định trình tự gen vùng mã hóa cho đoạn D1 – D2 của tiểu phần lớn (LSU) thuộc

ribosome của hai loài tảo giáp độc hại A affine và A pseudogonyaulax biển Việt Nam

2 Đã thiết kế và thử nghiệm thành công hai đầu dò phân tử gắn tín hiệu huỳnh quang

FITC phục vụ cho ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đối với hai loài tảo độc A

affine và A pseudogonyaulax biển Việt Nam Các đầu dò hoạt động tốt trên cả mẫu nuôi

cấy và mẫu thu ngoài tự nhiên và các đầu dò đảm bảo tính đặc hiệu của loài

3 Đã ứng dụng thành công kỹ thuật FISH trong việc xác định nhanh chóng và chính xác 2 loài tảo độc hại biển Việt Nam nói trên, làm cơ sở cho việc ứng dụng phương pháp quan trắc, đánh giá nhanh môi trường biển, nghiên cứu dự đoán diễn biến thủy triều đỏ tại các vùng ven biển Việt Nam sau này

KIẾN NGHỊ

Cần nghiên cứu và thiết kế thêm các đầu dò nhằm ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang

để nhận diện nhanh, nhiều loài tảo biển độc hại khác trong các vùng biển và ven biển Việt Nam

Cần có các nghiên cứu, ứng dụng các kỹ thuật di truyền trong việc quan trắc, phân loại nhanh đối với các loài vi tảo biển Việt Nam nhằm có thể theo dõi thường xuyên, đánh giá nhanh những biến đổi môi trường gây thủy triều đỏ do tảo biển độc hại gây ra, hạn chế thiệt hại trong nuôi trồng thủy sản ven biển

References

Tài liệu tiếng Việt

1 Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường (2005), “Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để chẩn đoán trước sinh hội chứng down”, Tạp chí y học thực hành, 11, tr 9-11

2 Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường, Nguyễn Thị Quỳnh Thơ (2006), “Chẩn đoán trước sinh hội chứng Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối”, Tạp chí nghiên cứu y học, 1, tr 4-8

3 Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh Thái Bình (2011), “Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh và chuẩn xác một số loài tảo giáp độc hại”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ V, Quyển 4 - Sinh học và nguồn lợi biển, tr 261-268

4 Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc (2008), “Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang tại chỗ trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57, tr 57-62

5 Vũ Đình Quang, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai, Đinh Thị Hồng Nhung, Phùng Tuyết Lan, Trần Đức Hậu, Trần Ngọc Sơn, Nguyễn Thanh Liêm (2010), “Đánh giá sự khuếch đại gen NMYC trên bệnh nhân Neuroblastoma”, Tạp chí Nhi khoa, 3 (3), tr 358-363

6 Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, tháng

2, tr 253-258

7 Chu Văn Thuộc (2002), “Nghiên cứu thành phần loài, phân bố và thăm dò khả năng gây hại của một số loài tảo độc hại (harmful algae) thuộc ngành tảo giáp (Dinophyta) ở vùng cửa sông, ven biển miền Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sĩ ngành sinh học, Viện nghiên cứu hải sản

Tài liệu tiếng Anh

8 Abé, T H (1967a), “The armoured Dinoflagellata: II Prorocentridae and Dinophysidae (A)”, Publ Seto Mar Biol., 14(5), pp 369 - 389

9 Abé, T H (1967b), “The armoured Dinoflagellata: II Prorocentridae and Dinophysidae (B), Dinophysis and its allied genera”, Publ Seto Mar Biol., 15(1), pp 37 - 78

10 Adachi M., Sako Y., Ishida Y (1996), “Analysis of Alexandrium (Dinophyceae) species using sequences of the 5,8S ribosomal DNA and internal transcribed spacer regions” J Phycol,

32, pp 424–432

11 Alfreider A., Pernthaler J., Amann R., Sattler B., Glöckner F O., Wille A., and Psenner R (1996), “Community analysis of the bacterial assemblages in he winter cover and pelagic layers

of a high mountain lake by in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol, 62, pp: 2138 -

2144

12 Amann R., Fuchs B M., Beherens S (2001), “The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridization”, Curr Opin Biotechnol., 12, pp 231 – 236

13 Andersen, G (2005), “Traditional Microalgae Isolation Techniques, Algal cuturing techniques”, Phycologycal society of America, 578p

14 Anderson, P (1996), “Design and implementation of some harmful agal monitoring system”, IOC Technical Series, 44, UNESCO

15 Anderson, D.M (1995), “Identification of harmful algal species using molecular probes, an emerging technology”, Harmful Marine Algal Blooms, Lavoiser Science Publishers, pp 3–13

16 Balech, I (1995), “The genus Alexandrium Halim (Dinoflagellata)”, Trans Am Microscop Soc., 113, pp 216 - 220

17 Baoyu Z., Guofu C., Guangce W., Douding L (2010), “Identification of two Skeletonema costatum-like diatoms by fluorescence in situ hybridization” Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 28(2), pp 310 - 314

18 Benedetta B., Danilo E., Monica G., Erasmo N (2006), “Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects”, Appl Microbiol Biotechnol., 73, pp

485 – 494

19 Bouvier T., Del G (2003), “Factors influencing the detection of bacterial cells using fluorescence in situ hybridization (FISH)”, FEMS Microbiol Ecol., 44, pp 3 – 15

20 Cho E S., Hur H J., Byun H S., Lee S G., Rhodes L L., Jeong C S and Park J G.(2002), “Monthly monitoring of domoic acid producer Pseudo-nitzschia multiseries (Hasle) Hasle using species-specific DNA probes and WGA lectins and abundance of Pseudo-nitzschia species (Bacillariophyceae) from Chinhae Bay”, Korea Bot Mar., 45, pp 364 - 372

21 Choi, B K (1994), “Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructive periodontitis” Infect Immun., 62, pp 1889 – 1895

22 Choong J K., Yoshihiko S (2005), “Molecular identification of toxic Alexandrium tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes”, Harmful Algae, 4, pp 984 - 991

23 Deere, D (1998), “Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization”, Lett Appl Microbiol., 27, pp 352 – 356

24 DeLong, E F (1989), “Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells”, Science, 243, pp 1360 –1363

25 DeLong E F., Taylor L T., Marsh T L and Preston C M (1999), “Visualization and enumeration of mMarine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp 5554

- 5563

26 Felske, A (1998), “In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in dutch grassland soils”, Appl Environ Microbiol., 64, pp 4588 – 4590

27 Fuchs B M., Syutsubo K., Ludwig W., Amann R (2000), “In situ accessibility of Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes”, Appl Environ Microbiol., 67, pp 961 – 968

28 Gersdorf H (1993a), “Identification of bacteroides forsythus in subgingival plaque from patients with advanced periodontitis”, J Clin Microbiol., 31, pp 941 – 946

29 Gersdorf, H (1993b), “Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gram-negative an aerobes in subgingival plaque samples”, FEMS Immunol Med Microbiol., 6, pp

109 – 114

30 Glockner, F O (1996), “An in situ hybridization protocol for detection and identification

of planctonic bacteria”, Syst Appl Microbiol., 19, pp 403 – 406

31 Glöckner F O., Fuchs B M and Amann R (1999), “Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 65, pp 3721 - 3726.Hallegraeff G M., Anderson D M., Cembella A D., Enevoldsen H O (1995), “Manual on harmful marine microalgae, IOC Manual and Guides”, UNESCO, 33, 794p

33 Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J Clin Microbiol., 38, pp

818 – 825

34 Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J Clin Microbiol 38, pp

818 – 825

35 Hougaard D M., Hansen H and Larsson L I (1997), “Non-radioactive in situ hybridization for mRNA with emphasis on the use of oligodeoxynucleotide probes”, Histochem Cell Biol., 108, pp 335 - 344

36 Inacio J., Beherens S., Fuchs B M., Fonseca A., Spencer M I., Amann R (2003), “In situ accessibility of Saccharomyces cerevisiae 26S rRNA to Cy3-labeled oligonucleotide probes comprising the D1 and D2 domains”, Appl Environ Microbiol., 69, pp 2899 – 2905

37 Jansen, G J (2000), “Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes”, J Clin Microbiol., 38, pp 814 – 817

38 Jeffrey M L and Robert H S (2003), “Fluorescence in situ hybridization: past, present and future”, Journal of Cell Science, 116, pp 2833 – 2838

39 Johannes Z., Wolfgang L., Karl H S (2001), “DNA polynucleotide probes generated from representatives of the genus acinetobacter and their application in fluorescence in situ hybridization of environmental samples”, System Appl Microbiol., 24, pp 238 – 244

40 Kagiyama, N (1993), “A novel fluorescent method for in situ hybridization”, Acta Histochem Cytochem., 26, pp 441 – 445

41 Kempf, V A (2000), “Fluorescent in situ hybridization allows rapid identification of microorganisms in blood cultures”, J Clin Microbiol., 38, pp 830 – 838

42 Kenzaka, T (1998), “rRNA targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterial community structure in river water”, Microbiology, 144, pp 2085 – 2093

43 Kim C J., Kim C H., Sako Y (2005), “Development of molecular identification method for genus Alexandrium (Dinophyceae) using whole-cell FISH”, Marine Biotechnology, 7, pp

215 – 222

44 Langendijk P S, Schut F., Jansen G J., Raangs G C., Kamphuis G R., Wilkinson M H F., Welling G W (1995), “Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifidobacterium spp with genus-specific 16S rRNA-targeted probes and its application in faecal samples”, Appl Environ Microbiol., 61, pp 3069 – 3075

45 Larsen J and Nguyen N L (2004), “Potentially toxic microalgae of Vietnamese waters”, Opera Botanica, 140, 216p

46 Llobet B., Rosselló M., and Amann R (1998), “Microbial community composition of wadden sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 64, pp 2691 - 2696

47 Manuelidis L., Langer P R and Ward D C (1982), “High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes”, J Cell Biol., 95, pp 619 - 625

48 Michael H., Ralph W., Georg H., Jutta F., Andrea W., Alexander R., Eberhard S., Siegfried J., Christoph C (2003), “COMBO-FISH: specific labeling of nondenatured chromatin targets

by computer-selected DNA oligonucleotide probe combinations”, BioTechniques, 35(3), pp

564 – 577

49 Miller P E., Scholin C A (2000), “On detection of Pseudo-nitzschia

(Bacillariophyceae) species using whole cell hybridization: sample fixation and stability”, J Phycol., 36, pp 238 – 250

50 Miller P E., Scholin C A (1996), “Identification of cultured Pseudonitzschia (Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNAtargeted fluorescent probes”, J Phycol.,

32, pp 646 – 655

51 Miller P E., Scholin C A (1998), “Identification and enumeration of cultured and wild Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNA-targeted fluorescent probes and filter-based whole cell hybridization”, J Phycol., 34, pp 371 – 382

52 Moter, A (1998), “Molecular epidemiology of oral treponemes associated with periodontal disease”, J Clin Microbiol., 36, pp 1399 – 1403

53 Niels B R., Henrik F., Timothy G F., Finn A., Bo T (1996), “Distribution of bacterial populations in a stratified fjord (Mariager Fjord, Denmark) quantified by in situ hybridization and related to chemical gradients in the water column”, Appl Environ Microbiol., 62, pp 1391 – 1404

54 Pardue, M L (1969), “Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations”, Proc Natl Acad Sci., 64, pp 600 –604

55 Pernthaler J., Glöckner F O., Schönhuber W., and Amann R (2001), “Fluorescence in situ hybridization (FISH) with rRNA-targeted oligonucleotide probes”, Methods in Microbiology: Marine Microbiology, 30, pp 207 – 210